TEMA 5- TÉCNICAS DE

HIBRIDACIÓN
Las técnicas de hibridación se pueden clasificar tomando como criterio el medio o
soporte en el que se llevan a cabo. A partir de este criterio podemos diferenciar 3
grupos de técnicas: en soporte sólido, en medio líquido e in situ.

5.2. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO

Las técnicas de hibridación en soporte sólido se caracterizan porque una de las 2
moléculas implicadas, la secuencia diana o la sonda, previamente a la hibridación se
inmoviliza sobre un soporte sólido.
Lo habitual es fijar al soporte la muestra con la secuencia diana e incubar
posteriormente con la sonda marcada para formar el híbrido (técnicas de dot blot,
southern blot y northern blot). En otras ocasiones se obtiene más información fijando
al soporte la sonda e incubando posteriormente con el ácido nucleico que se estudia,
previamente marcado.

5.2.1. DOT BLOT

El dot blot es una técnica de hibridación simple que utiliza membranas de nitrocelulosa
o nailon como soporte sólido y permite detectar secuencias de ácidos nucleicos, ADN o
ARN, en una mezcla compleja.
Sobre las membranas de nitrocelulosa o de nailon se coloca directamente una gota de
la muestra que se va a analizar, que puede ser un ácido nucleico purificado, un lisado
celular, etc.
Permite el estudio simultáneo de varias muestras, aplicando cada muestra en una zona
distinta de la membrana y se puede realizar con sondas radiactivas o con sondas
marcadas con haptenos. Si las aplicaciones se realizan en forma de banda en lugar de
en forma circular, la técnica se denomina slot blot. La técnica se lleva a cabo incubando
secuencialmente las membranas con los reactivos por inmersión en cubetas, en bolsas
de plástico termosellables o con cierre hermético o en frascos con tapón de rosca.

PROTOCOLO DEL DOT BLOT

 I. Aplicación de la muestra al soporte: hay que humedecer la membrana que
actúa como soporte sólido mediante inmersión durante 10 minutos en un
tampón adecuado o en agua destilada, según el tipo de membrana. Cuando
haya pasado el tiempo se saca del líquido humectante y se retira el exceso de
este. Una vez humedecida la membrana, se ensambla en un sistema de vacío
que es el que va a permitir que se consiga una buena fijación de la muestra a la
membrana. El proceso de aplicación de la muestra varía para ADN y ARN.
  II. Prehibridación: las membranas con las muestras se incuban con una solución
de prehibridación para bloquear las posibles uniones inespecíficas de la sonda a
la membrana. Las soluciones de prehibridación suelen tener la misma
composición que las soluciones de hibridación, pero sin sonda. La membrana se
incuba con esta solución a la misma temperatura a la que se realiza
posteriormente la hibridación (65-68 ºC).

 III. Hibridación: las sondas de ADN bicatenario se desnaturalizan

inmediatamente antes de su uso, mediante calentamiento y enfriamiento
rápido en hielo. Se retira la solución de prehibridación del contenedor y se
sustituye por un volumen igual de solución fresca a la que se añade la sonda
recién desnaturalizada. La membrana se incuba con esta solución a la
temperatura adecuada, en agitación, durante 4-24 horas.

 IV. Lavado posthibridación: si las 2 fases anteriores se han llevado a cabo en la

bolsa, se saca la membrana de la bolsa y se coloca en una cubeta para proceder
a los lavados de posthibridación en agitación. Lo habitual es hacer 2 o 3
lavados.

 V. Detección del híbrido: se procederá según el tipo de marcaje que lleve la

sonda:

o Marcado radiactivo: se seca y se revela colocando una placa

radiográfica encima y manteniendo en la oscuridad. Al revelar la placa,
aparecerán puntos negros en las posiciones correspondientes a las
muestras positivas, es decir, aquellas que contenían la secuencia diana.
o Marcado con haptenos: método de detección cromogénico. El resultado
final es una mancha coloreada en las posiciones correspondientes a las
muestras positivas.
 VI. Rehibridación: cuando se usan sondas radiactivas, las membranas pueden
someterse a nuevas rehibridaciones con otras sonadas. Para ello hay que
desnaturalizar los híbridos formados y eliminar la primera sonda utilizada. Es
fundamental que la membrana permanezca siempre húmeda y no se seque la
autorradiografía.

APLICACIONES DEL DOT BLOT

El dot blot se puede utilizar como técnica de rastreo o screening para detectar
secuencias de interés en múltiples muestras simultáneamente. Estas son: ASO dot blot,
dot blot inverso, hibridaciones de colonias e hibridación de placas virales.

 ASO dot blot: se usa para detectar mutaciones mediante el empleo de

oligonucleótidos específicos de alelo, ASO.
  Dot blot inverso: tiene el mismo fundamento que el ASO dot blot. En esta
técnica lo que se inmoviliza en la membrana son los distintos oligonucleótidos
específicos de alelo (normales y mutados) sin marcar, y permite estudiar genes
con un gran número de variantes alélicas.

 Hibridación de colonias: se utiliza para detectar bacterias que portan una

secuencia genética concreta.

 Hibridación de placas virales: la hibridación de placas virales o plaque lift es un

tipo de dot blot en el que se detectan virus que portan la secuencia diana.

5.2.2. SOUTHERN BLOT

El southern blot es una técnica de hibridación que permite identificar fragmentos de
ADN separados por electroforesis en gel y transferidos a una membrana de
nitrocelulosa o nailon. Permite la detección simultanea de varias secuencias diana de
distintos tamaños con una única hibridación.

PROTOCOLO DEL SOUTHERN BLOT

 I. Digestión enzimática: se realiza con una o varias enzimas de restricción. Su
objetivo es trocear el ADN de partida en fragmentos de diferentes tamaños.
 II. Electroforesis en gel: en el gel se puede incorporar un agente intercalante
fluorescente, lo que permite fotografiarlo inmediatamente después de terminar
la electroforesis. Esta fotografía permitirá comparar el patrón de bandas de
ADN obtenido tras la digestión con el resultado de la hibridación.
 III. Transferencia del ADN a la membrana: se obtiene una replica exacta del
patrón de bandas de ADN en el gel sobre una membrana de nitrocelulosa o
nailon. Los pasos son: desnaturalización del ADN, transferencia a la membrana
y anclaje del ADN a ella.
 IV. Hibridación: incubando la membrana con los distintos reactivos dentro de
una bolsa con cierre hermético se realizan a temperatura adecuada y en
agitación. La hibridación se realiza con la sonda o sondas específicas marcadas y
diluidas en una solución de hibridación adecuada.
 V. Revelado: se realiza mediante autoradiografía con una película de rayos X, de
manera que aparecerá una mancha oscura en los puntos de la membrana en
que se localicen los híbridos sonda/secuencia diana.
Las aplicaciones del southern blot son la elaboración de huellas genéticas, el estudio de
mutaciones estructurales, etc.
5.2.3. NORTHERN BLOT
El northern blot es una técnica de hibridación que permite detectar moléculas de ARN
separadas por electroforesis en gel y transferidas a una membrana de nitrocelulosa o
nailon.

PROTOCOLO DE NORTHERN BLOT

Se parte de ARN purificado y se produce de forma muy parecida a la técnica southern
blot con 3 diferencias principales:

 No se requiere digestión enzimática previa.

 La electroforesis se realiza en condiciones desnaturalizantes.
 No es necesario el paso de desnaturalización antes de la transferencia del gel a
la membrana.
Las aplicaciones del northern blot incluyen el análisis de la expresión génica, la
detección de mutaciones y estudios de corte y empalme o splicing alternativos.

5.2.4. MICROARRAYS
Los microarrays de ADN o biochips son conjuntos o colecciones de fragmentos de ADN
(sondas) distintos fijados a una superficie sólida (vidrio, plástico o silicio).
Las sondas ancladas en el biochip son monocatenarias y no están marcadas. Se marca
con fluorocromos la muestra que se va a estudiar. La lectura del resultado obtenido
tras la hibridación requiere un escáner de lectura.

FABRICACIÓN DE MICROARRAYS
Hay 2 estrategias que son:

 Depositar las sondas, una a una, en posiciones determinadas del soporte sólido.
 Sintetizar las sondas sobre la propia superficie sólida.

PROTOCOLO DE TRABAJO GENÉRICO

 I. Marcaje de la muestra.
 II. Hibridación y lavados de poshibridaciones.
 III. Lectura del microarray.
 IV. Análisis e interpretación de los resultados.

Dentro de las aplicaciones de los microarrays nos encontramos:

 Hibridación genómica comparada en arrays (aCGH): permite detectar e

identificar alteraciones genéticas consistentes en la pérdida (delecciones) o
ganancia de material genético, mediante la comparación del ADN de una
muestra con un ADN de referencia.
  Estudios de expresión génica.

5.3. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO

En las técnicas de hibridación en medio líquido, el híbrido sonda/secuencia diana se
forma en solución, normalmente en pocillos de una placa microtiter, y posteriormente
se fija a la pared del pocillo para proceder a su detección.
No se marcan ni la sonda ni la muestra y el híbrido se detecta por métodos indirectos.
Estas técnicas se han desarrollado fundamentalmente para el diagnóstico
microbiológico y especialmente para la detección de virus. Su realización es similar a
las de los inmunoensayos tipo ELISA que permiten analizar múltiples muestras
simultáneamente y son fácilmente automatizables. Estas son:

 Técnicas de captura de híbrido: la técnica de hibridación de captura de híbrido

se basa en la formación de híbridos ARN/ADN que serán reconocidos o
capturados por anticuerpos específicos.
o Si la secuencia diana es ADN, la sonda será de ARN y viceversa. La
captura del híbrido ADN/ARN se produce mediante anticuerpos
específicos que reconocen estos heterodúplex y que se hayan fijados en
las pareces de pocillos de una placa microtiter.
 Técnica del ADN ramificado: la técnica de ADN ramificado consiste en un
sistema de amplificación de señan, basado en la unión de la secuencia diana a
un macrocomplejo de ADN, de tipo arborescente, mediante sucesivas
hibridaciones. Se diseñó para aumentar la sensibilidad de las técnicas de
captura de híbrido, haciendo posible su cuantificación. Una de sus principales
aplicaciones es la cuantificación de cargas virales en muestras biológicas. Pasos:
o I. Lisis de las partículas víricas y desnaturalización (en los virus ADN).
o II. Hibridación con sondas específicas:
 Sondas para captura: parte de la sonda es complementaria de
una región del ácido nucleico vírico y otra pared es
complementaria de un oligonucleótido de captura fijado a la
pared de un pocillo.
 Sonda de extensión: una parte de la sonda es complementaria
de una región del ácido nucleico vírico y la otra es
complementaria del extremo de un oligonucleótido
preamplificador.
o III. Captura del híbrido.
o IV. Preamplificación.
o V. Amplificación.
o VI. Detección.
o VII. Revelado.
5.4. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN IN SITU
Las técnicas de hibridación in situ (ISH) son las técnicas en las que la hibridación de los
ácidos nucleicos se realiza directamente sobre extensiones citológicas o secciones de
tejido y el resultado obtenido se analiza microscópicamente
Las técnicas de hibridación in situ nos permiten detectar y localizar secuencias de
ácidos nucleicos sobre cromosomas metafásicos, células y tejidos. Dependiendo del
marcador empleado se diferencian 2 tipos de ISH: hibridación in situ fluorescente
(FISH) y la hibridación in situ cromogénica (CISH). Las FISH se marcan con fluorocromos
y las CISH con haptenos.

5.4.1. TIPOS DE MUESTRAS PARA ISH

La secuencia diana se va a localizar en el sitio en el que se encuentran fisiológicamente,
es decir, en los cromosomas o núcleos interfásicos en el caso del ADN y en el
citoplasma en el caso del ARN.

5.4.2. ISH FLUORESCENTE (FISH)

La hibridación in situ fluorescente se basa en el empleo de sondas marcadas con
fluorocromos, que son detectados visualizando las preparaciones con un microscopio
de fluorescencia mediante los filtros adecuados.
Su principal aplicación es la detección de alteraciones cromosómicas tanto numéricas
como estructurales en relación con el diagnóstico y pronóstico de patologías
oncológicas o con base genética. La FISH se realiza en los laboratorios de citogenética
sobre cromosomas en metafases, sobre núcleos interfásicos desnudos o sobre
secciones de tejido congelado. Protocolo:

 I. Hibridación: se realiza directamente sobre la preparación aplicando la sonda

marcada.
 II. Lavado/s posthibridación: se realizan por inmersión de los portaobjetos en
soluciones de lavado colocadas en cubetas Coplin.
 III. Contratinción: se dispensa una solución contratinción sobre el área de
hibridación. La solución de contratinción contiene diamino-fenil-indol (DAPI),
por lo que al excitar la preparación con luz ultravioleta los núcleos muestran
fluorescencia azul.
 IV. Visualización: con un microscopio de fluorescencia. En preparaciones de
metafases, los cromosomas se visualizan en color azul, y las secuencias diana
como puntos o manchas rojas o verdes.

5.4.3. ISH CROMOGÉNICA (CISH)

La hibridación in situ cromogénica (CISH) se caracteriza porque el híbrido se detecta
mediante una reacción inmunohistoquímica que produce un producto coloreado
visible son un microscopio óptico convencional de luz transmitida. Se realiza
principalmente sobre secciones de tejido. Protocolo:

 I. Desparafinado y rehidratación: la inclusión en parafina es un método habitual

de conservación de los tejidos durante periodos muy prolongados.
 II. Digestión enzimática: libera a los ácidos nucleicos de su unión a histonas y
otras proteínas.
 III. Prehibridación: el bloqueo de posibles uniones inespecíficas de la sonda.
 IV. Hibridación: se realiza directamente sobre la preparación, aplicando la sonda
marcada.
 V. Lavado posthibridación: los portaobjetos se lavan por inmersión en
soluciones posthibridación colocadas en cubetas Coplin.
 VI. Detección del híbrido: se elige un método u otro en virtud del marcador
empleado y del tamaño de la sonda.
 VII. Contratinción: tras el revelado del marcaje, en el tejido aparecen manchas
coloreadas en las regiones en que se encuentra la secuencia diana. Sin
embargo, el resto del tejido no es visible al microscopio. Por eso es necesario
contrateñir el tejido con una tinción suave, que no enmascare el resultado de la
ISH.
 VIII. Visualización: con microscopio óptico.