EJERCICOOS TEMA 5 TECNICAS DE HIBRIDACIÓN

1. En tu cuaderno di si son verdaderas o falsas las siguientes

afirmaciones:

a) El dot blot permite detectar secuencias específicas de ADN y ARN y

además aporta información sobre el tamaño de la secuencia diana.
Falso.

b) El Southern blot se utiliza para detectar secuencias de ARN y el

Northern blot para detectar secuencias de ADN.
Falso. Southern blot ADN
Northern blot ARN

c) En el dot blot hay que desnaturalizar la muestra antes de aplicarla a la

membrana.
Verdadero.

d) En las técnicas de hibridación sobre membrana, antes de la

hibridación hay que anclar los ácidos nucleicos de la muestra a la
membrana mediante calor o radiación UV (para membranas de nailon).
Verdadero.

e) En las técnicas de hibridación en membrana, esta se puede rehibridar

varias veces, independientemente del marcador utilizado en las sondas.
Falso

2. A continuación se muestra el resultado obtenido con una técnica

de ASO do t b lo t para estudiar tres variantes alélicas de un gen (normal o
WT, variante 1 o V1 y variante 2 o V2) en diez individuos.

Los individuos 2, 3 y 5 son homocigotos normales (WT).

El individuo 6 es homocigoto para la variante 1.
El individuo 9 es homocigoto para la variante 2.
Los individuos 4, 8 y 10 son heterocigotos para las variantes WT y V1.
El individuo 7 es heterocigoto para las variantes WT y V2.
El individuo 1 es heterocigoto para las variantes V1 y V2

3. A continuación tienes una lista de algunas operaciones que se

ejecutan en las técnicas de S o u t h e r n b lo t y N o r t h e r n b lo t .
Construye en tu cuaderno una tabla como la del ejemplo. Reparte
las operaciones en las tres columnas según sea comunes a las dos
técnicas o exclusivas de cada una Además, ordena las
operaciones de cada columna por el orden en que se ejecutan en
cada técnica.

a) Autorradiografía.
b) Desnaturalización alcalina.
c) Hibridación con sonda marcada.
d) Electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes.
e) Anclaje del ADN/ARN a la membrana mediante calor o UV.
f) Incubación con solución de prehibridación.
g) Digestión enzimática.
h) Transferencia desde el gel a una membrana de nitrocelulosa o nailon.
i) Lavado de poshibridación.
j) Electroforesis en gel en condiciones estándar

S o u t h e r n b lo t Comunes N o r t h e r n b lo t .
Digestión enzimática Transferencia desde Electroforesis en gel en
el gel a condiciones desnaturalizantes
una membrana de
nitrocelulosa o nailon
Electroforesis en Anclaje del ADN/ARN
gel en condiciones a la membrana
estándar mediante calor o UV
Desnaturalización Incubación con
alcalina solución de
prehibridación.
Hibridación con sonda
marcada.
Lavado de
poshibridación.
Autorradiografía.

4. Respecto de la hibridación genómica comparada (CGH), di si son

verdaderas o falsas las siguientes afirmaciones. Razona la
respuesta en el caso de las afirmaciones falsas.

a) En los estudios de CGH se compara el ADN de una muestra problema

con un ADN de referencia.
Verdadera.
 b) La CGH permite detectar todo tipo de anomalías genéticas, tanto
estructurales (traslocaciones e inversiones), como cuantitativas
(deleciones y duplicaciones).
Falsa
. La CGH compara las secuencias de ADN presentes en la muestra problema con las
secuencias presentes en el ADN de referencia y por ello solo permite detectar pérdidas o
ganancias de material genético, es decir, anomalías genéticas cuantitativas (deleciones
y duplicaciones). En el caso de translocaciones o inversiones, las secuencias
implicadas están presentes en el ADN problema en la misma proporción que en el ADN de
referencia, aunque estén en una localización cromosómica diferente, por lo que no pueden
ser detectadas con esta técnica.

c) Para su realización se marcan el ADN problema y el ADN de referencia

con fluorocromos diferentes.
Verdadera.

d) La hibridación se puede realizar sobre cromosomas en metafase o

sobre microarrays.
Verdadera

5. En un estudio de expresión génica sobre un m i c r o a r r a y , el ADNc

de una población de células tumorales se marca con un
fluorocromo verde y un ADNc de una población de células
normales de referencia se marca con un fluorocromo rojo. A
continuación se representan los resultados de fluorescencia
observados en cinco puntos de la matriz del m i c r o a r r a y que
contienen sondas para detectar los ADNc correspondientes a
ARNm específicos de cinco genes concretos (genes 1‐5).Asocia
cada fluorescencia (cada gen) con uno de los grados de expresión
génica relacionados a la derecha (letra) y razona la respuesta

Gen 1 – B. La fluorescencia naranja indica que en ese punto ha

hibridado un número mayor de moléculas del ADNc de referencia (roja)
que del ADNc de la muestra problema (verde), lo que se interpreta como infra
expresión de ese gen en las células tumorales
 Gen 2 – D. La fluorescencia verde indica que en ese punto sólo han
hibridado moléculas del ADNc de la muestra problema, lo que significa
que en las células normales ese gen no se expresa.

Gen 3 – A. La fluorescencia amarilla indica que en ese punto han

hibridado ambos ADNc en la misma proporción, por lo que ese gen se
expresa en las células tumorales de manera normal.

Gen 4 – E. La fluorescencia roja indica que en ese punto sólo han

hibridado moléculas de ADNc de referencia, lo que significa que ese gen está
reprimido (no se expresa) en las células tumorales.

Gen 5 – C. La fluorescencia amarillo‐verdosa indica que en ese punto ha

hibridado un número mayor de moléculas del ADNc de la muestra
problema (verde) que del ADNc de referencia (roja), lo que se interpreta
como sobreexpresión de ese gen en las células tumorales.

6. Señala varias similitudes y diferencias entre los dos principales

métodos de hibridación en medio líquido: captura de hibrido y ADN
ramificado.

Similitudes Diferencias
En ambas se utilizan sondas sin marcar En la captura de híbrido se utiliza una única
sonda específica, mientras que en el ADN
ramificado se utilizan dos sondas
específicas: sonda para captura y sonda
de extensión
La detección del híbrido se realiza en pocillos de placa En la captura de híbrido, ésta se realiza con un
microtiter anticuerpo anti ARN/ADN, mientras que en el ADN
ramificado la captura se realiza con un
oligonucleótido de captura.
La detección del híbrido se realiza En la captura de híbrido, la detección del
por quimioluminiscencia híbrido se realiza con un anticuerpo
marcado con enzima, mientras que en el
ADN ramificado se utilizan
secuencialmente varios oligonucleótidos
de amplificación, el último de los cuales va
marcado con enzima

Se han desarrollado para el diagnóstico Captura de hibrido: Detecta si está o no.

microbiológico, y especialmente detección de Cualitativa
virus.
ADN Ramificado: Permite cuantificar.
 7. Complete en tu cuaderno las siguientes frases relativas a la técnica
de hibridación de captura de hibrido, eligiendo la opción adecuada
en cada caso:

1) En la técnica de captura de hibrido la formación del hibrido

sonda-secuencia diana ocurre: b) En solución.

2) En las técnicas de captura de hibrido se usan: a) Sondas de

ARN para detectar secuencias diana de ADN y sondas de ADN
para detectar secuencias diana de ARN.

3) En la técnica de captura de hibrido: b) Se marca la sonda yla

muestra.

4) En este tipo de técnicas, la captura de hibrido se realiza

mediante: c) Anticuerpos específicos que reconocen
heteróduplex ADN/ARN.

8. Ordena en tu cuaderno los Pasos que seguir para el desarrollo de

una técnica de hibridación de captura de hibrido y para una técnica
de ADN ramificado diseñadas para detectar un virus ADN:

1) CAPTURA DE HIBRIDO:

c) 1- Lisis de partículas víricas y desnaturalización del ADN viral.

b) 2- Hibridación.
e) 3- Captura del hibrido
a) 4- Detección del hibrido
d) 5- Revelado

2) ADN RAMIFICADO:

d) 1- Lisis de partículas víricas y desnaturalización del ADN viral.

e) 2- Hibridación con sondas para captura y sondas de extensión.
b) 3- Captura del hibrido
a) 4- Preamplificación
f) 5- Amplificación
g) 6- Detección
c) 7- Revelado
9. Nombra las 3 clases de técnicas de hibridación que existen según
la localización física en la que se forma el hibrido sonda/secuencia
diana y explica la diferencia entre ellas
MEDIO SOLIDO
Una de las dos moléculas
implicadas la secuencia
diana o la sonda
previamente a la hibridación
se moviliza sobre un
soporte Solido
Se fija al soporte la muestra
con la secuencia diana e
incubar luego con la sonda
marcada para formar el
hibrido: Dot Blot –
Southern Blot y Norther
Blot
Dot Blot: Para ADN /ARN,
estudio simultaneo varias
muestras. Sondas
radioactivas o áptenos, P32
es una técnica de rastreo.
De el deriva: ASO DOT
BLOT: permite detectar
mutaciones, homosigosis –
heterosigosis, por empleo de
oligonucleótidos.
DOT BLOT INVERSO:
hibridación de colonias y
placas vitrales.
Southern Blot: identifica
fragmentos de ADN.
Separados por electroforesis
en gel y transferidos a la
membrana (nitrocelulosa o
nailon).
La DIFERENCIA CON EL
DOT BLOT Detecta
simultáneamente varias
secuencias diana de
distintos tamaños, con
sonda radioactiva.
Norther Blot: Moleculas de
ARN, por electroforesis y
transferencia a membrana
(nitrocelulosa o nailon)
Microrrays: de ADN o
biochip, conjunto o
fragmentos de ADN (sonda)
distintos, fijados a una
superficie solida (vidrio,
MEDIO LIQUIDO
Hibrida sonda/secuencia
diana se forma en solución
en los pocillos de las placas
de microtiter, y se fija a la
pared de los pocillos para su
detección.
Habitualmente NO SE
MARCA ni la sonda ni la
muestra. El hibrido se
detecta por métodos
indirectos. Hay dos técnicas:
Técnica de Captura de
Hibrido – Técnica ARN
Ramificado.
Técnica de Captura de
Hibrido: Forma de hibrido
ARN/ADN que se han
reconocido por anticuerpos
ramificados.
Es CUALITATIVO
Técnica ARN Ramificado:
Amplifica la señal por unión
de las secuencias diana a
un macro-complejo de ADN.
Se creó para aumentar la
sensibilidad de la técnica de
captura de hibrido y hace
posible la
CUANTIFICACIÓN
IN SITU
La hibridación se produce
en las mismas estructuras
celulares que contienen los
ácidos nucleicos, sin
necesidad de extracción
previa.
Detecta secuencias de
ADN/ARN sobre
cromosomas metafísicos,
células y tejidos.
La secuencia diana se va a
localizar en el sitio que se
encuentra fisiológicamente.
ISH FLUORECENTE FISH
Fluorocromos +
microscopio
fluorescencia.
Detecta alteraciones
cromosómica numéricas y
estructurales. Se divide en:
FISH Interfasico: Detecta
secuencias de ADN en
núcleos en interface de
núcleos desnudos.
FISH Metafasico:mDtecta
secuencias de ADN
directamente de los
cromosomas de extenciones
citogenéticas en metfase,
alteración numérica y
delecciòn
ISH CROMOGENICA CISH
Reacciones
inmunohistoquímico +
microscopio óptico
normal.
Se utiliza principalmente
para tejidos FFPE.
Detecta secuencias Genicas
de virus papiloma humano.
Detecta ARNmk y landa y
inmunoglobulinas.
Estudios de expresión
génica.
platico, silicio), detecta miles
de secuencias distintas, se
marcan con fluorocromos, es
CUANTITATIVA Y
CUALITATIVA

10. En la siguiente tabla se enumera una serie de aplicaciones de la

hibridación in situ. En la primera columna se especifica el tipo de
muestra de partida, y en la segunda columna se detalla el tipo de
estudio que se quiere realizar.

Copia la tabla y rellena la tercera columna con la modalidad de

hibridación in situ, FISH o CISH, que consideres más adecuada
para cada caso.

MUESTRA ESTUDIO FISH/CISH

Cortes de biopsia de Detección del virus del
cérvix FFPE CISH
papiloma humano
Núcleos interfásicos Detección de trisomía del
FISH
de médula ósea cromosoma 12
Núcleos interfásicos Detección de la
de médula ósea FISH
translocación t (9;22)
Cortes de biopsia de Detección de ARNm de
ganglio linfático FFPE cadenas k y ʎ de CISH
inmunoglobulinas
Cortes de tejido Detección de triploidía
FISH
congelado

11. Di si las siguientes afirmaciones relativas a los controles que hay

que emplear en las técnicas de hibridación in situ cromogénica
sobre cortes de tejido fijado en formol e incluido en parafina son
verdaderas o falsas. En el caso de la falsas, escribe cual sería l
información correcta:

a) FALSO: El control positivo de la técnica sirve para comprobar que

todos los reactivos funcionan correctamente.

b) VERDADERO: El control negativo de la técnica sirve para comprobar

que ningún reactivo empleado tiñe de manera inespecífica algún
componente del tejido del mismo color que el marcaje empleado. Se
realiza exactamente igual que la reacción problema, eliminando la
sonda de la solución de hibridación.

c) VERDADERO: El control positivo de la muestra sirve para comprobar

que el tejido ha sido tratado adecuadamente y que la fijación se ha
efectuado correctamente, de manera que el tejido conserva sus
ácidos nucleico aptos para hibridación. Se realiza con sondas
 específicas de secuencias repetidas ALU para ADN y sondas poli-T
para ARN.

d) FALSO: El control negativo de la muestra sirve para comprobar que

el resultado observado es específico y no obedece a uniones
inespecíficas de la sonda a diversas estructuras del tejido. Este
control se realiza sustituyendo la sonda específica por secuencias no
complementarias con los ácidos nucleicos de la muestra.