TÉCNICAS

DE
BIOLOGÍA
MOLECULAR
EN
MEDICINA
FORENSE (2)
 La huella genética
Combinación de alelos de varios
marcadores genéticos que posee
un individuo.

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 La huella genética
Cuanto mayor sea el número de marcadores
analizados y mayor sea el número de alelos
descritos para cada marcador, mayor será la
probabilidad de que una combinación dada de
alelos sea única e identifique de manera
inequívoca a un individuo.

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 La huella genética
• Estudiamos tres de los métodos que
representan el pasado, el presente y el
futuro de la huella genética (en inglés
genetic fingerprint).
• Estas son:
o Polimorfismo de longitud de fragmentos
de restricción (RFLP).
o Análisis de STR mediante PCR.
o Análisis de SNP.

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 RFLP
• Poliformismos de longitud de fragmentos de
restricción (restriction fragment length
polymorphism).
• Primer método que se desarrolló para la
obtención de huellas genéticas : análisis de
varios VNTR (repeticiones en tándem en
número variable) mediante RFLP
• El protocolo se basa en la técnica de
Southern blot y se desarrolla en 5 fases

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 RFLP
1. Digestión del ADN genómico purificado con
enzima de restricción:
o Esta digestión genera cientos de miles de
fragmentos de ADN, algunos de los cuales
contendrá un VNTR concreto.
o El tamaño de ese fragmento variará de un
individuo a otro, dependiendo del alelo que
porte cada uno.
o Lo mismo ocurrirá con todos los fragmentos que
incluyan VNTR.

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 RFLP
2. Separación de los fragmentos de
restricción por tamaño mediante
electroforesis en gel de agarosa o
poliacrilamida.
3. Transferencia de los fragmentos de
restricción del gel a una membrana
de nailon o nitrocelulosa.

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 RFLP
4. Hibridación con sondas radiactivas
especificas de los VNTR que se
analizan:
o Sonda de locus único (SLP), sólo detecta un
VNTR
o Sondas Multilocus (MLP), son una mezcla de
sondas que detectan simultáneamente
varios VNTR.
5. Autorradiografía de la membrana
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 RFLP
• El resultado final:
o Con sondas SLP se observa una o dos
bandas, dependiendo de que el individuo
estudiado sea homocigoto o heterocigoto
para ese VNTR, respectivamente.
o Cuando se utilizan sondas MLP, que es lo más
habitual, se obtiene un patrón de bandas
característico de cada individuo.
o El número de bandas depende del número
de VNTR analizados con la sonda y la
existencia de homocigosis y/o heterocigosis

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 RFLP
• Ejemplo:
o Si la sonda cubre 10 VNTR diferentes, los
patrones de bandas obtenidos tendrán entre
10 (individuos homocigotos para los 10 loci) y 20
bandas (individuos heterocigotos para los 10
loci).
o La posición de cada banda, en función de sus
respectivos tamaños, dependerá del alelo
individual del VNTR incluido en cada uno de los
fragmentos.
• A este patrón de bandas es a lo que
inicialmente se denominó huella genética.
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 Esquema de un estudio de polimorfismos de
longitud de fragmentos de restricción (RFLP).

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 RFLP
• La probabilidad de discriminación entre
dos individuos con esta metodología,
depende del número de VNTR analizados y
de la variación alélica de cada uno de
ellos.
• Por ejemplo, si se analizan 4 VNTR con 25
posibles alelos cada uno, el poder de
discriminación de la técnica es de 1 entre
1 millón.

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 RFLP
• El principal inconveniente de esta
metodología es que para obtener un buen
resultado hay que partir de una cantidad
relativamente grande (alrededor de 1 μg) de
ADN no degradado.
• Esta condición es relativamente fácil de
cumplir en estudios de paternidad, pero no se
cumple en muchos estudios de criminalística,
en los que se parte de cantidades mínimas de
ADN muy degradado.

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 Análisis de STR mediante PCR

• La amplificación de STR (repeticiones en

tándem cortas) mediante PCR permite
trabajar con cantidades mínimas de ADN
(inconveniente en RFLP)
• Al amplificar secuencias inferiores a 500
nucleótidos la degradación parcial del
ADN no influye tanto en la obtención del
resultado final.

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 Análisis de STR mediante PCR
• Se amplifica un STR
• Los productos de amplificación se
someten a electroforesis en gel de
poliacrilamida:
o Se separan por tamaño los alelos
presentes en cada muestra
• Se obtiene el genotipo de cada
individuo analizado para ese STR.

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 Análisis de STR mediante PCR
• Como patrón se utiliza una mezcla de
todos los alelos posibles para ese STR, que
generará la llamada escalera alélica.
• Se identifica el alelo presente comparando
bandas con el patrón
• En los individuos homocigotos para el STR
en estudio se observará una única banda y
en los individuos heterocigotos se
observarán dos bandas.

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Electroforesis en gel de los
productos amplificados en una
PCR para el STR D5S818 de
tres muestras correspondientes
a tres individuos diferentes. AL:
escalera alélica del STR
D5S818, del que se conocen 9
alelos (desde 7 hasta 15
repeticiones de la secuencia
básica AGAT). El individuo 1 es
heterocigoto para los alelos 11 y
12; el individuo 2 es homocigoto
para el alelo 10; el individuo 3
es heterocigoto para los alelos
12 y 15.

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 Análisis de STR mediante PCR
• Si se analiza un único STR, la probabilidad de que
dos individuos distintos tengan el mismo genotipo
es superior a 1 entre 100.
• Se aumenta el poder de discriminación de esta
técnica se analizan varios STR
• La combinación de patrones de bandas obtenidos
en las distintas electroforesis configura la huella
genética de un individuo.
• Para hacer un estudio forense en la actualidad se
amplifican 15 STR autosómicos diferentes más un
marcador sexual (amelogenina).

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 Análisis de STR mediante PCR
• Con esta combinación de marcadores se
consigue que la probabilidad de que dos
individuos tengan el mismo perfil genético
o genotipo es inferior a 1 entre un billón.
• O dicho de otra manera, teniendo en
cuenta el tamaño de la población
mundial, la probabilidad de que la huella
genética de cada individuo obtenida con
esta metodología sea única es
prácticamente del 100%.
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 AMELOGENINA
• Proteína hidrofóbica producida por los
ameloblastos durante el desarrollo del esmalte
dental
• Los genes que la codifican es un marcador
fenotípico del sexo
• Estos genes están en los cromosomas sexuales:
o Cromosoma X, gen AMELX
o Cromosoma Y, gen AMELY
• Existen divergencias en secuencia y tamaño
entre ambos alelos

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 AMELOGENINA
• En el cromosoma X, el gen AMELX, da lugar
a un producto de amplificación
(amplicón) de 106 bp
• En el cromosoma Y, el gen AMELY, un
amplicón de 112 bp,
• El gen en el cromosoma Y posee 6 bp más
que en el cromosoma X.
• El gen AMELX contiene una deleción de 6
bp (pares de bases) en el intron 1

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 AMELOGENINA
• Estos genes se emplean en estudios de
identificación del sexo en restos biológicos
humanos (pruebas forenses).
• La electroforesis en agarosa de los amplicones
manifiestan:
o dos bandas sobre (una para el fragmento de 106
bp y otro para el fragmento de 112 bp) en
muestras de origen masculino (XY)
o Una sola banda en muestras de origen femenino
(XX)
o Tiene cierto margen de error debido a
mutaciones en el fragmento del cromosoma Y
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 • Para un mismo individuo, se pueden
obtener tantas huellas genéticas
diferentes como juegos de
marcadores genéticos sean
analizados.
• Para estandarizar los resultados se
utilizan sistemas normalizados

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• El más utilizado es el seleccionado por el FBI
americano para su base de datos de ADN,
denominada CODIS (Combined DNA Index
System), que consta de 13 marcadores
autosómicos más la amelogenina
• Actualmente los kits comerciales utilizan el
CODIS añadiendo uno o dos marcadores
propios
• Se investigan mediante electroforesis capilar
obteniéndose un electroferograma que
representa la huella genética del individuo
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 Análisis de SNP
• Combina las metodologías que analizan
polimorfismos de longitud y las metodologías
que analizan polimorfismos de secuencia.
• En este sentido los SNP ofrecen dos ventajas
importantes:
o Poseen una tasa de mutación muy baja.
o Al afectar a nucleótidos únicos, la probabilidad
de que estén conservados en muestras de ADN
muy degradado es mayor que en el caso de los
STR.
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 Análisis de SNP
• Inconveniente: poder de discriminación de
un SNP, considerado individualmente, es
muy bajo, puesto que son marcadores
dialélicos,
• Hay que analizar miles de SNP para
alcanzar un poder de discriminación similar
o superior al del análisis de STR.
• No obstante, se consideran el futuro de la huella
genética al combinarse con técnicas moleculares
como los microarrays, , la secuenciación masiva…

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 Análisis de ADN
mitocondrial (ADNmt)
• Recurso importante en estudios
forenses de muestras:
o muy antiguas
o muy degradadas
o con ausencia de ADN nuclear, (los pelos
sin bulbo)

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 Análisis de ADN
mitocondrial (ADNmt)

• El ADNmt es una molécula:

o circular
o mucho más estable y
o más resistente a la acción de las exonucleasas
que el ADN nuclear lineal.
• Se han podido estudiar muestras de ADNmt
de restos óseos con miles de años de
antigüedad.

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 Análisis de ADN
mitocondrial (ADNmt)
• El número de mitocondrias por célula
varía de cientos a miles, dependiendo
del tipo celular.
• Cada mitocondria tiene múltiples
copias de ADNmt, por lo que el número
de moléculas de ese tipo de ADN por
célula es muy superior al del ADN
nuclear.

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 Análisis de ADN
mitocondrial (ADNmt)
• El ADNmt es de herencia materna:
o No hay diferencias entre los individuos de un
mismo linaje materno, salvo pequeñas
variaciones por mutaciones.
o Se utilizan para establecer filiaciones por vía
materna
• Los estudios forenses de ADNmt se
basan en polimorfismos de secuencia.
• El ADNmt humano tiene 16569 pb y está
totalmente secuenciado.
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 Análisis de ADN
mitocondrial (ADNmt)
• Tiene dos regiones hipervariables,
denominadas HVI (342 pb) y HVII (268 pb),
que son las utilizadas para este tipo de
estudios.
• La metodología consiste en amplificar y
secuenciar estas regiones hipervariables
para establecer comparaciones.
• Recomendación: leer “Las 7 hijas de Eva”
de Brian Sykes.

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 Análisis de polimorfismos
del cromosoma Y
• El cromosoma Y humano es un cromosoma
acrocéntrico pequeño
• Prácticamente no sufre recombinación
durante la meiosis
o solo una pequeñísima región
pseudoautosómica puede recombinar con una
región del cromosoma X
• Prácticamente todo el cromosoma
constituye un grupo de ligamiento que se
hereda junto.
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 Análisis de polimorfismos
del cromosoma Y
• El análisis de este cromosoma con fines forenses
se basa en polimorfismos de longitud (Y-STR).
• Todos los Y-STR analizados se encuentran en la
zona no recombinante del cromosoma Y, por lo
que se heredan en bloque de padres a hijos
varones
• Constituyen lo que se denomina un haplotipo,
que se mantiene generación tras generación sin
más cambios que los producidos por
mutaciones
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 Análisis de polimorfismos
del cromosoma Y
• Se utiliza para:
o Estudios antropológicos para estudiar la
evolución de linajes paternos.
o Estudios de paternidad de individuos varones
cuando no existe muestra del presunto padre,
pero se puede tener acceso a muestras de
otros miembros del linaje paterno, como
hermanos, tíos, abuelo paterno, primos, etc.
o En casos de delitos sexuales, en los que las
células del semen o de otro tipo de un agresor
varón están mezcladas con células femeninas
de la víctima.
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 Análisis de polimorfismos
del cromosoma Y
• ¡¡Cuidado!! : existe una limitación en estos
estudios de los polimorfismos del
cromosoma Y en genética forense, puesto
que todos los varones de un mismo linaje
paterno tienen el mismo haplotipo.

• Es imprescindible combinar el análisis del

cromosoma Y con estudios convencionales
basados en polimorfismos autosómicos.

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