APUNTES TEMA 2 HEMATO

ESTUDIO MORFOLÓGICO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS EN SANGRE

PERIFÉRICA Y MÉDULA ÓSEA

El estudio morfológico permite calcular la proporción de los distintos tipos

celulares normales presentes en ambos tipos de muestras y detectar la presencia
de tipos celulares anómalos.

Se estudian criterios morfológicos como:

-Forma y tamaño.
-Presencia o ausencia de núcleo.
-Características nucleares (aspecto de la cromatina, número y aspecto de los
nucléolos).
-Características citoplasmáticas (cantidad, propiedades tintoriales, presencia o
ausencia de gránulos, aspecto de estos…).

LA EXTENSIÓN DE SANGRE PERIFÉRICA

Un frotis de sangre consiste en una capa fina de sangre dispuesta sobre un

portaobjetos para realizar un análisis morfológico de sus células con un microscopio
óptico, y a menudo de tinciones.

La sangre periférica se obtiene por :

-Venopunción y se debe anticoagular con EDTA.
-Por punción de la yema del dedo con una lanceta, obteniendo sangre capilar.

TÉCNICA DEL PORTAOBJETOS EN CUÑA

Se necesitan dos portaobjetos de vidrio limpios preferentemente con bordes

biselados, uno se empleará como soporte y otro como extensor.

1.Depositar una gota de sangre de aproximadamente 10-15 um en el porta soporte,

cerca de un extremo.

2. Colocar el porta extensor sobre el soporte, por delante de la gota, formando cuña
en un ángulo de 35º o 45º.
3.Deslizar el extensor un poco hacia atrás para que su borde entre en contacto con
la sangre, de esta forma la sangre se distribuye por capilaridad a lo largo de su
borde.

4.Deslizar el porta extensor sobre la longitud del portaobjetos soporte en un

movimiento rápido, suave y continuo, manteniendo el ángulo de 35º o 45º entre
ambos y con una presión homogénea. La sangre debe ocupar 2/3 o 3/4 del porta.

5. Dejar secar al aire libre.

CARACTERÍSTICAS Y ZONAS DE UNA EXTENSIÓN SANGUÍNEA.

Ejercicio 1

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA CALIDAD DE LA EXTENSIÓN.

Ejercicio 3

MUESTRA DE SANGRE

● Volumen de sangre utilizado: si es excesivo se obtienen extensiones muy

gruesas, sin zona de cola que ocupan todo el porta soporte.
Si es escaso da lugar a extensiones cortas donde no se diferencian las tres
zonas.

● Anticoagulación de la sangre: mejores extensiones con anticoagulante

EDTA.

EJECUCIÓN DE LA TÉCNICA

● Distribución de la sangre por el canto del porta extensor.

● Ángulo del portaobjetos extensor respecto del soporte. + de 45
extensiones gruesas y cortas y -35 extensiones largas y excesivamente finas.
● Velocidad de deslizamiento del porta extensor sobre el soporte.
● Presión ejercida durante el deslizamiento del porta extensor.

TINCIONES HEMATOLÓGICAS PARA EXTENSIONES DE SANGRE

Las tinciones convencionales se realizan para colorear las diversas estructuras de

las células sanguíneas, aumentando el contraste entre ellas y el medio que las
rodea, facilitando la identificación de los tipos celulares al microscopio.
Las tinciones especiales permiten detectar actividades enzimáticas, principios
inmediatos, elementos inorgánicos o moléculas específicas de utilidad para el
diagnóstico y seguimiento de hemopatías.

TINCIONES CONVENCIONALES POLICROMAS

Son tinciones hematológicas que utilizan combinaciones de colorantes con distintas

afinidades para que las estructuras celulares se tiñan de forma distinta.
Se aplica sobre células muestras por lo que es necesario realizar una fijación previa.

La fijación evita alteraciones de la estructura celular y facilita la adherencia de las

células al portaobjetos.

● TINCIÓN MAY GRÜNWALD-GIEMSA: combinación de dos colorantes que se

ionizan y combinan con distintos componentes celulares, según sus
afinidades y generan sales insolubles con diferentes matices de coloración.
Los colorantes son:

-May Grünwald: una solución de eosina y azul de metileno en metanol que

actúa como fijador. Afinidad a componentes celulares ácidos.
-Giemsa: una mezcla de eosina y derivados de azul de metileno. Afinidad
con componentes celulares básicos.

Eritrocitos: rosa-salmón.
Núcleos: azul oscuro/violeta.
Gránulos citoplasmáticos de los leucos neutrófilos: azul claro/ lila.
Gránulos citoplasmáticos de los leucos basófilos: azul oscuro/ negro.
Gránulos citoplasmáticos de los leucos eosinófilos: rojo-anaranjado.

1. Colocar la extensión en un puente sobre un cristalizador.

2. Cubrir la extensión con MG durante 2 min para fijar.
3. Volcar la extensión, eliminando el colorante, y escurrir.
4. Cubrir la extensión con solución diluída de MG durante 1 min.
5. Volcar la extensión, eliminando el colorante, lavar con agua destilada y
escurrir.
6. Cubrir la extensión con solución diluída de Giemsa durante 20 min.
7. Volcar el porta, eliminando el colorante, lavar con agua destilada,
escurrir y dejar secar al aire.

● TINCIÓN DE WRIGHT: se emplea sobre extensiones de sangre periférica, se

usa un solo colorante que es una mezcla de eosina, azul de metileno y
derivados de azul de metileno en metanol.
 En la tinción se emplea un solo colorante pero en dos pasos. Primero se
incuba con el colorante sin diluir y luego con una dilución tamponada del
mismo colorante.

● TINCIÓN PANÓPTICA RÁPIDA: se emplea en laboratorios de urgencia con 3

reactivos:
-Una solución fijadora, normalmente a base de etanol.
-Un colorante ácido tamponado, derivado de eosina tampón fosfato.
-Un colorante básico tamponado, derivado del azul de metileno.

Incubación por inmersión secuencial, primero la solución fijadora, después

colorante ácido y por último el básico.
Inmersiones de 5-10 segundos. Se lava con agua y se deja secar al aire.

TINCIONES CONVENCIONALES SUPRAVITALES

Para la observación de células vivas, no requiere fijación previa.

Primero se realiza la tinción mezclando el colorante con la sangre y después se
realiza la extensión.

● TINCIÓN DE ZAUL CRESIL BRILLANTE PARA RETICULOCITOS.

Los reticulocitos son hematíes inmaduras que conservan algunos gránulos
celulares y restos de ARN.

Los hematíes se tiñen de color verde pálido y los reticulocitos se diferencian

porque en su interior se encuentran estructuras granulares y filamentosas de
color azul.

1. Introducir en un tubo de hemólisis cantidades iguales de colorante y de

sangre anticoagulada con EDTA. Mezclar suavemente y cerrar el tubo
para evitar la desecación.
2. Incubar cinco min en baño María a 37º.
3. Homogeneizar suavemente la mezcla y hacer la extensión.

TINCIONES ESPECIALES

Se emplean más para extensiones de médula ósea, la que se realiza sobre sangre
periférica es:

● FOSFATASA ALCALINA GRANULOCÍTICA: detecta actividades enzimáticas

en los gránulos secundarios de los leucos neutrófilos.
Índice de actividad FAG: ejercicio 9.
Utilidad: estudio de síndromes mieloproliferativos.

EXAMEN MICROSCÓPICO DE SANGRE PERIFÉRICA

Para diagnóstico hematológico, porque permite detectar y confirmar alteraciones

cuantitativas y morfológicas en los eritrocitos, leucocitos y plaquetas.

INDICACIONES DEL EXAMEN MICROSCÓPICO

Ejercicio 10

EXAMEN MICROSCÓPICO

EXAMEN 10X
Permite observar la calidad del frotis, la distribución de los leucocitos, la presencia
de células grandes anormales, posibles aglutinaciones de leucocitos y la presencia
de parásitos.

EXAMEN 40X
Permite hacer una estimación del recuento de leucocitos/mm3 contando los leucos
presentes en 10 campos y calculando la media de leucos por campo multiplicando
por 2000.

EXAMEN 100X
Examen más exhaustivo.
Se analizan las tres series.
● Evaluación leucos:
Recuento diferencial de leucos y fórmula leucocitaria y análisis morfológico
de estos.
● Evaluación eritrocitos:
Detección y recuento de eritroblastos y análisis morfológico de los eritrocitos.
● Evaluación plaquetas:
Estimación del recuento de plaqueta/mm3 y detección de agregados
plaquetarios.

LA EXTENSIÓN DE MÉDULA ÓSEA

La extensión o frotis de médula ósea consiste en una capa fina de aspirado de

médula ósea dispuesta sobre un portaobjetos para realizar un análisis morfológico
de sus células con un microscopio y a menudo de tinciones.

Obtenidas por aspirados, inmediatamente después de su obtención o conservados

con anticoagulante.
Con la finalidad del análisis morfológico de las células hematopoyéticas, precursoras
de los elementos formes de la sangre periférica, fundamental para el estudio de
enfermedades hematopoyéticas y no hematopoyéticas.

ASPIRADO DE MÉDULA ÓSEA

Se obtienen mediante punción y aspiración de la médula contenida en huesos que

conservan la hematopoyesis. Cresta ilíaca posterior superior o cresta ilíaca superior
y del esternón.

Puncionar el hueso con un trocar y aspirar con una jeringuilla el contenido medular,
obteniendo una pequeña cantidad de médula ósea.
Estudio citológico: 0,5 mL
Otras técnicas: hasta más de 5mL

El aspirado contiene 2 componentes:

Grumo medular: material propio de la médula que contiene células, grasa y matriz
extracelular en proporción variable según las circunstancias clínicas y la edad del
paciente.
Sangre medular: sangre procedente de la vascularización de la médula, formada
por una red de vasos sanguíneos de pared fina denominados senos venosos. Se
habla también de sangre sinusal.

OBTENCIÓN DE LAS EXTENSIONES

Deben hacerse lo antes posible después de la extracción y es fundamental que

incluyan grumo y no solo sangre sinusal. Si no es al momento: EDTA.

Técnicas: aplastamiento o técnica del portaobjetos en cuña. Esta última cuando el

grumo es muy escaso o el aspirado contiene solo sangre sinusal.

TINCIONES HEMATOLÓGICAS PARA EXTENSIONES DE MÉDULA

ÓSEA

TINCIONES CONVENCIONALES

Se aplican para teñir extensiones de mo, son las misma que las policromas de
sangre periférica: May Grünwald-Giemsa y Wright. Los procedimientos son
parecidos pero los tiempos de incubación con los colorantes son más largos debido
al mayor grosor. El tejido conectivo y la matriz extracelular presente en el grumo se
tiñe de color azul oscuro o púrpura, las demás estructuras se tiñen igual que en un
frotis de sangre periférica.
TINCIONES ESPECIALES

Mejoran la diferenciación celular y se suelen mezclar con las tinciones

convencionales.
Las tinciones especiales permiten detectar actividades enzimáticas, principios
inmediatos, elementos inorgánicos o moléculas específicas útiles en el diagnóstico y
seguimiento de las hemopatías.

-Tinciones citoquímicas: se basan en reacciones químicas sencillas que originan

productos coloreados y que ponen de manifiesto¡o determinados componentes
celulares.
● Tinción Pearls para hierro: o azul de Prusia, pone de manifiesto la
presencia de hierro iónico intracelular y concretamente la hemosiderina.
● Tinción Pas: pone de manifiesto glucógeno y mucopolisacáridos.
● Mieloperoxidasa (MPO): es una enzima sintetizada en el retículo
endoplasmático rugoso de células mieloide, donde pasa a las cisternas del
aparato de Golgi, quedando fundamentalmente localizada en la granulación
primaria azurófila.
● Fosfatasa ácida: es una enzima que hidroliza monoésteres del ácido
fosfórico a pH ácido.

Esterasas: son enzimas que hidrolizan ésteres y se diferencian las unas de las
otras por su capacidad para hidrolizar sustratos diferentes. Más conocidas: naftol
AS-D cloroacetato esterasa, α-naftil butirato esterasa y la α-naftil acetato esterasa.

-Tinciones inmunocitoquímicas: se basan en la utilización de anticuerpos

específicos para detectar moléculas que caracterizan poblaciones celulares
concretas. Método sencillo, rápido y muy potente para detectar poblaciones
celulares. Se necesita un sistema de visualización microscópica especial.
Sirven para identificar y clasificar células neoplásicas, puesto que cada tipo celular
tiene un patrón de marcadores moleculares de membrana característico.

2 tipos de marcadores:

● Fluorocromos: sustancias fluorescentes que pueden visualizarse con un

microscopio de fluorescencia. La fluorescencia se desvanece con el tiempo
por lo que estas preparaciones no son permanentes.
● Enzimas: se revelan utilizando sustratos solubles que por la actividad
enzimática se transforman en productos insolubles coloreados. Estas
preparaciones se pueden deshidratar, montar y mantener de forma
permanente para su observación.
EXAMEN MICROSCÓPICO DE EXTENSIONES DE MÉDULA ÓSEA

INDICACIONES DEL EXAMEN MICROSCÓPICO

-Leucopoyesis: evalúa la morfología y el estado de los elementos mieloides y

linfoides, tipos de maduración y etc…
-Eritropoyesis: proporción relativa de los distintos elementos de la serie roja.
-Trombopoyesis: evalúa el número y estado funcional de los megacariocitos y la
morfología de las plaquetas.
-Sistema retículo-endotelial: se analiza la morfología de los elementos reticulares
y de las células plasmáticas.
-Elementos anormales.

EXAMEN A BAJO AUMENTO (10x y 40x)

● Presencia de grumo
● Celularidad global
● Relación mieloeritroide
● Cantidad de grasa
● Alteraciones estromales
● Presencia de algunos tipos de células medulares
● Presencia de elementos celulares extramedulares
● Presencia de parásitos

EXAMEN A GRAN AUMENTO (100x)

● Analizar las alteraciones

● Realizar el mielograma: que es el recuento diferencial de los elementos que
componen la celularidad medular, se expresa en porcentajes. Preciso contar
como mínimo 300 células para unos buenos resultados.

AUTOMATIZACIÓN DE LAS TINCIONES HEMATOLÓGICAS

En los sistemas automáticos más modernos, un software selecciona las muestras

que requieren un estudio morfológico microscópico, realizan las extensiones
mediante un extensor, las tiñe, escanea las preparaciones con un sistema de
visualización microscópico y calcula la fórmula leucocitaria.