TRABAJO PRÁCTICO N°5:

ENZIMAS
Objetivo

● Mencionar y analizar la función biológica de una enzima. Enumerar las clases de

enzimas.
● Mencionar y analizar en qué consiste el sitio activo de una enzima y cómo es su
interacción con sustratos.
● Escribir y analizar cada uno de los parámetros de la ecuación de
Michaelis-Menten y Lineweaver-Burk.
● Observar y analizar el comportamiento enzimático de acuerdo a la intervención
de factores como el pH, temperatura, concentración de sustrato, concentración
enzimática.
● Dibujar y analizar el comportamiento cinético de inhibidores reversibles e
irreversibles.
● Resolver ejercicios de cinética enzimática.
● Evaluar la actividad enzimática de ureasa usando un kit comercial

Generalidades

Las enzimas son las macromoléculas capaces de acelerar una reacción química.

La mayoría de las enzimas son proteínas (también se han aislado moléculas de

ácido ribonucleico con actividad catalítica llamadas ribozimas). Su actividad catalítica
depende de la integridad de su conformación proteica nativa. Algunas enzimas no
requieren para su actividad más grupos químicos que residuos aminoácidos, otras
requieren componentes químicos denominados coenzimas. Las coenzimas pueden estar
fuertemente unidad a la apoenzima (parte proteica) del tipo covalente u otro tipo de
unión o por uniones laxas. (Algunos autores denominan GRUPOS PROSTÉTICOS
cuando la molécula se encuentra unida por un enlace covalente, ej. piruvato carboxilasa
= Biotina; y reservan el nombre de coenzima cuando las uniones son lábiles, ej.
oxidoreductasa = NAD). No sólo pueden ser grupos orgánicos, sino también

1
inorgánicos como en el caso de los METALES o iones metálicos tales como Fe²⁺,
Mg²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ y ferrosulfurosos (ej.: Peroxidasa = Fe³⁺, glucosa-6-fosfatasa = Mg²⁺,
ureasa = Ni²⁺).

APOENZIMA + COENZIMA =
HOLOENZIMA
(porción proteica) (porción no proteica) (enzima completa)

Las catálisis enzimáticas de las reacciones son esenciales para los sistemas vivos.
En condiciones biológicas las reacciones sin catalizar tienden a ser lentas. Las
reacciones necesarias para digerir alimentos, enviar señales nerviosas o contraer
músculo no se dan a una velocidad útil sin catálisis.

Una enzima soluciona estos problemas al proporcionar un ambiente dentro del

cual una reacción determinada es, energéticamente, más favorable.

Una reacción catalizada enzimáticamente tiene lugar dentro del sitio activo, la
molécula fijada al sitio activo y sobre la que actúa la enzima se denomina sustrato (S).

Es importante destacar que las enzimas alteran la velocidad de la reacción, pero

no los equilibrios. La función de un catalizador es aumentar la velocidad de
reacción. Los catalizadores no modifican los equilibrios de la reacción.

Los principios termodinámicos permiten predecir que una reacción va a ocurrir,

pero no hablan de la ​velocidad con la que puede transcurrir.

Para que una molécula de sustrato “S” se transforme en producto “P” necesita
una mínima energía que le permita alcanzar el estado de transición o estado intermedio;
esto es, la energía mínima necesaria para que la reacción ocurra. Ésta energía es
llamada energía de activación (​Figura#1​). Si la energía de activación es alta, la
reacción será lenta. Se ha demostrado la existencia de ciertos compuestos que tienen
la propiedad de acelerar los procesos de transformación de reactivos en productos,
dichas sustancias son denominadas​ catalizadores. Los catalizadores actúan
disminuyendo la energía de activación de la reacción y tienen la gran ventaja de poder

2
reaccionar sin consumirse, razón por la cual pueden reutilizarse y catalizar varias veces
la misma reacción.

En los seres vivos, algunas moléculas de naturaleza proteica desarrollan esta

función de catálisis y son llamadas enzimas (también encontramos ribozimas: ARN con
actividad catalítica y Abzymes: Anticuerpos con actividad catalítica). Su existencia en
los seres vivos permite que los procesos biológicos se lleven a cabo a temperaturas
moderadas y mayor velocidad. Una reacción catalizada enzimáticamente a 25°C puede
transcurrir de 10⁶​a 10¹​⁵ veces más rápido ​que ​la reacción sin catalizar (Reacciones no
catalizadas 11 días, reacciones catalizadas 1sg). La ventaja de la catálisis enzimática
frente a otro tipo de mecanismos catalíticos (físicos o químicos) es que pueden trabajar
a temperaturas relativamente bajas (25-40°C), en pH cercanos a la neutralidad (6-8).

Figura N°1 Representación ​de la energía de activación para una reacción con y sin
enzima. Ea=Energía de activación para la reacción NO catalizada. Ea*= Energía
de activación para la reacción catalizada.

SITIO ACTIVO Y ACOPLAMIENTO INDUCIDO

El sitio activo es una agrupación de aminoácidos cuyos residuos están

encargados de ejercer la función catalítica de ruptura y modificación de enlaces
para la obtención del producto P. Las enzimas difieren en tamaño y estructura, sin
embargo el sitio activo está conformado por un número reducido de aminoácidos
distribuidos espacialmente de manera precisa que pueden estar alejados al observar la

3
estructura primaria de la enzima, pero cercanos gracias a la estructura secundaria y
terciaria de la misma ​(Figura#2)​.

Sin embargo, el sitio activo no tiene una conformación rígida y permanente.

Cuando el sustrato se une a la enzima, induce cambios conformacionales en su
estructura, gracias a los cuales el sitio activo se acomoda para el proceso catalítico. Esta
hipótesis estudiada por el bioquímico norteamericano Daniel Koshland en 1958 fue
denominada “Acoplamiento Inducido”.

Figura N°2. ​ Amilasa salival ​ (PDB 1JXJ). Representación de la estructura

terciaria. Sitio activo subrayado en magenta y verde.
https://www.ebi.ac.uk/pdbe/entry/pdb/1jxj

Suelen encontrarse enzimas que catalizan la misma reacción pero provienen

de diferentes tejidos y son llamadas ISOENZIMAS. Si bien el sitio activo se
conserva, su estructura primaria cambia y por lo tanto tienen resistencia a pH y
temperatura diferentes, además tienen diferentes patrones de migración electroforética y
diferentes valores de constantes cinéticas. Cuando la presencia de una enzima en líquido
biológico (sangre-orina) es indicativa de patología, la posibilidad de caracterizar cada
isoenzima (diferentes valores de variables cinéticas, migración electroforética etc.) es
muy importante en diagnóstico clínico para diferenciar cuál de los tejidos es el que está
afectado.

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 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

El mecanismo de acción de la enzima implica la asociación con el sustrato “S”

para formar el complejo enzima-sustrato (ES*) a partir del cual se formará el producto
“P” y se liberará nuevamente enzima “E” sin modificaciones:

Por lo tanto, la actividad de una enzima puede determinarse midiendo la cantidad

de producto formado, o de sustrato consumido en un tiempo dado. La forma más común
para reportar actividad enzimática es la UNIDAD DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
(U) que es la cantidad de enzima que es capaz de convertir 1 μ mol de sustrato por
minuto. Se pueden encontrar otras unidades derivadas como el Katal (60.10​6​ ) y la
actividad específica (U/mg ó U/mL).

μ𝑚𝑜𝑙
𝑈= ⌊ 𝑚𝑖𝑛
⌋ ; Kat = 60x10⁶U

μ𝑚𝑜𝑙 μ𝑚𝑜𝑙
Act específica = 𝑈 = ⌊ *𝑚𝑔
⌋ ; Act espècifica = 𝑈/𝑑𝑙 = ⌊ 𝑚𝑖𝑛*𝑑𝐿
⌋

FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

La cinética enzimática es la rama de la enzimología que trata de los factores que
afectan a la velocidad de las reacciones catalizadas enzimáticamente. Los factores más
importantes son la concentración de la enzima, la concentración de los ligandos
(sustratos, cofactores o inhibidores), pH y temperatura.

Para el caso particular de este práctico estudiaremos uno de los factores antes
mencionados que es la temperatura, la cual incide fundamentalmente en la estructura
molecular de la enzima, más exactamente, inciden en la conservación de su estructura
tridimensional. Por lo tanto, todos aquellos factores que puedan alterar las interacciones

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como las del tipo hidrofóbicas y electrostáticas que mantienen la estabilidad de la
estructura cambiarán la actividad de la enzima.

Existen otros factores que pueden modificar la estructura molecular y por ende la
actividad de una enzima como la presencia de solventes orgánicos o sales inorgánicas.
Por lo tanto, es fundamental mantener constante la composición del medio y el pH para
asegurar las condiciones en las que la enzima posee el mayor porcentaje de actividad en
la reacción evaluada.

A. Temperatura: Dado que una reacción química implica la ruptura y formación de

enlaces, la temperatura es un parámetro físico que puede catalizar reacciones (aún en
ausencia de enzimas). Un aumento en la temperatura incrementa la energía cinética
(vibracional y rotacional) de los enlaces que constituyen las moléculas en reacción y por
lo tanto puede contribuir en la ruptura de los enlaces. Sin embargo, cuando en el
medio de reacción hay una enzima, existe un rango de temperaturas en la cual la
temperatura favorece la catálisis y fuera de ella desestabiliza la estructura de la enzima y
pierde su actividad (desnaturalización). Como se ejemplifica en la Figura #3. Si una
reacción tiene todas las condiciones fijas y sólo se cambia la temperatura a la cual se
lleva a cabo la reacción, se encontrará la temperatura óptima de trabajo para esa enzima
y reacción particular. Grandes cambios en la temperatura aumentan la energía cinética
del medio de reacción e interrumpen las interacciones hidrofóbicas y electrostáticas que
mantienen la estabilidad de la enzima. De esta forma, la enzima pierde su conformación
nativa (desnaturalización) y su actividad (Figura N°3). También puede producirse la
desnaturalización a bajas temperaturas que es un fenómeno general provocado por la
interacción muy específica y fuertemente dependiente de la temperatura de los grupos
proteicos apolares con el agua. La hidratación de estos grupos, es termodinámicamente
favorable, es decir ΔG<0 y aumenta en magnitud cuando la temperatura disminuye.
Como resultado, la cadena polipeptídica, empaquetada firmemente en una estructura
nativa compacta, se despliega a una temperatura suficientemente baja, exponiendo los
grupos apolares internos al agua.

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Figura N°3: Representación de los cambios de actividad enzimática en función de
los cambios en la temperatura

B. pH: ​ A bajos pH, los enlaces iónicos y mediados por puentes hidrógeno formados
con los grupos carboxilatos (ácido aspártico/glutámico) pueden interrumpirse. A altos
pH los enlaces iónicos y mediados por hidrógeno que se forman con los aminoácidos
básicos pueden interrumpirse también. Por lo tanto, el pH de una medición de actividad
enzimática debe mantenerse constante frente a los otros factores. El efecto de la
concentración de hidrogeniones se puede demostrar en la ​Figura N° 4.

Para la mayoría de las enzimas, la actividad óptima se encuentra entre pH 6 y 8,

por debajo o por encima de esos valores, la velocidad de reacción cae más o menos
rápidamente. Los cambios de pH del medio afectan el estado de ionización de grupos
funcionales en la molécula de enzima y también en el sustrato. Para la formación del
complejo enzima-sustrato es necesario mantener una adecuada distribución de cargas en
ambas moléculas. El pH óptimo es aquel en el cual el estado de disociación de los
grupos esenciales es el más apropiado para interaccionar en el complejo ES. Por el
contrario, pH extremos provocan desnaturalización de la molécula enzimática llevando
a su inactivación. (ver Figura 4)

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 Figura 4: Representación de los cambios de actividad enzimática en función al pH
del medio.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
La cinética enzimática es la rama de la enzimología que trata de los factores que
afectan a la velocidad de las reacciones catalizadas enzimáticamente. Los factores más
importantes son la concentración de la enzima, la concentración de los ligandos
(sustratos, cofactores o inhibidores), pH, fuerza iónica y temperatura. Para la presente
práctica se estudiarán las variables de concentración de enzima y de sustrato.

A. ​Concentración de la enzima: ​Bajo ciertas condiciones experimentales la velocidad

inicial de la reacción varía linealmente con la concentración de enzima y puede ser
utilizada para cuantificar la enzima presente. Como se ejemplifica en la ​Figura #5​, a
bajas concentraciones de enzima, la formación del complejo enzima-sustrato (amarillo)
es efectiva. Esta relación se mantendrá si la reacción no se prolonga más allá del tiempo
necesario para consumir 5% del sustrato originalmente presente.

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Figura 5: Cambio de actividad enzimática en función de la concentración de
enzima. Círculos verdes= Enzima libre. -triángulo rojo= Sustrato libre. Círculo +
triángulo amarillo= Complejo Enzima-Sustrato

B. Concentración del sustrato: ​Cuando se quiere determinar la actividad enzimática

manteniendo constante la concentración de enzima y las otras condiciones de reacción,
excepto concentración del sustrato y se grafican los resultados en un sistema de
coordenadas, se obtiene una hipérbola como se ejemplifica en la Figura #6. Las enzimas
que se ajustan a esta hipérbola son conocidas como enzimas Michaelianas, en honor a
los investigadores Michaelis-Menten quienes estudiaron dicho comportamiento. Al
comienzo, la actividad aumenta rápidamente con el incremento de concentración de
sustrato (Triángulos rojos-S), pero a concentraciones más elevadas de la misma, la
velocidad crece más lentamente, y tiende a alcanzar un máximo. Cuando la
concentración de sustrato es baja (gran parte de las moléculas de enzima se encuentra
libre), la actividad crece en forma lineal con la concentración de sustrato, manteniendo
una cinética de primer orden (Región sombreada). A medida que aumenta la
concentración de sustrato, los incrementos de velocidad son cada vez menores y se llega
a una situación donde la actividad no aumenta por más que se incremente la
concentración de sustrato (momento en que prácticamente todas las moléculas de
enzima están ocupadas por sustrato, es decir, la enzima se ha “saturado”). En este
momento, la curva tiende a ser horizontal y corresponde a la velocidad máxima (Si el
aumento de concentración de sustrato continúa y excede las concentraciones de enzima,
se alcanza un ​ estado estacionario en el cual la velocidad de reacción no varía) que se

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comporta con una cinética de orden cero (final de la gráfica que se aproxima a la línea
de puntos)

Figura 6: Cambios en la actividad enzimática en función de la concentración de

sustrato. Círculos verdes= Enzima libre. -triángulo rojo= Sustrato libre. Círculo +
triángulo amarillo= Complejo Enzima-Sustrato. Región Sombreada= cinética de
primer orden.

Adicionalmente, en la Figura N°6 se observan las variables cinéticas que son

características de cada enzima y reacción y permiten diferenciar entre isoenzimas de
diferentes tejidos. Las variables cinéticas se definen como:

a) Vmáx: La velocidad máxima, solo se alcanza a concentraciones infinitas de

sustrato.

b) Vi: La velocidad inicial de una reacción enzimática para una determinada cantidad
de enzima, depende linealmente de la concentración inicial de sustrato y se calcula
como la pendiente de la parte lineal de la curva [Producto]/tiempo.

c) Km: corresponde a la concentración de sustrato con la cual la velocidad de

reacción alcanza un valor igual a la mitad de la máxima. En condiciones definidas de
pH, temperatura, etc., ​ Km tiene un valor fijo para cada enzima y sirve para
caracterizarla.

La hipérbola de saturación de una enzima por su sustrato ejemplificada en la

Figura N°6 puede expresarse con la ecuación deducida por ​Michaelis-Menten​:

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 (𝑉𝑚𝑎𝑥 ⦍𝑆⦎)
(1) V= (𝐾𝑚 + ⦍𝑆⦎)

Donde V: velocidad inicial con concentración de sustrato igual a ⦍S⦎. Vmax:

velocidad máxima. Km: constante de Michaelis para el sustrato

A partir de esta ecuación se deduce que cuando [S] está por debajo del valor de
Km, la velocidad de reacción depende de la concentración de sustrato (porción inicial de
la curva en la cual la reacción es de primer orden respecto a [S]-variación lineal de
actividad frente a la concentración de sustrato).

Cuando la [S] es muy superior al valor de Km, la velocidad inicial es

prácticamente máxima (porción final de la curva, reacción de orden cero-variación nula
de actividad frente al aumento de la concentración de sustrato).

Si [S] es igual al valor de Km reemplazando en la ecuación (1):

(𝑉𝑚𝑎𝑥 ⦍𝑆⦎) (𝑉𝑚𝑎𝑥 ⦍𝑆⦎) (𝑉𝑚𝑎𝑥 ⦍𝑆⦎) (𝑉𝑚𝑎𝑥 )

V= (𝐾𝑚 + ⦍𝑆⦎)
= ( ⦍𝑆⦎+ ⦍𝑆⦎)
= (2 ⦍𝑆⦎)
= 2

Es decir, cuando la concentración de sustrato es igual a Km, la velocidad de

reacción es igual a la mitad de la velocidad máxima.

Para mejorar el análisis e identificación de las variables cinéticas, la hipérbola se

puede linealizar usando un gráfico de inversas. El gráfico se puede obtener si tomamos
la inversa de la (1) ecuación:

1 𝐾𝑚 + ⦍𝑆⦎ 𝐾𝑚 ⦍𝑆⦎
(2) 𝑉
= 𝑉𝑚𝑎𝑥 ⦍𝑆⦎ = 𝑉𝑚𝑎𝑥⦍ 𝑆⦎
+ 𝑉𝑚𝑎𝑥 + ⦍𝑆⦎

1 𝐾𝑚 1 1
(2) 𝑉
= 𝑉𝑚𝑎𝑥 * ⦍𝑆⦎
+ 𝑉𝑚𝑎𝑥

(Ecuación de la recta) Y = a.X + b

Esta ecuación transformada se denomina​ Lineweaver-Burk y corresponde a la

ecuación de una recta.

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 La representación de la inversa de la velocidad inicial (1/v) en función de la
inversa de la concentración de sustrato (1/[S]) da una recta. La pendiente de esta recta es
igual a Km/V​max, la intersección con el eje vertical corresponde a 1/Vmax, mientras
que la intersección con el eje horizontal, corresponde a -1/Km.

Figura N°7: Gráfico de doble recíproca o Lineweaver-Burk. Permite reconocer las

variables cinéticas para una reacción y una enzima específica.

ENZIMAS ALOSTÉRICAS

Estas enzimas además de su sitio activo poseen otros sitios que son reguladores de
su actividad catalítica. A los cuales se unen agentes que reciben el nombre de
moduladores, modificadores o efectores alostéricos; pueden ser positivos si estimulan la
actividad o negativos si la deprimen. Cuando el modulador es el sustrato se dirá que es
homotrópico; y si es distinto será heterotrópico. El sitio de unión del modulador se
denomina sitio alostérico.

Este tipo de enzimas desempeñan un papel muy importante en la regulación de las

reacciones metabólicas, suelen actuar en puntos estratégicos de las rutas metabólicas
como son: la primera reacción de una ruta metabólica o los puntos de ramificación de
una ruta metabólica.

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 Otra forma de regulación del metabolismo mediante enzimas alostéricas es la
inhibición por el producto final, también llamada retroinhibición o control feed-back.
En ella, el producto final de una ruta metabólica inhibe alostéricamente a la enzima que
cataliza la primera reacción de dicha ruta, interrumpiendo así su propia síntesis cuando
ésta ya no es necesaria. Este tipo de control es muy rentable para la célula, ya que no se
interrumpe solamente la síntesis del producto final sino la de todos los intermediarios.
Se trata de un control heterotrópico mediante un modulador negativo.

Aunque existen enzimas alostéricos monovalentes, que responden a un sólo

modulador, la inmensa mayoría son enzimas polivalentes, que poseen varios centros
alostéricos mediante los cuales interactúan con distintos moduladores positivos y/o
negativos, presentando un tipo de control mixto homotrópico-heterotrópico.

En resumen, los MECANISMOS REGULADORES DE LA ACTIVIDAD

ENZIMÁTICA SON:

1. ALOSTERISMO:
a. POSITIVO: si estimulan la actividad de la enzima
b. NEGATIVO: si deprimen la actividad de la enzima
2. MODIFICADORES COVALENTES: por adición o sustracción de grupos
unidos covalentemente. ejerce cambios conformacionales.
3. ACTIVACIÓN EN CASCADA: dependen de las enzimas precedentes o de los
productos de éstas para poder activarse.
4. ENZIMAS INDUCIBLES: enzimas o proteínas que se sintetizan de novo ante
determinados estímulos. (A diferencia de éstas, las ENZIMAS
CONSTITUTIVAS, mantienen su nivel constante a lo largo de toda la vida de la
célula).

Todos estos mecanismos permiten que la actividad enzimática de las células

pueda ajustarse a las condiciones fisiológicas.

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 Figura 8: Esquema representativo de enzimas alostéricas

INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

Los inhibidores son moléculas que regulan la actividad enzimática, inhibiendo su

actividad. A grandes rasgos, pueden clasificarse en reversibles e irreversibles.

Las irreversibles se unen covalentemente a la enzima sin posibilidad de

revertir la modificación, siendo útiles en farmacología. Un ejemplo de fármaco es el
alopurinol (utilizado para tratamiento de gota) que es efectivo para reducir los niveles
de ácido úrico, ya que se une al sitio activo de la xantina oxidasa, oxidándose y
permaneciendo unido irreversiblemente a dicha enzima.

Las reversibles se unen de forma reversible a la enzima, pudiendo clasificarse

a su vez, según la forma en que intervienen en la reacción, en competitivas,
acompetitivas y no competitivas.

En la inhibición competitiva, el sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la

misma enzima al mismo tiempo. Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tiene
afinidad por el sitio activo de una enzima en el cual también se une el sustrato; el
sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al sitio activo de la enzima. Por ejemplo,
el metotrexato o MTX es un inhibidor competitivo de la enzima dihidrofolato reductasa,
que cataliza la reducción de dihidrofolato a tetrahidrofolato (el metotrexato impide que
las células usen el ácido fólico para elaborar el ADN y es posible que destruya células

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cancerosas). En la inhibición competitiva la velocidad máxima de la reacción no
varía, pero se necesitan concentraciones más elevadas de sustrato para alcanzar una
determinada velocidad, incrementándose así la Km aparente.

Figura N° 9: GRÁFICO DE DOBLE RECÍPROCA 1/V vs 1/[S]. Recta negra (en

ausencia de inhibidor), recta colorada (en presencia de inhibidor competitivo). La
inhibición competitiva el inhibidor compite con el sustrato por el sitio activo.

En la inhibición acompetitiva el inhibidor no puede unirse a la enzima libre, sino

únicamente al complejo enzima-sustrato (ES). Una vez formado el complejo con el
inhibidor (EIS) la enzima queda inactiva. Este tipo de inhibición es poco común, pero
puede darse en enzimas multiméricas.

15
Figura N° 10: GRÁFICO DE DOBLE RECÍPROCA 1/V vs 1/[S]. Recta negra (en
ausencia de inhibidor), recta colorada (en presencia de inhibidor competitivo). En la
inhibición acompetitiva el inhibidor se une al complejo enzima-sustrato en un sitio
distinto al sitio activo.

La inhibición no competitiva es una forma de inhibición donde la unión del

inhibidor con la enzima reduce su actividad, pero no afecta la unión con el sustrato.
Como resultado, el grado de inhibición depende solamente de la concentración de
inhibidor, independientemente de la concentración de sustrato, con lo que varía el valor
de la Vmax aparente. Sin embargo, como el sustrato aún puede unirse a la enzima, el
valor de Km no varía.

16
Figura N° 11: GRÁFICO DE DOBLE RECÍPROCA 1/V vs 1/[S]. Recta negra (en
ausencia de inhibidor), recta colorada (en presencia de inhibidor competitivo). En la
inhibición no competitiva el inhibidor se une a la enzima libre o cuando está unida
al sustrato en un sitio distinto al sitio activo.

INHIBIDORES, IMPORTANCIA BIOLÓGICA Y APLICACIONES

En muchos organismos, los inhibidores pueden actuar como parte de un

mecanismo de regulación en diversas rutas metabólicas por realimentación o
“feedback”. Esto significa que si una enzima produce un producto en demasiada
cantidad en el organismo, esta misma sustancia podría actuar como un inhibidor de la
enzima al inicio de la ruta que lo produjo, deteniendo así dicha producción cuando haya
una cantidad suficiente de la sustancia en cuestión. Este es un ejemplo genérico de
retroalimentación negativa. Las enzimas que se encuentran sujetas a este tipo de
regulación suelen ser multiméricas y poseer sitios alostéricos donde se unen sustancias
reguladoras.

17
Figura 12: Esquema representativo de inhibición por retroalimentación o feedback

Debido a que los inhibidores modulan la función de las enzimas, suelen ser
utilizados como fármacos. Un ejemplo es el fármaco metotrexato cuya estructura es
muy similar a la coenzima ácido fólico; como resultado, el metotrexato es un inhibidor
competitivo de muchas enzimas que utilizan folato.

Un típico ejemplo de un inhibidor irreversible que es utilizado como fármaco es la

aspirina, la cual inhibe las enzimas ciclooxigenasas COX-1 y COX-2 implicadas en la
síntesis de un intermediario inflamatorio, las prostaglandinas, con lo que suprime así los
efectos derivados, el dolor (efecto analgésico), la inflamación (efecto antiinflamatorio) y
fiebre (efecto antipirético). Carlo Patrono. Aspirin Continues to Attract Research and
Debate, 115 Years After Its Synthesis Rev Esp Cardiol. 2013;66(4):251–254.

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 Sin embargo, otros inhibidores enzimáticos actúan como venenos. Por ejemplo, el
cianuro es un inhibidor irreversible que se une a los átomos de hierro y cobre en el sitio
activo de la citocromo C oxidasa de células animales (las plantas son resistentes al
cianuro), bloqueando así la respiración celular.

Parte experimental: INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE UREASA

SIGNIFICACIÓN CLÍNICA

La medición de la concentración de enzimas en algunos líquidos biológicos o en

tejidos, es una herramienta de diagnóstico para observar alteraciones en la funcionalidad
de diversos órganos y tejidos. Por ejemplo, el test de ureasa en plasma, permite
cuantificar urea, último producto del metabolismo de proteínas que se produce en el
hígado y normalmente es excretada en orina por los riñones. La presencia de urea en el
plasma puede estar relacionada con disfunción renal. De igual forma, el test de ureasa
permite el diagnóstico de la enfermedad ulcerosa gastroduodenal. Es un test rápido, de
bajo costo, sensibilidad entre 90-95% y especificidad de 95-100%. Cerca del 50% de la
población mundial padece trastornos gastrointestinales producidos por úlceras pépticas
que están estrechamente relacionadas con la presencia de la bacteria gram-negativa
Helicobacter pylori. Su supervivencia en el estómago, en donde el pH es inferior a 3,
depende de su capacidad de producir una enzima que le permita neutralizarlo. Para ello,
H. pylori produce UREASA, una enzima capaz de catalizar la hidrólisis de Urea para
producir amoniaco y con ello neutralizar el medio ambiente que la rodea. La ureasa se

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asocia con otras 3 moléculas de enzima formando un complejo esférico de 16 nm de
diámetro estabilizado principalmente por interacciones iónicas y puentes de hidrógeno,
que le permiten resistir el medio ambiente ácido del estómago, catalizar la hidrólisis de
urea y proteger a H. pylori para extender la úlcera péptica y profundizar el trastorno
gastrointestinal. Por lo tanto, la identificación de ureasa en las biopsias obtenidas en
pacientes con síntomas de úlcera pépticas son indicativos de la presencia de H. pylori.
El diagnóstico temprano facilita la erradicación de la bacteria reduciendo la posibilidad
de recidiva ulcerosa y nuevos episodios de hemorragia digestiva.

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

La ureasa cataliza la hidrólisis de urea para dar dos moléculas de amoníaco y

dióxido de carbono. La ureasa actúa a nivel de los enlaces C-N excepto para aquellos
que forman un enlace peptídico. El pH óptimo de la actividad de la ureasa es 7 y está
ampliamente distribuida en microorganismos ya que ayuda en la descomposición de
algunos compuestos orgánicos.

[(H2N)2 CO + 2 H2O] + Ureasa → [CO2 + H2O + 2 NH3] ↔ (NH4)2CO3

Se realizará la cuantificación de actividad enzimática de ureasa usando el kit

comercial para análisis bioquímicos. Se espera que la ureasa hidrolice los enlaces C-N
de la urea produciendo dióxido de carbono y amoníaco. El amoníaco reacciona en
medio alcalino con salicilato e hipoclorito para dar un complejo coloreado llamado
indofenol que absorbe en la región del espectro entre 510-570 nm. Cuanto mayor es la
coloración de la mezcla de reacción, mayor será la actividad de la enzima ureasa.

MATERIALES
➢ 10 Tubos de ensayo
➢ 1 Gradilla
➢ 3 Pipetas 20μL , 100μL y 5mL
➢ 1 Propipeta
➢ Baño termostatizado
➢ Espectrofotómetro

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➢ Temporizador

REACTIVOS
➢ Kit de determinación de urea (Urea color 2R Wiener Lab) que contiene:
Solución A: Contiene Buffer fosfato, ácido salicílico, nitroprusiato de sodio, EDTA y
enzima UREASA (3U/mL).
Solución B: Contiene Buffer fosfato, ácido salicílico, nitroprusiato de sodio y EDTA
(sin agregado de enzima)
Solución C: Contiene Urea (0.60g/L).
Solución D: Contiene hipoclorito de sodio en hidróxido de sodio.

PROCEDIMIENTOS

❖ ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE UREASA EN FUNCIÓN DE LA

TEMPERATURA

➢ Disponga en la gradilla de 3 tubos de ensayo, rotulados adecuadamente

➢ En cada tubo de ensayo deposite solución A (mL) de acuerdo con la
tabla.
➢ Incubar 10 min a 4 °C, 37 °C y 90 °C respectivamente.
➢ Agregar 10 μL de Solución C en los tubos de ensayo. Mezclar
➢ Incubar a 37°C por 5min (5% sustrato = Velocidad inicial V i) .
➢ Agregar Solución D (mL) de acuerdo con la tabla.
➢ Incubar a 37°C por 5min
➢ Medir en espectrofotómetro y registrar los valores de absorbancia a 570
nm en la tabla.

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 N° TUBO 1 2 3

Solución A (mL) 0.5 0.5 0.5

Incubar por 10 min 4 °C 37 °C 90 °C

Solución C (μL) 10 10 10

*Incubar 5 min a 37°C o 10 min a temperatura ambiente

Solución D (mL) 0.5 0.5 0.5

*Incubar 5 min a 37°C o 10 min a temperatura ambiente

Coloración

Absorbancia 570 nm (u.a.)

Concentración Urea (g/L)

Discusión de resultados: ➢ Compare la absorbancia a 570 nm de los ensayos y

discuta las posibles causas que explican sus cambios de actividad enzimática.

Actividad enzimática en función de la concentración de sustrato (urea).

➢ Disponga en la gradilla 5 tubos de ensayo, rotulados adecuadamente

➢ En cada tubo de ensayo deposite solución A (mL) de acuerdo con la tabla siguiente
➢ Agregar Solución C en cada tubo μL de ensayo de acuerdo con la tabla siguiente
Mezclar.
➢ Incubar cada tubo de ensayo a 37°C por 5min.
➢ Agregar Solución D (mL) de acuerdo con la tabla
➢ Incubar cada tubo de ensayo a 37°C por 5min.
➢ Registrar los valores de absorbancia a 570 nm en la tabla:

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 TABLA
Resultados actividad enzimática con concentración variable de urea
N° TUBO 1 2 3

Solución A (mL) 0.5 0.5 0.5

Solución C( μL) 3 10 50

*Incubar 5 min a 37°C o 10 min a temperatura ambiente

Solución D (mL) 0.5 0.5 0.5

Incubar a 37°C por 5 min o 10 min a temperatura ambiente

Coloración

Absorbancia 570 nm (u.a.)

Concentración Urea (g/L)

Discusión de resultados:

➢ Grafique la curva de actividad enzimática teniendo como eje Y la absorbancia a 570

nm y como eje X la concentración de sustrato (g/L Urea).

CUESTIONARIO

1. Enumere el tipo de interacciones que mantienen la estabilidad de la estructura

primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de una proteína.

2. Teniendo en cuenta la estructura primaria dada para dos cadenas polipeptídicas

cortas, dibuje la cadena polipeptídica, detallando los grupos “R” de la cadena y luego
clasifíquelas en mayoritariamente positiva o mayoritariamente negativa. Justifique su
respuesta. (​Guía: Previamente identifique el pKa de los residuos de cada uno de los
aminoácidos involucrados en la cadena)

1. KGHLRI

2. DGELDI

3. Describa el concepto de desnaturalización por efecto de temperatura y pH.

4. Se realizaron análisis de desnaturalización de albúmina sérica bovina (BSA) por

cambios en el pH en una experiencia en el laboratorio. Para comprobar el
proceso de desnaturalización se siguió el aumento en la absorbancia a 405 nm

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por reacción de BSA con p-nitrofenol acetato como sustrato “modelo” de su
enlazamiento a ácidos grasos y con los datos de absorbancia se identificó la actividad
en ​. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla siguiente:

Realice una gráfica de pH (eje X) Vs Actividad (μmol/min ​) (Eje Y) e identifique el pH

óptimo de trabajo de la albúmina sérica bovina.

5. Con los resultados expresados en la tabla de la actividad N°4, si pudiera hacer una
determinación instrumental para conocer la estructura terciaria de las muestras
obtenidas al final de este tratamiento, clasifique cómo espera encontrar la
estructura terciaria de cada muestra en una de estas tres categorías: 1) Nativa; 2)
Parcialmente desnaturalizada o 3) Totalmente desnaturalizada.

6. La creatinfosfokinasa (CK) es una enzima dimérica localizada en diferentes tejidos

como músculo (CK-MM), corazón (CK-MB) y cerebro (CK-BB). Su función es
catalizar la fosforilación de la creatina para producir fosfocreatina, una molécula
muy importante en la generación de ATP por vía anaerobia. En un episodio de infarto de
miocardio, la isoenzima CK-MB puede estar aumentada y se constituye en una
herramienta diagnóstico después de las primeras 6-8 hs después del suceso. Sin
embargo, la isoenzima CK-MM también puede estar alterada en un episodio de grandes
esfuerzos musculares como carreras de maratón. Se encontró un análisis positivo para la
reacción test de presencia de CK, pero se desconoce cuál es la isoenzima presente en el
plasma evaluado. Evaluar el valor de Km es una herramienta que permite diferenciar la
isoenzima responsable de la actividad observada. Dado que las tres isoenzimas catalizan
la misma reacción, se pidió al laboratorio un análisis de Km para determinar cuál es la
isoenzima responsable del resultado positivo previamente analizado. Los resultados
usando fosfocreatina (CP) como sustrato fueron los siguientes:

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Ayuda al técnico de laboratorio a identificar la isoenzima responsable del resultado
positivo en el análisis teniendo en cuenta los valores de Km reportados en la literatura.
Identifica si el resultado positivo encontrado en el análisis obedece a un episodio de
infarto de miocardio o a grandes esfuerzos musculares.

7. La erección masculina está relacionada con los altos niveles de Guanosin

Monofosfato Cíclico (GMPc) en el pene. La enzima intracelular denominada

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Fosfodiesterasa 5 (PDE5) posee dos sitios de unión reversible para los cationes
metálicos Zn​+2 Mg​+2 y cataliza la hidrólisis del GMPc, disminuyendo sus
niveles en el pene y el tiempo de la erección. El sildenafil (Viagra) es una molécula
similar al GMPc y por lo tanto puede unirse al mismo sitio activo de la PDE5 evitando
la degradación de GMPc y manteniendo la erección por períodos más largos de tiempo.

De acuerdo con la información brindada y sus conocimientos sobre inhibición

enzimática marque con una (X) la respuesta correcta: La inhibición de sildenafil sobre
PDE5 es de tipo:

a) Competitivo, con una disminución en la afinidad del sustrato reflejado en un aumento

de su K​m​y el mantenimiento de la Vmáx.

b) Competitivo, con una disminución en la afinidad del sustrato reflejado en el

mantenimiento del Km​y una disminución de la Vmáx.

c) No competitivo, con una disminución en la afinidad del sustrato reflejado en un

aumento de su K​M​.

d) No competitivo con una disminución en la afinidad del sustrato reflejado en un

aumento de su K​M​y cuya Vmáx se mantiene constante.

BIBLIOGRAFÍA

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y Biología Molecular . Universidad de Córdoba. España. Pagina web:
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Moderno, 2013.
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26
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7. Nam-Chul Ha, et al. Supramolecular assembly and acid resistance of
Helicobacter pylori urease . Nature Structural Biology . 2001 Vol.8 N.6
8. Jean F. MacFaddin. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de
importancia clínica . Ed. Médica Panamericana, 2003
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https://books.google.com.ar/books?id=VVvmCAAAQBAJ&pg=PA18&lpg=PA18&dq
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10. Stryer, L., Berg, J. M., & Tymoczko, J. L. (2003). Bioquímica (No. 84-291-7584-9.
04-A1 LU. CG-23.1.). Barcelona: Reverté.

Modalidad de Evaluación

Evaluación Formativa

Los resultados de las evaluaciones, conceptos y exámenes serán consignados

en una ficha individual, donde se especificará:

• Exámenes continuos en clases prácticas: durante cada práctico las/os

responsables del mismo, interrogarán a cada estudiante y asignará una
calificación.

Evaluación Diagnóstica

Al inicio y durante la actividad práctica, las/os docentes realizarán preguntas

orales y/o escritas con la finalidad de evaluar los contenidos aprendidos por
parte de los estudiantes en cada etapa del cursado de la asignatura. Esta
herramienta permitirá ajustar las actividades para optimizar el proceso de
enseñanza-aprendizaje.

• Se evaluará la comprensión e interpretación de los temas, la capacidad de

resolución de problemas, la utilización de un lenguaje acorde a la formación
disciplinar y la capacidad de integración de los contenidos de diferentes
unidades.

Criterio de aprobación: 60 % o más de las respuestas correctas

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