UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

ASIGNATURA: INGENIERÍA DE BIOPROCESOS AGROINDUSTRIALES, SEMESTRE: 2021-I
Práctica Semana 01.
14.05.21.
Docente: Mg. Any Berenice Córdova Chang
Alumno: Perez Mendez, Jhoan Yampol
Tarea 01.-
Redactar sucintamente, los fundamentos y aplicaciones o usos en los bioprocesos de la
Cromatografía en capa fina (TLC)
La cromatografía de capa fina, llamada TLC, es un tipo de cromatografía donde la fase
estacionaria es una capa delgada de un material depositado sobre un soporte, a este
conjunto se le llama placa, por lo cual la fase móvil es un disolvente o mezcla de
disolventes, llamada eluyente, que se mueve por la fase estacionaria por capilaridad.
Generalmente, las placas están formadas por una capa de gel de sílice u otro material
con propiedades adsorbentes.
El movimiento que se produce de tal manera que los compuestos que tienen una mayor
afinidad con la fase estacionaria se mueven lentamente mientras que los otros
compuestos se desplazan rápidamente. Por lo tanto, se logra la separación de la mezcla.
Una vez completado el proceso de separación, los componentes individuales de la
mezcla aparecen como manchas en los niveles respectivos de las placas. Su carácter y
naturaleza se identifican mediante técnicas de detección adecuadas. Además, esta
técnica de separación establecida a nivel mundial presenta alta versatilidad, fiabilidad y
tiene un sin número de aplicaciones en la industria y en otros campos.

El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el método

ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical,
en una cubeta, por la acción de la capilaridad. Para conseguir la máxima saturación
posible de la atmósfera de la cámara.
Generalmente el eluyente se introduce en la cámara una hora antes del desarrollo y se
impregnan las paredes para permitir la saturación de la atmósfera. El tiempo de
desarrollo, por lo general, no llega a los 30 minutos. El tiempo de una cromatografía
cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que el tiempo de una cromatografía
preparativa puede llegar a un par de horas.
Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se alcance una
línea dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto se hace para estandarizar los
valores de RF. Frecuentemente esta distancia es de 10 cm, ya que parece ser la más
conveniente para medir valores de RF. Después del desarrollo, las placas pueden secarse
rápidamente con una corriente de aire caliente.
La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y
el frente del eluyente, ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor
y menor velocidad. El frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa.
Funcionamiento
Para obtener la muestra de la cromatografía lo que se hace es que primero a la muestra
se disuelve en muy poca cantidad de un disolvente volátil. Si se llega a utilizar patrones
de alguna sustancia se preparan de la misma manera, luego se llega a dibujar una línea
base con lápiz y unos puntos de referencia donde se pincharán las muestras con un
capilar. Además, que se debe preparar la cubeta en la que se va a realizar la
cromatografía, ya que esta cubeta es un simple recipiente de vidrio en donde se va a
añadir el eluyente que se va a utilizar, siempre en un nivel inferior a la línea base que se
ha dibujado en la placa.
En la cubeta se introduce una tira de papel de filtro para que el vapor del eluyente esté
por toda la cubeta, y en este momento se introduce con cuidado la placa en la cubeta y
se tapa, esperando a que el nivel del eluyente ascienda por la placa. Cuando el nivel se
encuentra casi en el borde superior, luego se extrae la placa y se dibuja una nueva línea
en este nivel.
Pues el disolvente al ser volátil se evapora en poco tiempo dejando la placa seca. Pues
en ese momento se debe buscar un método para visualizar el resultado de la
cromatografía y ver la separación de los componentes pinchados en la placa, pues en el
caso de que la sustancia sea coloreada no habría ningún problema ya que se verían los
componentes.
Por lo que, para otros compuestos, las placas comerciales suelen llevar una sustancia
fluorescente que, si se llega a irradiar con luz UV, y ahí es donde pueden ver los
componentes como manchas oscuras circulares. Estas manchas se deben marcar sobre la
placa con lápiz.
Otro método a utilizar puede ser, hacer reaccionar los componentes con alguna
sustancia que coloree esos compuestos para dar una señal visual, pues se busca factores
que influyen en la elución, y el factor que más influye en la separación de los
componentes en este tipo de cromatografía es la polaridad de estos componentes, ya que
la placa está formada por una capa de gel de sílice, una sustancia muy polar, y, por lo
tanto, atraerá en mayor medida a componentes más polares.
Al realizar la cromatografía, las sustancias más polares interaccionarán más con el
soporte y su velocidad de desplazamiento será menor, esto significa que, al revelar la
placa cromatográfica, el componente más polar se encontrará en un lugar más cercano a
la línea base que hemos dibujado, y, por el contrario, el componente menos polar se
moverá más rápidamente y se encontrará más alejado de la línea base, por lo que la
polaridad del eluyente es un factor que consigue que los componentes se muevan más
rápido o más lento en una cromatografía.
Es decir, para un eluyente con mayor polaridad, éste estará más atraído por el soporte y
los componentes serán más libres para moverse mejor, por lo que, al revelar la placa, los
componentes saldrán más alejados de la línea base. Por la misma razón, con un eluyente
menos polar, éste casi no interacciona con el soporte polar, y los compuestos tendrán
una mayor interacción con el soporte, por lo que su velocidad será más pequeña y al
terminar la cromatografía, se habrán desplazado muy poco a partir de la línea base. Por
estos factores, es recomendable la elección de un buen eluyente para la separación de
los compuestos que queremos. Para cada experiencia será distinto el tipo de eluyente
que necesitemos, dependiendo de los componentes a separar, por lo tanto, lo mejor será
realizar varias pruebas con distintos tipos de eluyentes para así considerar el más óptimo
para nuestra cromatografía.
Características de la cromatografía de capa fina (TLC)
Resultados rápidos.
Facilidad de transferencia de resultados a cromatografía flash y HPLC.
Alta capacidad de procesamiento de muestras (hasta 20 por placa de forma
simultánea).
Bajo requerimiento de muestra.
Aplicaciones de la cromatografía de capa fina
La cromatografía en capa fina (TLC), llega a ser un método muy útil, rápido y barato ya
que los productos a examinar se disolverán, cuando sea posible, en un disolvente
orgánico que tenga un punto de ebullición lo suficientemente bajo para que se evapore
después de la aplicación, lo más común es usar acetona. Frecuentemente se emplean
disoluciones al 1%, de manera que al aplicar 2 ml resulta en la carga 20 mg de producto
sólido. Muchos reactivos de revelado llegan a detectar 0,1 mg de material; por esto con
esta carga puede llegarse a observar un 5% de impurezas.
Existe una gran variedad de micropipetas y micro jeringuillas para realizar el proceso de
siembra de la muestra a analizar. También pueden usarse tubos capilares. El proceso de
siembra se realiza tocando con la punta del capilar (micropipeta, etc.) sobre la placa
preparada, dejando una distancia al borde inferior de un centímetro aproximadamente.
El punto de aplicación de la muestra se denomina toque. Por lo que una vez colocado el
toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa solo quedará la
muestra a analizar, lo cual se aplica principalmente en:
Identificación de alguna sustancia conocida en una mezcla por su comparación
con un patrón de la sustancia pura.
Medir el grado de pureza de una muestra, si existen varias manchas en el
cromatograma, es señal de que existen varios componentes en la muestra.
Obtener una medida semicuantitativa de algún componente. Pichando la misma
cantidad en la placa cromatográfica, cuanto mayor sea la mancha obtenida en el
cromatograma, la concentración de esa sustancia será mayor.
Industria farmacéutica: Separación y cuantificación de ingredientes activos.
Industria de alimentos: Cuantificación de edulcorantes, preservantes y vitaminas.
Materias primas: Cuantificación de pureza.
Otras aplicaciones: Separación de componentes en muestras botánicas, de
productos naturales y bioquímicas.