PRCTICA No.

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CROMATOGRAFA EN CAPA FINA
TIEMPO DE DURACIN DE LA PRCTICA : 3 Hrs.
TIPO DE PRCTICA: Por equipo de 3 personas
OBJETIVO DE LA PRCTICA: Separacin, comparacin e identificacin de slo cualitativa
de los pigmentos de dos productos vegetales por cromatografa en capa fina.
INTRODUCCIN:
CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA
Comnmente se utilizan 2 procedimientos a fin de seleccionar las condiciones para una
separacin cromatogrfica. Uno consiste en usar la cromatografa de capa fina (CCF) con distintos
solventes y fases estacionarias con objeto de encontrar las mejores condiciones de operacin.
El desarrollo es mucho ms rpido que en papel debido a que el tamao de la partcula es
superior; esto da lugar a una mayor resolucin y manchas ms compactas. Para la fase estacionaria
se emplea generalmente gel de slice, almina, celulosa, caprolactama, etc.
Para realizar una cromatografa en capa compacta se limpia la placa con una solucin
concentrada de carbonato de sodio y se lava con agua antes de usarla. Para aplicar la fase
estacionaria elegida se utiliza un aplicador mecnico que permite un espesor uniforme de la capa. O
manualmente, empleando una varilla para extender la fase estacionaria suspendida en algn
disolvente que despus se elimina por evaporacin. Cuando la separacin se va a efectuar sobre un
portaobjetos, se emplea el mtodo de inmersin, que consiste en sumergir dos portaobjetos unidos
por sus caras mayores en una suspensin de la fase estacionaria en un disolvente voltil.
Normalmente, las suspensiones se hacen con agua en ocasiones acidulada o tratada con
alguna base o solucin amortiguadora. Se obtienen mejores resultados si stas se preparan en un
homogeneizador.
El espesor de la placa es, por lo general, de 0.25 mm.
Aplicador
Especial
Suspensin de la Fase estacionaria

de vidrio

Soporte para las placas

Aplicador mecnico para la separacin de placas cromatogrficas

En la CCF, se aplica una pequea gota de la solucin cerca del borde inferior de una placa
de vidrio o plstico recubierta con una capa delgada de fase estacionaria. Cuando la placa se coloca
en un depsito somero de solvente dentro de una cmara cerrada, recubierta con papel filtro
impregnado en el eluente para saturar la atmsfera.
El solvente sube lentamente por la placa, y
durante el ascenso se realiza la separacin cromatogrfica. Cuando el solvente se acerca al extremo
superior de la placa, sta se extrae del solvente y se deja secar. Las manchas se hacen visibles
colocando la placa en una cmara caliente que contiene un cristal de I2. El vapor de Yodo se
adsorbe reversiblemente sobre la mayora de las sustancias, y crea puntos oscuros en los sitios
donde existe un compuesto en la placa.
El revelado de la placa se efecta por la tcnica de atomizacin soportando agentes
corrosivos. Para efectuar una determinacin cuantitativa, las manchas se separan con cuidado de la
placa y se elige el mtodo adecuado para su cuantificacin.
De manera alternativa, muchas placas para CCF contienen un material fluorescente cuya
emisin es inhibida por la mayora de los solutos. Despus de que el solvente se evaporara, la placa
se observa con luz ultravioleta en un cuarto oscuro. Las manchas de soluto se ven oscuras, mientras
que el resto de la placa es brillante. Utilizando la CCF se puede experimentar rpidamente con
muchos solventes y fases estacionarias distintos a fin de encontrar la mejor combinacin para una
separacin.
Otro procedimiento consiste en usar una pipeta pasteur desechable, provista de un tapn de
fibra de vidrio, que constituye una estrecha columna de cromatografa con volumen total aproximado
de 1 l. Es posible utilizar varias de estas columnas en breve tiempo a fin de seleccionar las
condiciones apropiadas para una separacin a mayor escala.
Para cromatografa de adsorcin, la placa ya preparada se activa por calentamiento entre
100 y 150oC, y para la del reparto se deja a la intemperie, para que la humedad del aire la desactive.
La cromatografa en capa fina exige un manejo mucho ms cuidadoso. Las fases
estacionarias son celulosa microgranular, gel de slice y almina.
La seleccin de la fase mvil depende de la fase estacionaria y de los solutos. Si un eluente
puro no separa bien la muestra se emplean mezclas.
En general, para separar sustancias polares se usa celulosa o gel de slice. Las sustancias
no polares suelen separarse en gel de slice o en almina activada.

Despus de la separacin existen diversos procedimientos para localizar los componentes

de la muestra (a este proceso se le denomina a menudo visualizacin o revelado). Dos de los
mtodos que ordinariamente se utilizan con la mayora de las mezclas de sustancias orgnicas,
consisten en nebulizar sobre la placa una disolucin de yodo o de cido sulfrico, que reaccionan
con los compuestos orgnicos para dar productos oscuros. Tambin se utilizan otros reactivos
especficos como la ninhidrina para localizar las especies.
La mayora de los parmetros y ecuaciones desarrolladas para la cromatografa en columna,
con ligeras modificaciones, se pueden aplicar tambin a al cromatografa en capa fina, aunque se
necesita un nuevo parmetro, el factor retraso o Rf.
Factor retraso o Rf:
El factor de retraso para este soluto viene dado por:
Rf = d R
dM
donde d R y d M son las distintas lineales medidas desde la lnea de aplicacin.
Los valores de Rf pueden variar para los solutos con valores que se aproximan a cero.
Tngase en cuenta que si las manchas no son simtricas la medicin de d R se basa en la
posicin de la intensidad mxima.
El tiempo de residencia del soluto en la fase mvil es igual a la distancia que recorre dividido
por la velocidad lineal del disolvente .
El factor de capacidad K se puede representar de las siguientes formas
K = d M - d R
dR

K = 1 - Rf
Rf

Los factores de capacidad deducidos de este modo se pueden utilizar en el desarrollo de

mtodos para cromatografa en columna.
La obtencin de factores de capacidad por cromatografa en capa fina es, por lo general,
ms sencillo y ms rpido que a partir de los datos obtenidos en experimentos con columna.
ALTURAS DE PLATO: Tambin se puede deducir alturas de platos aproximadas para un tipo
determinado de relleno en cromatografa en capa fin El nmero de platos tericos N viene dado por
la ecuacin:
N = 16 * (d R/ W)2

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA CUALITATIVA: Por lo general, los datos de un solo

cromatograma no proporcionan la informacin suficiente para poder identificar las distintas especies
presentes en una mezcla, debido a su variabilidad los valores de Rf con el tamao de la muestra, la
placa de la capa fina, y las condiciones existentes durante el desarrollo. Adems, siempre existe la
posibilidad de que dos solutos bastante diferentes puedan presentar valores de Rf idnticos o casi
idnticos en condiciones determinadas.
Valores que afectan a los Rf: en el mejor de los casos, los valores de Rf se pueden
reproducir con dos cifras significativas, aunque al considerar varias placas, una sola cifra significativa
da una idea ms real de la precisin. Los factores ms importantes que determinan la magnitud del
Rf incluyen el grosor de la fase estacionaria, la humedad que contienen las fases mvil y
estacionaria, temperatura, el grado de saturacin de la cmara de desarrollo con vapores de la fase
mvil, y el tamao de muestra. En general, no es factible un control absoluto de esas variables. Sin
embargo, Un adecuado control de sus efectos se puede conseguir utilizando un factor de retencin
relativo Rx en lugar del Rf , donde:
Rx =

distancia recorrida por analito .

Distancia recorrida por la
Sustancia de referencia

USO DE PATRONES: Uno de los mtodos que a menudo proporciona una identificacin tentativa de
los componentes de la muestra, consiste en aplicar a la placa la muestra desconocida y disoluciones
de muestras purificadas de las especies que se esperan encontrar en la muestra desconocida. La
coincidencia de los valores Rf entre algunas de las manchas de la muestra desconocida con el de
alguna de los estndares proporciona una gran evidencia para la identificacin de los componentes
de la muestra a analizar. Siempre es necesario una confirmacin; un test de confirmacin adecuado
consiste en repetir el ensayo con diferentes fases mviles y estacionarias, y tambin con distintos
reactivos de revelado.
METODOS DE ELUCIN: La identificacin de los analitos separados tambin se pueden confirmar o
establecer raspando y disolviendo la mancha. En este caso, se raspa la zona de la placa que
contiene el analito mediante una esptula o navaja, y se recoge el solido sobre un papel satinado. A
continuacin se transfiere a un tubo de ensayo u otro recipiente, donde el analito se disuelve con un
disolvente adecuado y se separa de la fase estacionara por centrifugacin o filtracin. La
identificacin se realiza mediante tcnicas como espectrometra de masas, resonancia magntica
nuclear o espectrometra de infrarrojo.
CROMATOGRAFIA PLANA BIDIMENSIONAL: La muestra se coloca en uno de los extremos de la
placa cuadrada y se realiza el desarrollo en direccin ascendente con el disolvente A. A continuacin
se elimina ese disolvente por evaporacin, y se gira la placa 90 , realizando ahora el desarrollo
ascendente con el disolvente B. Tras la eliminacin del disolvente, se determina la posicin de los
aminocidos nebulizando la placa con ninhidrina, reactivo que forma un producto de color rosa a
prpura con los aminocidos. Las manchas originadas se identifican comparando sus posiciones con
la de los productos estndar.

Anlisis Cualitativo: Comparando el rea de la mancha del estndar con la del analito, se puede
hacer una estimacin semi-cuantitativa de la cantidad del componente presente. Se obtienen
mejores resultados si se raspa la mancha de la placa, se extrae el analito del slido que forma la
fase estacionaria, y se determina el analito por algn mtodo fsico o qumico adecuado. Un tercer
procedimiento, consiste en utilizar un densitmetro de barrido que puede medir la radiacin emitida
por la mancha por fluorescencia o reflexin.
MATERIAL:
2 Portaobjetos.
1 Frasco de 250 ml aproximadamente. (frasco de Gerber) con tapn de rosca.
Micropipeta
Perilla
2 vasos de precipitados de 250 ml.
Muestra (Extracto de plantas con pigmeto)
PROCEDIMIENTO.
Para esta prctica se utilizan portaobjetos destinados a microscopa.
Los cuales se pueden recubrir con capas delgadsimas de adsorbentes sin
aplicadores especiales y la ventaja es que se pueden recubrir muestras de 1-20 g en
tiempos cortos de separacin.
Junte por sus caras dos portaobjetos limpios, secos y desengrasados, e introdzcalos
en un frasco de boca ancha (frasco de Gerber) con tapn de rosca en la que vaya una
suspensin previamente bien dispersada de 10 g de gel de slice en 40 ml de metanol.
Enseguida squelos, seprelos y pngalos a secar ; se usa "aire caliente" aplicado en
el fondo. El frasco se tapa cuando no se usa.
Las placas ya secas se activan calentndolas 15 minutos en una estufa a 110C. Las
placas deben conservarse en atmsfera seca, guardndose en una caja. Al usarse a 1 cm del
extremo inferior de la placa se traza con un navaja, una raya, que seala el origen del
cromatograma. Mediante una micropipeta se aplican volmenes de 5 a 10 microlitros
procurando un dimetro de la mancha de 2 mm. La separacin entre las dos manchas
cuando menos debe de ser de 2 cm, conviene delimitarlos con una raya fina que las separa.
Colocada la mancha y seca la placa se coloca a 80C en una cmara cromatogrfica
que previamente se estabiliz metiendo un papel filtro sobreparte de la pared del recipiente.
El disolvente debe quedar a 5 mm debajo de donde estn las manchas. Corra el
cromatograma hasta que el frente del disolvente se aproxima a 15 mm del extremo superior
de la placa. Examnese la "cromatoplaca" a la luz ultravioleta. Despus la placa se trata
con un agente cromognico (un revelador) para investigar algn otro tipo de sustancias no
coloridas.
Como agentes cromognicos pueden ser vapores de I2 o soluciones de CoCl3.

PREPARACIN DEL EXTRACTO

2 gramos de ptalos de rosa previamente triturados (con navaja) se ponen en una
cpsula de porcelana con 2 ml de solucin de HCl disuelto en alcohol absoluto. Luego se
pasa a un tubo de ensaye para centrfuga, se decanta la fase etanlica y se concentra a la
mitad por calentamiento externo con aire caliente, as queda el extracto disponible para
aplicarse.

INVESTIGAR
1.- Cromatografa en capa fina
2.- Seleccin, tipos y usos de soporte (Fase Mvil y fase estacionaria).
3.- Propiedades fisicoqumicas de las sustancias utilizadas, adems de:
Antocianidinas
Antocianinas
Pigmentos Flavonoides
Gel de slice
Pigmentos vegetales
I2 y CoCl3
4.- Aplicacin de la cromatografa de capa fina.
5.- Conseguir ptalos de rosa roja muy intenso (tinto).
6.- Conseguir 2 portaobjetos para microscopa.
7.- Conseguir un frasco de rosca (Gerber).
8.- Conseguir una cpsula de porcelana y agitador de vidrio.