I.

INTRODUCCIÓN

Durante la práctica realizamos el reconocimiento de la actividad biocatalitica de las

enzimas, donde las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica, las cuales
desdoblan polímeros bajo ciertas condiciones de temperatura, pH, concentración, etc. A
este efecto se le denomina “Actividad Enzimática”, para medir el grado de actividad se
recurren a pruebas físicas, químicas, dependiendo del tipo de enzima.
Las reacciones químicas en sistema biológico raramente ocurren en ausencia de un
catalizador. Estos catalizadores se denominan enzimas y son de naturaleza proteica. Para
extraer las enzimas de las células que las contienen, a menudo es necesario dividir
finamente el tejido, por medio de un homogeneizador o una licuadora; los tratamientos más
enérgicos comprenden la molienda del tejido con arena el empleo de vibraciones
ultrasónicas, los procesos alternados de congelamiento y descongelamiento, la autolisis, el
desecado con calor o el empleo de solventes como la acetona, el éter y el tolueno.
El control de la regulación enzimática está asociado con factores reguladores; en algunos
casos se trata de la interacción entre enzima y sustrato. Para el reconocimiento de la
actividad biocatalitica se realizaron métodos experimentales, preparación de las enzimas,
preparación de los sustratos, despolimerización del almidón, despolimerización del gluten
de trigo, despolimerización de la pectina, para los cuales utilizamos enzimas comerciales de
origen microbiano, enzimas de origen fúngico, enzimas de origen vegetal (alfa-amilasa 1%;
biopectinasa al 0.1%; papaína al 5%) esto se dio para la preparación de enzimas, para la
preparación de sustrato, preparamos carne vegetal a base de harina de trigo y agua, en la
cual complementamos con pectina comercial y fécula al 10%, observamos también la
despolimerización del gluten de trigo, con la carne vegetal preparada y la solucion de la
papaína, extraída de la papaya verde. Por último realizamos la despolimerización de la
pectina utilizando pectina en distintas concentraciones, adicionando la enzima biopectinasa.
Estos tipos de métodos experimentales se realizan para reconocer la actividad biocatalitica
de las enzimas.

II. OBJETIVOS.

 Evaluar la actividad biocatalitica de las enzimas de interés en los procesos

agroindustriales
 Reconocer la especifidad amilolitica y proteolítica de enzimas comerciales.
 III. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Extracción De Enzimas

Para extraer las enzimas de las células que las contienen, a menudo es necesario dividir
finamente el tejido, por medio de un homogeneizador o una licuadora; los tratamientos más
enérgicos comprenden la molienda del tejido con arena el empleo de vibraciones
ultrasónicas, los procesos alternados de congelamiento y descongelamiento, la autolisis , el
desecado con calor o el empleo de solventes como la acetona, el éter y el tolueno.

Extracción de la papaína

La papaína que se extrae de la papaya es una enzima proteolítica, es decir, con capacidad
para digerir las proteínas de los alimentos. La papaína se consigue por la extracción del
látex, que es un líquido blanco obtenido mediante cortes en los frutos inmaduros. Luego, en
laboratorio, se separa la enzima y se purifica hasta alcanzar un nivel óptimo de calidad para
la comercialización y uso. La enzima se usa en estado líquido y tiene una duración mínima
de seis meses estando refrigerada.

La cualidad principal de la papaína es el uso como mejorador de las carnes, (ablandamiento

y aclaramiento), y el aclaramiento y evitación de sedimentación en las cervezas por su
acción en los enlaces de las proteínas.

Para la extracción de la enzima desde la cascara se realiza un descortezado, obteniendo un

pellet de 1 a 2 mm. De espesor. Se tritura para favorecer la extracción con buffer. De forma
similar a la anterior se realiza con la semilla el mismo proceso de extracción. La extracción
se realiza con buffer fosfato (Na2HPO4-Ac cítrico) 0.05 N a Ph.7.0.

Fuentes de enzima:

Origen de las enzimas industriales

 Animal
 Vegetal
 Microbiana (90% de enzimas para el procesado industrial)

Enzimas de origen animal:

1. Lipasas, amilasas, proteasas pancreáticas:

 Alfa- amilasa
 Acido graso esterasa carboxílico ester hidrolasa (CE 3.1.1.1)
 Fosfolopasa A2- fosfatidil 2 acil-hidrolasa- (CE 3.1.1.2)
 Quimotripsina (CE 3.4.21.1)
 Tripsina (CE 3.4.21.4)
 2. Esterasas pregastricas: aril ester hidrolasas (CE 3.1.1.2)
3. Pepsina (CE 3.4.23.1) mucosa intestinal
4. Quimosina –renina, cuajo (CE#.4.23.4); abomaso lactantes
5. Otras:
 Catalasa- peróxido de hidrogeno oxidoreductasa (CE 1.11.1.6); hígado de
bovinos,
 Lactoperoxidasa (CE 1.11.1.1): leche de vaca
 Lisozimas- mucopeptido N-acetil muramoilhidrolasa (CE 3.2.1.17): albumen
huevo de gallina.

Enzimas de origen animal (causa de la reducción de su uso)

1. Fabricantes de enzimas deben aceptar precios de las materias primas fijadas por
otros sectores.
2. Variación estacional.
3. Aspectos sanitarios: vehiculacion de virus.
4. Aspectos humanitarios: necesidad del sacrificio de animales.

Enzimas De Origen Vegetal

1. Látex de:
Papaya (carica papaya): papaína (CE 3.4.22.2); 7% proteína soluble son enzimas.
Higuera (ficus glabrata, ficus carica): (ficina (CE3.4.22.3); 90% proteína soluble
son enzimas (n=10)
Piña (ananas corosus); bromelaina (CE 3.4.22.4)
Cardo (cynara cardunculus). Proteasa
2. Cebada malteada:
Alfa-amilasa 1,4-alfa glucanglucano hidrolasa (CE 3.2.1.1)
Beta-amilasa 1,4-beta glucaglucano hidrolasa (CE3.2.1.2)
3. Soja: lipoxigenasa
4. Rábano: peroxidas-peroxido de hidrogeno oxidoreductasa (CE 1.11.1.7)
5. Cítricos: algunas enzimas muy especializadas.

Enzimas de origen vegetal (causas del descenso de su utilización)

1. Producción en regiones tropicales y subtropicales: falta de infraestructura,

inestabilidad económica y política
2. Variaciones estacionales: necesidad de almacenamiento de materias primas:
incremento cortes de producción; inactividad de equipos de extracción de enzimas:
incremento de los costes de producción.
Fuentes De Enzimas De Origen Microbiano

1. Producción a partir del un número limitado de microorganismos: especies Grupo A

y Grupo B
2. Inclusión de nuevas especies productoras: largos tiempos de investigación y fuertes
inversiones económicas. N=25(8 bacterias, 4 levaduras 11 mohos)

BACTERIAS LEVADURAS MOHOS

Thermoanaerobium spp Sacharomyces lactis Aspergillus Níger
Bacillus subtilis Sacharomyces spp Aspergillus oryzae
Bacillus licheniformis Penicillium spp
Pseudomonas aeuroginosa
Clostridium spp
Micriciccus lysodiekticus
Lactobacillus fermentum

Enzimas de origen microbiano (ventajas del uso de microorganismo)

1. Producción de gran números de enzimas

2. Gran numero de enzimas son extracelulares
 Secreción al exterior de la célula: no técnicas de extracción
 Fácil aislamiento por ausencia de interferencias (no gran numero de
proteínas extracelulares)
 En intracelulares: DNA, RNA, enzimas, proteínas
 Alta estabilidad a la desnaturalización (estructura compacta)
3. Fácil y rápido desarrollo de los microorganismos
4. Elevado desarrollo de la tecnología de producción industrial de microorganismo.
IV. MATERIALES Y MÉTODOS

Insumos:

 Enzimas comerciales de origen microbiano: alfa-amilasa de Bacillus

Subtillis
 Enzimas de origen fúngico: Pectinasa de Aspergillus Níger
 Enzima d origen vegetal: papaína de Carica papaya (extracción del látex)
 Fécula de yuca, camote, papa
 Pectina comercial
 Harina de trigo

Materiales:  Agua destilada

 Termómetro Reactivos
 Olla mediana y cocina  Hidróxido de sodio
 Gradilla  Glucosa anhidra
 Fiola de 50 ml  Acido 3,5 dinitrosalicilico
 Baño maría  Tartrato de sodio y potasio
 Tubos de ensayo

Métodos
e
p
d
c
r
l
s
a
m
i
z
n
o
m
p
s
u
e
d
n
o
g
r
t
c
a
z V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Resultado:

Para el reconocimiento de la actividad biocatalitica de las enzimas realizando los siguientes

métodos experimentales, obteniendo los distintos resultados para cada método.
1. Preparación de las enzimas.

 Se preparo una solucion de alfa- amilasa al 1% en 25 ml de agua destilada

 Se preparo la solucion de biopectinasa al 0.1% en 50 ml de agua destilada
 Preparamos la solucion de la papaína al 5% en 50 ml de agua.

Para la extracción de la papaína utilizamos el látex de la carica papaya verde, el cual

realizamos cortes en la cascara de 5 mm de profundidad, obteniendo un jugo láctico al
cual se le conoce como látex, una vez obtenido se utilizo el 5% en 50 ml de agua y así
obtuvimos la papaína.

2. Preparación de los sustratos:

 Con 125 gr de harina de trigo, extrajimos el gluten de la siguiente manera:

Realizamos una masa con harina de trigo + agua, amasamos hasta que la masa sea
elástica y transparente, luego realizamos lavados hasta obtener una masa libre de
almidón, a esto se le conoce como carne vegetal.

 Preparamos la solucion de fécula al 10% en 100 ml de agua

 Preparamos la solucion de pectina comercial al 11% en 100 ml de agua

Utilizamos 3 gr de pectina comercial la cual al mezclarse con agua obtuvimos una

solucion gelatinosa.

3. Despolimerización del gluten de trigo:

 Pesar cantidades iguales de gluten y colocarlos en la luna de reloj

El gluten es la carne vegetal que preparamos, esta pequeña masa lo dividimos en 2 uno
que viene a ser el testigo y el otro se utiliza para comprobar si existe o no actividad
proteolítica.

 Adicionamos 10 ml de la solucion de la papaína

La cual se preparo con 5 gr del látex de papaya en 20 ml de agua

 Registramos los cambios realizamos

A los 30 min. La carene vegetal queda prácticamente disuelta, durante este periodo la
solucion de papaína rompe los enlaces que hace que esta masa sea compacta.

4. Despolimerización de la pectina:
  Colocar 10 gr de solucion de pectina en un vaso de 50 ml
Esta solucion de pectina es aquella la cual preparamos con 3 gr de pectina + agua,
obteniendo una solucion gelatinosa
 Adicionar la enzima biopectinasa en concentraciones 2, 4, 8, 10 ml y hacer
reaccionar por 5 min.
La biopectinasa es preparada al 0.1% en 50 ml de agua, la solucion pectinasa fue
colocada en 4 tubos de ensayo, en la cual adicionamos la solucion biopectinasa en
distintas concentraciones. (2, 4, 8,10 en cada tubo)
 Llevamos a baño maría a 40°C con agitación constante y lenta por 10 min.
Agitamos lentamente cada tubo y observamos los cambios realizados
 Comprobamos el grado de despolimerización (viscosidad, textura,
apariencia) comparando con el testigo.
Comprobamos el grado de despolimerización, según las concentraciones agregadas de
biopectinasa, cada tubito a mas concentración, la pectina de gelatinosa se volvía
liquida, esto se debe a la acción de la enzima sobre la pectina rompiendo los enlaces
1,4.

Color Amarillo débil

Muestra testigo (sin enzima) Textura gelificado
Viscosidad alta
Color Amarillo débil transparente
Muestra (con la
Textura liquido
biopectinasa)
Viscosidad baja

Con todos estos métodos experimentales reconocimos la actividad biocatalitica de cada

enzima utilizada, ya sea de origen microbiano, vegetal o fungi.

DISCUSION

1. Según (Dr. F. Romero Guzmán y Arias Edison - Lastra Jorge. 1997). Proteasa
vegetal como la papaína, pepsina, tripsina; realizan una hidrólisis drástica del gluten
el cual está formado por: Gluteninas: glutelinas de alto peso molecular que al
 hidratarse dan una masa muy tenaz y elástica, debido a la presencia de puentes
disulfuro y, Gliadinas: prolaminas de bajo peso molecular que con agua dan una
masa viscosa poco elástica La papaína es activa dentro del rango de pH de 4 a 11:
sin embargo, su actividad óptima se presenta en un pH de 5 a 6.

 En la práctica al agregar la proteína proteasa vegetal (papaína) en el gluten,

donde se trato de brindarle las condiciones optimas para el desarrollo de su
actividad enzimática, observándose la despolimerización completa
(degradación) a un tiempo de 30 min, observando la actividad proteolitica.

2. Según T.P.COULTATE. 1998, las descripciones más elementales de las pectinas

consideran a éstas polímeros lineales de moléculas de ácido α-D-galacturónico
unidas a través de enlaces 1-4, con determinada proporción de sus grupos carboxilo
esterificados con metanol.

 En la práctica al agregar la enzima biopectinasa en la solución de pectina

(gelificado) en una concentración de 0.1%/50ml a un tiempo de 5 min y a
una temperatura de 40ºC (baño maría), se produjo una despolimerización de
la pectina, observándose la solución fluida. Comprobándose así que al
adicionar esta enzima se produce el rompimiento de los enlaces 1-4; los
cuales fueron mencionados por el autor.

VI. CONCLUSIÓN

 Evaluamos y reconocimos la actividad biocatalitica de las enzimas en sus

distintos orígenes, teniendo conocimiento que las más utilizadas en la
agroindustrias son las enzimas de origen microbiano, siendo estas 25, 8
 bacterias 4 levaduras y 11 mohos, sin embargo existen también numerosas
enzimas de otros orígenes, en el caso de la agroindustria, las enzimas se
utilizan en determinados procesos cumpliendo así un desarrollo adecuado.

 Durante la práctica reconocimos las distintas actividades de las enzimas

comerciales, la cual se vio con mayor énfasis en la despolimerización del
gluten de trigo, al mezclar este gluten con la enzima de origen vegetal
(papaína), observamos los cambios físicos realizados y comprobamos así la
actividad proteolítica. De la misma forma observamos la actividad
pectinolitica que se dio en la despolimerización de la pectina, utilizando
pectina comercial y la enzima de origen fúngico (biopectinasa)

VII. RECOMENDACIONES

 Como consumidores es recomendable conocer la actividad de las enzimas utilizadas

en distintos productos que podemos consumir.
 Durante la práctica es recomendable, conocer sobre los temas a tratar, y utilizar los
instrumentos y métodos necesarios.
 Como ingenieros alimentarios es recomendable conocer las enzimas de distintos
orígenes (microbiano, fúngico, vegetal) y la actividad biocatalitica que estas
enzimas realizan en distintos procesos que se dan durante la elaboración de un
producto.

VIII. BIBLIOGRAFÍA

 http://www.unne.edu.ar/Web/cyt/cyt/2000/8_exactas/e_pdf/e_022.pdf
 tema02fuentedeenzimas.pdf adobe reader
 http://es.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_enzim%C3%A1tica
 IX. ANEXOS

Fig. 1 extracción del Fig.

gluten
2 extracción
a del látex de Fig. 3 despolimerización del
partir de la harina de
la trigo
papaya para la elaboración gluten de la harina de trigo
de la papaína
Fig. 4 preparación de pectina Fig. 5 adición de la enzima Fig. 6 llevando a baño maría
comercial y enzima en la solución de pectina en para observar la acción de la
biopectinasa distintas concentraciones enzima

Fig. 7 comprobando la
despolimerización del gluten
de trigo con la acción de la
enzima vegetal

X. CUESTIONARIO

1. Cuál es el principio del modo de acción del acido 3,5-diotrosalicilico?

El ácido 3,5 dinitrosalisilico (solución de 1g de ácido dinitrosalicílico se disuelve en 20 ml

de NaOH2N y 50 ml de agua, se agregan 30 g de sal de Seignette (tartrato de Na y K) y se
diluye a 100 ml, protegiéndola del CO2) al reaccionar con el azúcar reductor da una
coloración rojiza en función a la concentración de glucosa. La utilización de este ácido
debe hacerse en ambientes protegidos (de baja intensidad de luz), para evitar reacciones
adversas.

2. Como se explica las fases de la cinética enzimática durante la acción

biocatalitica

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones químicas que son catalizadas
por las enzimas. El estudio de la cinética enzimática nos ayuda a explicar los detalles de su
mecanismo catalítico, y el papel que cumple en el metabolismo, cómo es controlada su
actividad en la célula y cómo puede ser inhibida su actividad por fármacos o venenos o
potenciada por otro tipo de moléculas.

Aunque las leyes generales de la catálisis debieran ser válidas para las enzimas, el hecho de
que éstas sean sustancias complejas, de alto peso molecular, de tamaño coloidal y de
composición difícil de precisar, impide la aplicación de dichas leyes de una manera estricta;
por ejemplo, su tamaño coloidal puede causar fenómenos de adsorción o diversas
reacciones debidas a sus numerosas cargas eléctricas. No obstante, los factores que afectan
la velocidad de la reacción enzimática son los ya señalados a propósito de las reacciones
químicas en general, como la temperatura y las concentraciones de las sustancias
reaccionantes que, en este caso particular, son la enzima el sustrato. Además intervienen el
PH medio donde se realiza la reacción, la presencia de los productos de la reacción, y otros
factores secundarios como las radiaciones y los efectos óxido – reductores.
3. Explicar el mecanismo de acción biocatalitica de las enzimas en sus respectivos
polímeros.

Las alfa -amilasas permiten la transformación del almidón en dextrinas que son moléculas
de azucares menos complejas. A su vez las beta-amilasas, continúan la transformación de
las dextrinas y las convierten en maltosa.

UNIVERSIDAD NACIONAL DANIEL ALCIDES CARRIÓN

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
EFP. INGENIERIA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
FILIAL-LA MERCED

“RECONOCIMIENTO DE LA ACCION
BIOCATALITICA DE LAS ENZIMAS”

CATEDRA:

BIOTECNOLOGÍA DE ALIMENTOS

CATEDRATICO:

Mg/Ing. ANTONIO OTAROLA GAMARRA

ALUMNOS:
  MIRANDA CAMACHO, Katherinne Tatiana

CICLO:

“VIII”

LA MERCED

2010