EXTRACIÓN, CUANTIFICACIÓN Y PURIFICACION DE LA PAPAINA DE LA

Carica papaya
Gutiérrez J., Loza M., Saire S., Vargas J.
RESUMEN
La papaína es una enzima proteolítica que se halla en el fruto del papayo, se
obtiene a partir del látex y de su semilla, este tiene diferentes usos industriales:
como ablandador de carnes, en cosméticos como aclarador de manchas y
cicatrizante, en laboratorios oftalmológicos para fabricar tabletas para limpieza de
lentes de contacto, la extracción se realizó a partir del secado del latex y la semilla
del fruto, para luego realizar las pruebas de identificación.
Esta investigación tiene como objetivo la extracción, cuantificación y purificación de
la papaína a partir del látex y la semilla de la (Carica papaya) papaya.
La investigación fue realizada en varias etapas, la primera se basó en obtención de
la materia prima (papayas inmaduras), segunda aislamiento del látex y por medio
de cortes longitudinales, el tratado de la semilla fue distinto, se realizó un secado
para posterior agregado de buffer fosfato citrato para su precipitación con solventes
orgánicos y posterior secado, por último se realizó las pruebas de identificación a
partir de los aminoácidos más abundantes de la parte externa de su estructura, así
poder tener la certeza de que la extracción fue exitosa.
Las pruebas de identificación nos dieron resultados positivos confirmando la
existencia de la enzima, por último se llevó a cabo la cuantificación, a partir de la
realización de una curva de calibración de Biuret. La extracción, cuantificación y
purificación de papaína de la Carica papaya por el método elegido resulto una forma
óptima en la que se puede obtener papaína purificada ya que al realizar todo el
procedimiento se tiene como un resultado final la enzima de una forma neta.

PALABRAS CLAVES: Extracción, papaína, enzima proteolítica.

EXTRACTION, QUANTIFICATION AND PURIFICATION OF THE PAPAIN OF

THE Carica papaya

ABSTRACT
Papain is a proteolytic enzyme found in the fruit of the papaya, it is obtained from
latex and its seed, it has different industrial uses: as a meat tenderizer, in cosmetics
as a spotting and healing agent, in ophthalmological laboratories for To make tablets
for cleaning contact lenses, the extraction was made from the drying of the latex and
the seed of the fruit, to then carry out the identification tests.
The objective of this research is the extraction, quantification and purification of
papain from latex and seed of the (Carica papaya) papaya.
The investigation was carried out in several stages, the first one was based on
obtaining the raw material (immature papayas), second isolation of the latex and by
means of longitudinal cuts, the treated of the seed was different, a drying was carried
out for later addition of citrate phosphate buffer for its precipitation with organic
solvents and subsequent drying, finally the identification tests were made from the
 most abundant amino acids of the external part of its structure, thus being able to
have the certainty that the extraction was successful.
The identification tests gave us positive results confirming the existence of the
enzyme, finally the quantification was carried out, from the realization of a Biuret
calibration curve. The extraction, quantification and purification of papain from
Carica papaya by the chosen method resulted in an optimal form in which purified
papain can be obtained since the whole process results in a final result of the enzyme
in a net form.

KEYWORDS: Extraction, papain, proteolytic enzyme.

INTRODUCCIÓN
La Carica Papaya L., comúnmente
llamada lechosa es una fruta cultivada en
países tropicales de alto consumo a nivel
mundial. Es una baya de tamaño y forma
variable, con una pulpa dulce de color
amarilla o rojo-naranja. La lechosa
contiene un líquido lechoso y blanco
llamado látex, que va desapareciendo a
medida que la fruta madura. Éste líquido
se emplea usualmente, para la obtención
de papaína. Sin embargo, no sólo el látex
de la lechosa contiene papaína, de hecho
todas las partes de la fruta contienen
papaína, y una fuente potencial de ésta
son las semillas cuya ventaja es el
aprovechamiento de un desecho a nivel
comercial.
Para la investigación del presente trabajo
se planteó las siguientes hipótesis:
H1: Existe mayor concentración de
papaína en el látex extraído de la
papaya.
H2: Existe menor concentración de
papaína en la semilla extraído de la
papaya.
Estas hipótesis se formularon a partir de
revisiones bibliográficas previas.
MARCO TEÓRICO
La lechosa Carica Papaya es una baya
de tamaño, peso y forma variable, ya que
depende de la variedad o selección. Mide
de 10 a 60 cm de largo, siendo el color
de la pulpa también variable con la
selección, normalmente es amarilla o
rojo-anaranjada, de textura suave y de un
espesor de 3 a 5cm. En la superficie del
fruto se puede encontrar surcos poco
profundos, la piel del fruto es suave y
contiene un líquido lechoso y blanco
llamado látex, que al ir madurando el
fruto éste va desapareciendo, la cáscara
se torna de verde oscuro a verde claro y
luego a amarillo-dorado. Las semillas se
encuentran dentro de la cavidad interna
del fruto, éstas son esféricas, pequeñas
y negras y están envueltas en una capa
mucilaginosa llamada sarcotesta o
cubierta (Fundación del Desarrollo
Agropecuario, 1998).
La papaína
La papaína es una enzima sulfhídrica,
sabiendo que las enzimas son
biocatalizadores que aceleran las
reacciones químicas, estas moléculas
proteínicas energizadas son necesarias
prácticamente para todas las actividades
bioquímicas que se llevan a cabo en el
organismo, si no fuera por su acción
catalítica la mayoría de las reacciones
serían demasiado lentas para sostener la
vida. Ésta enzima se extrae comúnmente
del látex de la papaya (Carica papaya L)
donde se encuentra en una
concentración aproximadamente de
10% .Uno de los primeros científicos en
caracterizar a la papaína fue Balls, quien
en 1937 logró aislar y cristalizar esta
enzima, desarrollando un proceso para la
purificación y el aislamiento de la
papaína en el estado cristalino nativa a
partir de látex fresco. Sin embargo, este
método fue posteriormente modificado
por Kimmel & Smith en 1954, utilizando
látex seco disponible en el mercado y ha
sido el método clásico para la
preparación de la papaína durante
muchos años. Actualmente, esta enzima
se encuentra disponible de manera
comercial y usualmente, se purifica
mediante columnas de afinidad. Algunas
de sus propiedades fisicoquímicas son:
masa molecular de 23.350 Da, punto
isoeléctrico de 8.75 y coeficiente de
extinción molar de 2.5 mL mg-1 cm-1 a
278 nm. La actividad óptima de la
papaína se encuentra en un intervalo
amplio de pH, entre 6.5 y 7.8, mientras
que con respecto a la temperatura, un
incremento muy elevado favorece a la
desnaturalización y consecutivamente la
proteína pierde su capacidad catalítica,
por esta razón cada enzima tiene un
intervalo óptimo de temperatura. Para la
papaína el incremento de temperatura
favorece su actividad enzimática, hasta
llegar a la temperatura de máxima
actividad que corresponde a 60 °C. A
temperaturas mayores su actividad
enzimática disminuye, hasta
desnaturalizarse a más de 85°C. La
papaína posee una alta termo
estabilidad, 70% de actividad enzimática
a 70°C, propiedad que la hace
interesante como proteasa de alto
espectro. La papaína pura, es una
proteína constituida de 212 residuos de
aminoacidos. Estos residuos se localizan
enrollados en dos partes separadas por
un puente que tiene un lugar activo con
un grupo tiol (SH) libre de un residuo de
cisteína, de ahí proviene su nombre de
cistein-proteasa. Esta molécula es
similar a la proteasa humana, se
estabiliza debido a la presencia de
puentes disulfuro formados por enlace de
aminoácidos cisteína en su estructura. A
continuación se muestra la Figura N°1,
donde se tiene la Estructura
cristalográfica de la papaína. Se observa
a la derecha el dominio I
predominantemente hélice α y a la
izquierda el dominio II hoja β, así como
residuos de aminoácidos responsables
de la actividad.
Figura N° 1: Estructura cristalográfica de la
papaína.
La estructura tridimensional de la
papaína ha sido determinada por
cristalografía de rayos X a diferentes
resoluciones. Uno de sus dominios se
caracteriza por tener estructura
secundaria de tipo hélice α (residuos 10
a 111 y 208 a 212), mientras que el otro
dominio está formado por giros y hojas β
(residuos 1 a 9 y 112 a 207). En su
estado nativo, el interior de cada uno de
sus dominios contiene cadenas de
aminoácidos predominantemente no
polares, no obstante en la interface
también existen aminoácidos polares. La
conformación en dos dominios
estructurales es una característica
común en las proteasas cisteínicas; sin
embargo, el número de aminoácidos no
polares presentes en la interface varía de
manera considerable en cada uno de los
miembros de esta familia. También,
cerca de la interface se localizan los
residuos de aminoácidos que conforman
el sitio activo de esta macromolécula
Cis25, His159 y Asn175.
Actividad enzimática de la papaína
La papaína incluye endopeptidasas,
aminopeptidasas, dipeptidil peptidasas y
otras enzimas con actividades tanto exo-
peptolíticas como endo-peptolíticas.
Las propiedades peptolíticas de la
papaína provocan la ruptura de múltiples
enlaces en las proteínas animales, lo que
tiene por consecuencia que se pueda
utilizar para ablandar la carne destinada
al consumo humano. La papaína también
hidroliza proteínas vegetales, y es útil
para evitar la formación de los
sedimentos proteicos que produce la
proteína de la cebada en el proceso de
fabricación de cerveza. También posee
propiedades antiinflamatorias cuando es
consumida directamente, por lo que los
frutos que la contienen han sido usados
como medicamento natural.
Pruebas específicas de identificación
Reacción Xantoproteica: La prueba
consiste en adicionar ácido nítrico
concentrado a la proteína. La proteína
toma entonces color amarillo y precipita.
La reacción xantoproteica es positiva
para las proteínas que contienen
aminoácidos aromáticos como la tirosina,
la fenilalanina y el triptófano. Las
proteínas que contengan éstos
aminoácidos aromáticos, darán positiva
la prueba y experimentarán
adicionalmente desnaturalización e
hidrólisis parcial.
Reacción de Biuret: consta de una
molécula formada por dos de urea,
caracterizada estructuralmente por la
presencia del enlace peptídico. Esta es
la molécula más sencilla que reacciona
con el catión cúprico en medio alcalino.
La reacción es común a todos los
compuestos que tengan dos o más
enlaces peptídicos en la estructura. El
reactivo de Biuret está formado por
sulfato cúprico, en un medio fuertemente
alcalino. Una proteína en suspensión a
la que se le agrega el reactivo de Biuret,
produce un color violeta debido a la
formación de un complejo de
coordinación entre los iones cúprico
(Cu+2) y los pares de electrones libres de
los nitrógenos que forman parte de los
enlaces peptídicos:
Reacción de sales metálicas: Las sales
de metales pesados, como el cloruro de
mercurio y el nitrato de plata, precipitan
las proteínas. Como las proteínas tienen
conductas de zwiteriones, se ionizan
como cargas negativas en soluciones
neutras o alcalinas.
METODOLOGÍA:
a)Tratamiento de la materia prima
Se seleccionó payayas inmaduras para
realizar este estudio, ya que es una
variedad adecuada para la recolección.
Para la obtención del látex se realizó la Cuadro N°1: Concentración y
limpieza del fruto para remover las absorbancias a partir del reactivo de
impurezas que puedan afectar la calidad, Biuret.
con agua y toallas de papel, para la
recolección se utilizaron cuchillas de Concentración
acero inoxidable, realizando cortes (mg/ml) Abs.
longitudinales de 2mm de profundidad. 1 0,092
Se recolecto 8ml de látex y 4,285g de la 2 0,151
semilla seca y triturada del fruto. 3 0,21
b) Extracción de la papaína 4 0,266
A ambas muestras se le agregó el buffer
ácido cítrico fosfato ácido de disodio,
EDTA 0,1N de pH: 6,5. Se Centrifugo Grafico N°1: Curva de calibración de
6000rpm., a una temperatura de 10°C, Biuret
durante 5 minutos. Posteriormente se
desechó el precipitado y se trabajó con el
sobrenadante, Añadiéndole etanol 98° y
se mezcló nuevamente se Centrifugo a
(6000rpm) a una temperatura de 10°C,
durante 5 minutos. Desechando el
sobrenadante se secó el precipitado. Con
un Tiempo de secado = 18 horas a
35,5°C.
c) Pruebas específicas de Ecuación de la curva de calibración y
identificación coeficiente de Pearson.
Para determinar la presencia de la Y= 0,0345 +
enzima se tomaron tres pruebas de 0,0581x
identificación específicas para ambas r=0,9999
muestras extraídas:
 Reactivo de Biuret. En el cuadro N°1 se observa las distintas
 Prueba Xantoproteica. concentraciones y absorbancias que se
 Precipitación por sales metálicas. obtuvieron a partir de una solución madre
de concentración 5mg/ml de BSA. Se
c) Cuantificación:
trabajó con cuatro puntos de
Se realizó una curva de calibración con concentraciones conocidas, mismas que
el reactivo de biuret ya que esta se se llevaron a una lectura a una longitud
caracteriza por formar complejos de onda de 540nm en un
coloreados con proteínas. Dicha curva se espectrofotómetro (UNICO).
usó para la determinación de
En el grafico N°1 se observa la
concentraciones mg de papaína por ml
intersección entre la concentración y
de muestra.
absorbancia y sus correspondientes
RESULTADOS Y DISCUSIÓN. puntos que muestran la relación de
Lambert y Beer, a mayor concentración comparar la eficacia del método de
mayor absorbancia. extracción de se realizó una comparación
entre el método usado por A. Yugcha, J.
La curva de calibración tiene un
Kure, P. Castillo que cita que obtuvo 4,46
coeficiente de relación de 0,999, misma
g/ml esto nos indica que la obtención por
que nos indica la relación lineal entre las
este método es mayor respecto al
dos variables
método realizado
Cuadro N°2: Concentración hallada a
En el gráfico N° 2 se observa cómo se
partir de la absorbancia
determinó las concentraciones
Concentración desconocidas de papaína en las
(mg/ml) Abs. muestras de látex y semillas mismas que
1 0,092 entran en el rango de la curva teniendo
2 0,151 como puntos limites 0,092 a 0,266
2,143 0,159 unidades de absorbancia. En dicho
2,353 0,171 grafico se observa que existe mayor
3 0,21 concentración de la enzima en la semilla
4 0,266 de la papaya que en el látex. Lo cual
refuta las hipótesis planteadas
anteriormente.
Cuadro N°3: Identificación de
Grafico N°2: Curva de calibración de aminoácidos a partir de distintos
Biuret e interpolación de datos reactivos.

Muestra Muestra
PRUEBAS del látex de las
pepas
REACTIVO DE positivo positivo
BIURET
PRUEBA positivo positivo
XANTOPROTEIC
A

En el cuadro N°2 representa las SALES positivo Positivo

METÁLICAS
concentraciones de papaína de las dos
muestras, látex y semilla estas presenta
una concentración de 2,143 mg/ml y
El cuadro N°3 se muestran los
2,353mg/ml respectivamente, estos
resultados de las pruebas realizadas a
datos se obtuvieron por interpolación a las dos muestras:
partir de las absorbancias que
presentaron, las mismas fueron leídas a Reactivo de Biuret: ambas muestran un
la misma longitud de onda de la curva de complejo coloreado lila, lo cual nos indica
calibración de Biuret. Para verificar y
 la presencia de proteínas en las Caracterización y Comparación de Látex
muestras. Obtenido, en Secado por Aspersión, de
tres Variedades de Papaya (Carica
Prueba Xantoproteica: en ambas papaya L.)”. (Tesis presentada en la
muestras se observó un complejo de Escuela Superior
color amarillo, esto nos indica que existe Politécnica del Litoral para la obtención
presencia de grupos aromático en la del Título de Ingenieras de Alimentos,
enzima 2012)
BACHMAN, K. Biología para médicos.
Prueba de precipitación por sales Editorial Reverté S.A, Barcelona-
metálicas: en esta prueba se observó España, 1978. Págs. 27-30
que en ambas muestras hubo un BADUI, Salvador. Química de los
precipitado de las sales metálicas esto Alimentos. Segunda Edición. Editorial
nos indica presencia de cisteína. Alhambra Mexicana, México D.F.-
México, 1990. Pág. 123 –293
Cuadro N°4: Análisis organoléptico de
BERINGER, Paul. Remington: The
muestra de carne Science and Practice of pharmacy. 21
Enzimas Sabor Olor Color Textura edition. Lippincott Williams & Wilkins,
papaina USA, 2005. Pág. 904.
A partir Sabor Suave Mas Suave BERNAL, J.; TAMAYO, A.; et al.
del látex a blanca Frutales de Clima Cálido. Cartilla
papaya divulgativa, Corporación Colombiana de
A partir Normal normal Más Suave Investigación
de la un oscuro Agropecuaria, Colombia, 2001. Pág. 4
pepa poco CHAVERRI,Alejandra. “Comparación
blando
de la actividad proteolítica de la papaína
secada por diferentes métodos” (Tesis
Como se puede observar ambas presentada en la Universidad de Costa
muestras de enzimas actuaron en las Rica para la obtención del Título de
muestras de carne, donde se identificó Tecnóloga
en Alimentos, 1983)-142
un grado más alto de cocción en la carne
tratada con la enzima respecto a aquella
que no se trató con la papaína.
Estas apreciaciones coinciden con la
revisión bibliográfica y su conocido uso
en la gastronomía para tratar carnes y
otros, lo cual impulsa a la investigación
de nuevas estrategias de extracción más
sencillas, rápidas y de mayor eficacia.
BIBLIOGRAFIA
 ARANA, P.; QUIJANO, M.
“Extracción,