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EXTRACCIN DE LA ENZIMA PAPANA A PARTIR DE PAPAYA

1. Objetivos.

Obtencin la enzima papana a partir de la fruta papaya.


Evaluacin de su actividad enzimtica de la papana extrada.
Diferenciar el cuajo artificial con el cuajo vegetal (papana) en la
elaboracin de queso.

2. Introduccin
La industrializacin de frutas en nuestro pas est limitada hacia la
exportacin de jugos, concentrados, conservas
considerar

otros principios

activos

que

contienen

mermeladas,
las

frutas

sin
como

subproductos, sean estos proteicos o enzimticos los cuales pueden ser


usados como colorantes, clarificantes, saborizantes y coadyuvantes de
ciertas reacciones qumicas en la elaboracin de otros productos.
En el continente Americano son los mayores productores de
papana

extrada

del

fruto

papaya.

Es por

eso

que

la
el

enzima
objetivo

principal de este trabajo es determinar la existencia de la papana en la


papaya (Carica-Papaya) estableciendo una comparacin entre

las dos

enzimas, el grado de efectividad y el costo en su extraccin, de ser


efectivo y rentable esto evitar la importacin de materia prima de
mayor

costo, de

esta

forma

se brindar una nueva alternativa de la

obtencin de la enzima papana del fruto.

3. Materiales y Mtodos
3.1. Materia Prima.
La papaya es conocida como
fruta

de

consumo,

tanto

en

forma directa como en jugos y


dulces (elaborados con la fruta
verde cocinada con azcar), y
tiene

unas

propiedades

para

magnficas
facilitar

la

digestin de alimentos de difcil asimilacin, debido a su alto


contenido de papana.
De esta enzima llamada papana se producen ms de 1000 toneladas
anuales en el mundo entero. La utilidad de dicho producto derivado
est en la fabricacin de cerveza, cosmticos e industria alimenticia.
Es

eupptico-digestivo,

antiinflamatorio,

coadyuvante

de

antihelmntico.

son vermfugo, emenagogo.

la

cicatrizacin;

Las

semillas

Especialmente

interesantes

contraancylostomas, scaris, trichuris y strongyloides.


Indicado

para

arteriosclerosis

dispepsias

hipo

embolismos.

trombo

secretoras.

Prevencin

Parasitosis

de

la

intestinales.

Tpicamente es usado para heridas y ulceraciones trficas con restos


inflamatorios o necrticos, fornculos.
Al manipular la papana en polvo se deben proteger los ojos, por la
posibilidad de produccin de ulceraciones corneales, debidas a su
accin queratoltica.
Se usa el ltex, obtenido por incisin de los frutos.
Su

composicin

nutritiva

incluye

protenas, carbohidratos,

vitaminas, calcio, potasio y fosforo considerndose una fruta con


altas

propiedades nutritivas, al

igual que en su composicin

los

frutos inmaduros tienen tal vez el ms alto contenido de una


enzima proteoltica conocida como enzima papana muy utilizada
actualmente en diferentes industri as a nivel mundial
Entre

los

componentes

enzimticos

que

posee

la

papaya

(Carica-Papaya) antes que comience su maduracin. La papana,


se caracteriza
blanco,

por

grisceo

ser

un polvo amorfo,

o parduzco;

granuloso de

ligeramente

color

higroscpico

insoluble en agua y en la mayora de solventes orgnicos. Es


soluble en alcohol etlico y metlico. La papana bruta, contiene un
poco de agua, glcidos, cidos orgnicos y una mezcla de enzimas,
dnde destacan las denominadas proteasas que actan rompiendo
los enlaces peptdicos en cualquier lugar de la cadena peptdica

en la que se hallen situados (endopeptidasas).Tambin contiene


pequeas cantidades de otros enzimas: papaya peptidasa A, lipasa
y lisozima (enzima que rompe las paredes de las clulas bacterianas).

Se compr 5 kilos de papaya

tuvo que estar dura y

completamente verde no tuvo que haberle pasado el frio


3.2. Factores de calidad para la obtencin de la papana:
Los siguientes son los factores que definen la calidad de la
papaya apta para la recoleccin de su ltex:
a) Estado de madurez.- entre 9-14 meses de plantacin -Tamao
adecuado: papaya tamao mediano (tipo hawaiana) La
bibliografa recomienda que las condiciones ambientales para
la recoleccin del ltex sean: -Hora de recoleccin: entre 5-9
am -Condiciones de trabajo: evitar contacto prolongado con el
ambiente.
b) Almacenamiento del ltex recolectado.- envases de plstico.
c) Color blanco.- un cambio a pardo claro-oscuro indica la
desnaturalizacin del enzima. Esta caracterstica sensorial es
una forma rpida y eficaz acerca de la calidad del ltex
despus de un periodo de almacenamiento.
d) Olor cido.- La oxidacin adems de producir un cambio de
color en el ltex tambin produce un olor a sulfuro de
hidrgeno; esta es otra alternativa para evaluar la calidad del
ltex

3.3. Mtodos Experimentales


3.3.1. Extraccin del Ltex de la fruta

Limpiar y desinfectar el rea de trabajo y los utensilios a

utilizar para el proceso de extraccin del ltex.


Colocarse guantes plsticos desechables para evitar alguna

irritacin en la piel.
Para la extraccin del ltex de papayas se seleccionan

frutos verdes y completamente desarrollados.


Lavar las frutas de papayas que van a ser utilizadas para el
proceso,

secarlas

bien

con

papel

toalla

para

evitar

contaminaciones.
Pesar las frutas

rendimiento del ltex extrado una vez procesado.


El fruto puede recibir varias incisiones repetidamente a

las

papayas,

para determinar

el

intervalos de tres a cinco das, hasta que la aparicin

del ltex comience a disminuir.


Todas las incisiones deben ser hechas verticalmente y
no ms de 4 sangras deben hacerse a un fruto al mismo

tiempo, de 1 a 2 mm de espesor cada incisin.


Se colocan recipientes bajo las frutas

para

la

recepcin del ltex y su concentracin. Estos pueden


ser de diferentes materiales o formas.

Se obtuvo 30 mililitros de esta enzima para 5 kilos de papaya


arequipea

3.3.2. Procesamiento del ltex.


El ltex debe ser procesado

inmediatamente despus de

ser extrado del fruto, ya que el objetivo principal

es

preservar la actividad proteoltica de la enzima.


Para la operacin de secado debe transcurrir el menor
tiempo posible despus de la recoleccin, a fin de que la
actividad del ltex no disminuya. El secado se puede hacer
de diferentes formas: a pleno sol, utilizando una estufa, un
secador de cabina con bandejas, o cualquier otro tipo de horno
o fuente de calor.
A continuacin detallare cada uno de los pasos a seguir en el
procesamiento del ltex con el secado con estufa.

Prender la estufa a una temperatura de 50 C.


Pesar la caja petri.
Una vez el ltex extrado en una caja petri, colocarlo en
la estufa por aproximadamente 3 a 4 horas dependiendo
de la cantidad de ltex.

Chequear cada determinado tiempo el ltex dentro de la

estufa.
En el momento en el que el ltex no se pegue y este en
forma granulada, esto quiere decir que el proceso de
secado ha finalizado.

Pesar la caja petri con el ltex ya seco.

Colocar el polvo en un mortero y molerlo, hasta que los


grnulos de ltex seco se pulvericen.

Colocar el polvo en un recipiente de vidrio oscuro bien

sellado.
Colocar el recipiente en la refrigeradora, para un mejor

mantenimiento de la enzima.
Para el caso del laboratorio tuvo una duracin de 30
minutos

para

extraer

5gr

de

la

enzima

aproximadamente

4. Determinacin de Actividad Enzimtica.


Para la determinacin de la actividad enzimtica, se detallaran a
continuacin

los

dos

mtodos,

utilizados

para

comprobar

la

existencia de la enzima papana y su efectividad.


1. Mtodo de coagulacin de leche (Balls and Hoover).
Hay diferentes mtodos de comprobacin de actividad de una
enzima. Este mtodo confa en la capacidad de la papana
en coagular la leche, los anlisis se realizaran en 2 litros
de leche deshidratada (comprado en la feria del altiplano), a
diferentes concentraciones de papana (0.25, 0.5, 1 y 2)
gramos por mililitro de cido actico, una vez preparada la
solucin de papana con cido agregar a la leche (2, 4, 6 y 7)
mililitros respectivamente
Esterilizar los instrumentos que se van a utilizar en el
autoclave por 45 minutos, y luego colocarlos en la estufa a

120C por 30 minutos para eliminar residuos de agua. Se deja


enfriar a temperatura ambiente (28 2 C).

Comprar 2 litros de leche (producto de la fra del

altiplano).
calentarla a 30C en un bao de agua y mantener esta

temperatura, en una cocineta elctrica.


Pesar las diferentes cantidades del polvo de ltex seco

(0.25, 0.5, 1 y 2) gramos por mililitros de cido actico.


A una cantidad determinada de leche (30 mililitros),
agregar las cantidades de la solucin de ltex seco

diluido en cido actico (2, 4, 6 y 7) mililitros.


Mezclar el contenido a fondo y controlar el tiempo
que demora para detectar la coagulacin de la leche

(formacin de cogulos).
El tiempo tomado para alcanzar esta etapa, de cuando el
polvo de ltex seco diluido, se registra para cada uno de

los experimentos.
Las diversas cantidades de muestra del polvo de
ltex

seco

usado

deben

dar

una

gama

de

los

tiempos de coagulacin entre 20 y 150 segundos para


los resultados ptimos.

2. Mtodo de determinacin de protenas en Leche.


Este mtodo se basa en la descomposicin de los compuestos de
nitrgeno orgnico por ebullicin con cido sulfrico. El hidrgeno
y el carbn de la materia orgnica se oxidan para formar agua
y dixido de carbono. El cido sulfrico se transforma en sulfato, el
cual reduce el material nitrogenado a sulfato de amonio.
El amonio se libera despus de la adicin de hidrxido de sodio
y se destila recibindose en una solucin de cido sulfrico

0.1N. Se titula el nitrgeno amoniacal con una solucin valorada


de hidrxido de sodio 0.1N. En este mtodo se usa el sulfato de
cobre como catalizador y el sulfato de sodio para aumentar la
temperatura de la mezcla y acelerar la digestin.
Este

mtodo

consta

de

tres

etapas,

la

primera etapa

preparacin de la muestra, segunda etapa procedimiento para la


digestin y por ltimo la tercera etapa el procedimiento para la
destilacin.
Primera etapa.

Agregar al tubo de digestin 15 g de sulfato de sodio y 0,5 g

de sulfato de cobre pentahidratado.


Calentar la leche a 38C 1C.
Mezclar la muestra para homogenizar.
Pesar 5ml 0,1ml de la muestra caliente e inmediatamente

colocarla en el tubo de digestin.


Adicionar 25ml de cido sulfrico.

Segunda etapa.

Al inicio se fija una temperatura baja en el equipo de digestin

(180 a 230C) para evitar la formacin de espuma.


Se colocan los tubos, con el extractor conectado en el
equipo de digestin. El vaco debe ser suficientemente bueno

para eliminar los vapores.


Digerir por 30 minutos o hasta que se formen vapores blancos.
Incrementar la temperatura de 410 a 430C y digerir hasta
que se aclare la solucin. Podra ser necesario incrementar la
temperatura en forma gradual, cada 20 minutos, para el

control de la espuma.
Evitar que la espuma dentro del tubo alcance el extractor
o llegue a una distancia de 4-5cm del borde superior del

tubo.
Despus de que la solucin se acabe (cambie de color azul
claro a verde), contine en la ebullicin cuanto menos por una

hora.
El tiempo aproximado de digestin es de 1,75 a 2,5 horas. Al
trmino de la digestin, la solucin debe ser clara y libre de
material sin digerir.

Enfriar la solucin a temperatura ambiente (aproximadamente

por 25 minutos).
La solucin digerida

debe

ser

lquida

con pequeos

cristales en el fondo del tubo (la cristalizacin excesiva


indica poco cido sulfrico residual al fin de la digestin
y podra generar bajos resultados. Para reducir las prdidas
de cido durante la digestin, reducir la tasa de extraccin de

vapores).
Despus de enfriar

la solucin a temperatura ambiente,

adicionar 200ml de agua (el blanco puede requerir 150ml)


a cada tubo, tape para mezclar y deje enfriar a temperatura

ambiente.
Cuando se adiciona agua a temperatura ambiente se pueden
formar algunos cristales, para despus integrarse nuevamente

a la solucin; esto es normal.


Los tubos se pueden tapar para llevar a cabo la destilacin
posteriormente.

Tercera etapa.

Coloque la solucin de hidrxido de sodio al 45% en el

depsito de lcali de la unidad de destilacin.


Ajuste el volumen de dosificacin a 70ml de hidrxido de

sodio.
Coloque el tubo de digestin que contiene la solucin en la

unidad de destilacin.
Coloque un matraz Erlenmeyer de 500ml con 50ml de la
solucin de cido sulfrico 0.1N con indicador (rojo de metilo)
sobre la plataforma de recepcin, asegurndose que el tubo
del condensador se encuentre dentro de la solucin de cido

sulfrico.
Destilar hasta obtener un volumen de 150ml.
Retirar el matraz de recepcin.
Titular el destilado con hidrxido de sodio 0.1N utilizando

el indicador de Wesslob o el potencimetro.


Registrar el volumen utilizado de hidrxido de sodio con una
exactitud de 0,05ml.

5. Resultado.

5.1. Extraccin de Papana.


En el proceso de extraccin del ltex de la papaya se obtuvo la
siguiente tabla.

Cantidad

de

Papaya
2
2

Peso (lb)
5.5115
5.5115

Gr de latex

Tiempo

seco
2.9852
3.0015

secado
3.45 h
3.55 h

de

Humedad %
4.3
4.5

5.2. Anlisis de Actividad Enzimtica de la papana de la


Papaya.
En

los

anlisis

de

actividad

enzimtica

con

el mtodo de

coagulacin de leche (Balls and Hoover), se obtuvo una gama de


tiempos de coagulacin a las diferentes comparaciones de enzima
papana adicionada a la leche, observando que a medida que
aumenta la concentracin de papana diluida en cido y agregada en
la leche el tiempo de coagulacin de la leche disminuye en todos los
anlisis realizados.
Para demostrar que la papana del frutos es activa,

se

procedi

hacer un anlisis de determinacin de protenas en leche, con


el mtodo de Kjeldahl.
Los datos obtenidos en estas pruebas en el laboratorio para la
leche,

al igual que las pruebas

proveniente

del

cido

ms

por triplicado

cada una

encuentra en las siguientes tablas.

Porcentaje de Protena Casena sin Enzima


Leche

3.789%

de

las

del

suero

papanas

se

Suero (leche + cdo actico)

1.9304
%

Porcentaje de Protena Casena en Suero


Suero (leche +solucin de cido actico con
papana extraida)
0.718%
0.578%

0.5988

promedio
0.6316%

En la tabla de porcentaje de protena casena sin enzima, se puede


observar que l % de casena en la leche es de 3.789%, mientras que
al adicionar cido actico a la leche el % de casena en el suero es
de 1.9304% es decir que la protena ha disminuido, en comparacin
con la tabla de porcentaje de protena casena en suero, se puede
observar que en el anlisis por triplicado en el suero producto de la
adicin de la solucin

de

cido

ms

papana

disminuido en este caso sea papana de papaya.

la

leche

ha

La enzima no ha

reaccionado por completo con la protena, debido a que la papana


no ha pasado por un proceso de purificacin.

6. Conclusiones

Se logr obtener la enzima papana y evaluar su actividad enzimtica


Se observ que el grado de maduracin de la papaya es un punto
muy importante ya que permite que acte la enzima de mejor
manera al ser extrado de papayas verdes en comparacin a papayas
maduras. Adems en las papayas verdes existe mayor cantidad de
ltex lo que facilita al momento de extraer la enzima.
2.- Mtodo del ablandamiento de la carne

Otro mtodo para determinar la actividad de la enzima es el ablandamiento


de la carne ya que es sumamente necesario por ser un alimento de mayor
consumo. El problema es que la carne no siempre es buena para esto se
realiza el ablandamiento de la carne y su mejor consumo por la poblacin

Introduccin.
El ablandamiento de la carne se desarrolla en los tejidos conectivos, el uso
de cidos dbiles, como el vinagre y el limn, son un mtodo tradicional
que facilita el hinchamiento del colgeno, rompiendo los puentes de
hidrogeno de sus fibras. Tambin se emplean enzimas ablandadoras de
origen vegetal, y la ms utilizada es la papaya, que degrada diversas
protenas tisulares como el glucogeno, la elastina y miofibrillas. La papaya
esta en el ltex de la papaya verde (Carica Papaya)y es el que se emplea
con mayor frecuencia en los ablandadores artificiales.
El objetivo de este trabajo es el de comparar las actividades proteolticas
de ablandadores de carnes comerciales, con un blanco de ltex de papaya,
para que la actividad enzimtica fuera similar a la de los ablandadores
comerciales.
Enzimas vegetales
Las proteasas de origen vegetal utilizadas para el ablandamiento de la
carne son:
la ficina, encontrada en las hojas de la panta de higo;
la bromelina, encontrada en la corteza de la cscara de la pia; y
la papana, encontrada en el fruto y rbol de la papaya. Esta ltima
es muy usada en la cultura mexicana para ablandar la carne durante su
coccin.
Estas proteasas tienen dos desventajas principales al ser agregadas como
ablandadores durante la coccin:
Son inestables a temperaturas de 70C.
Producen un sabor desagradable en la carne debido a la degradacin
de la miosina.
Se ha observado que la inyeccin de enzimas vegetales da como resultado
una degradacin extensiva de las fibras musculares, no as del tejido
conectivo.
Una enzima poco conocida es la actinidina que se encuentra en el kiwi y se
es un ablandador natural de carne. Se recomienda que para ablandar la
carne de res, esta se debe frotar con un kiwi partido a la mitad y se esperan
30 minutos antes de cocinarla, quedando blanda y sin el sabor de la fruta.
Dureza de la carne

Edad
Raza
Alimentacin
Sistema de cra
Sistema de sacrificio

Para esto se tuvo los siguientes materiales

Cortes de carne
Cuchillos
Recipientes

En este experimento se realiz una comparacin de la papana, el


ablandador y una frotacin de la papaya con el blanco (carne normal sin
ablandador) esto se realiz en crudo
Metodologa
Determinacin de la Actividad Proteoltica. (Metodo de Kunitz modificado
por Ortega y del Castillo, 1966). El mtodo se basa en el cambio de
solubilidad de una protena en acido tricloroacetico (ATC) cuando est sujeta
a la accin de una enzima proteoltica.

Inicio de la prueba a las 7:40 duro 30 min y se obtuvo 0.5gr de la

papana
Se compr el ablandador y se pes 0.5gr
Las cascaras de papaya se utilizaron frotando suavemente las carne
muestra

BLANCO

PAPAINA

ABLANDADOR

CASCARAS DE
PAPAYA

Elaboracin de la Curva tipo de Tirosina:


A partir de una solucin que contenga tirosina en una concentracin de 500
moles/mL (la solucin debe contener 2 partes de regulador de fosfatos pH
7.6, 0.05 M y tres partes de ATC al 5 %). Con los resultados obtenidos se
realiza el clculo de la densidad ptica.
Actividad en Funcin del tiempo.

Se prepara una serie de tubos que se incuban en un bao a 35 C. Los


tiempo de reaccin ser de 10,15,30,120 y 240 minutos para cada diferente
ablandador.
Obtencin del extracto de ablandadores comerciales
Se pesan 5 gramos de cada uno de los ablandadores comerciales y se
mezclan con 5 ml de regulador de fosfatos pH 7-6. La determinacin de la
actividad proteoltica y la elaboracin de tubos se hicieron por triplicado,
tomando en cuenta tres marcas de ablandadores en tres pedazos de carnes
(A, B y C)

ACTIVIDAD
PROTEOLITICA DE LOS
DIFERENTES
ABLANDADORES
(A,B Y C).

Se observa en esta figura que la actividad Proteoltica, del ablandador


comercial C (amarillo), es menor con respecto a los otros dos ablandadores.
El ablandador B (rosa), es el que presento mayor unidades de Tirosinas
liberadas, para la determinacin de actividad proteoltica. Lo importante de
esto, es que los tres ablandadores comerciales, siguen una misma cintica
enzimtica directamente proporcional al aumento del tiempo en minutos
con respecto a su contenido de Unidades de Tirosina liberadas.
Pesos de las diferentes muestras de carne

Carne
Carne
Carne
Carne

(Blanco): 39.6 gr
+Papana: 27.2 gr
+Ablandador: 30.1
+Cascaras de papaya: 29.1

Se permaneci esta prueba para la actuacin de estos diferentes mtodos


de aplicacin de esta enzima
T= 1h
Nuestros resultados fueron

Textura

Carne
(blanco)

Carne
+papana

Carne
+ablandador

La carnes es

La textura

La textura de

Carne
+cascara de
papaya
La textura de

pasado
30 min

parcialmente
dura

Textura de
1 hora

La textura
permanece
igual

de carne no
es muy
diferente al
inicial
La textura
est muy
suave fcil
de
desgarrar

carne no es
muy
diferente al
inicial
La textura
est suave
fcil de
desgarrar

carne no es
muy
diferente al
inicial
La textura
est
parcialmente
suave

La prueba se realiz fsicamente con el tacto se desagarro cada muestra y


se comprob la textura de este.
Conclusiones.
La actividad de las enzimas proteolticas, como la papana, tienen un efecto
muy importante sobre las protenas de la carne, logrando su hidrlisis. *La
actividad proteoltica de los diferentes ablandadores para carnes tienen un
comportamiento muy similar, con respecto al tiempo, se observa el que
posiblemente es de mejor calidad de acuerdo a su actividad proteoltica, es
el ablandador B. Pero con respecto a la mejor calidad de elaboracin de sus
procesos unitarios, es el ablandador C.
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