DETERMINACIN DE ACTIVIDAD DE SUCCINATO DESHIDROGENASA DE Escherichia coli

HIPOTESIS
Si Escherichia coli tiene mayor afinidad con la glucosa, entonces, al utilizarla como fuente de carbono tendr un mayor crecimiento que en succinato. Si la enzima succinato deshidrogenasa es inducida con succinato, entonces, hay mayor actividad de la enzima con esta fuente de carbono que la inducida con glucosa. Si se mide la actividad enzimtica de la succinato deshidrogenasa por el mtodo de Ells, entonces Escherichia coli no hace una cadena transportadora de electrones natural sino una cadena transportadora de electrones artificial.

DISEO EXPERIMENTAL
a) Obtencin de la Suspensin Celular

Glucosa al 50%

Solucin que ser diluida para preparar los matraces con glucosa como fuente de carbono. Solucin que ser diluida para preparar los matraces con succinato como fuente de carbono. Medio de suspensin para las clulas inocuo.Ideal para diluciones lavados. Es un medio mnimo con las condiciones necesarias para que cualquier microorganismo crezca.

Succinato de Sodio al 25%

Regulador de Fosfatos

Medio de Sypher y Strauss

Se utiliza una cepa silvestre de Escherichia coli, organismo que representa nuestro objeto de estudio, es decir, del cual determinaremos la actividad de succinato deshidrogenasa. Esta cepa se utiliza para inocular 2 matraces que contienen cada uno 50 mL del medio sinttico Sypher y Strauss, un medio sinttico del cual se conoce las cantidades concretas de las sustancias qumicas puras que lo conforman; en el primer ensayo la fuente de carbono es la glucosa, que se encuentra presente en el 1.0% y el en segundo la fuente de carbono es succinato 0.5%. Se incuba a 37C, en agitacin durante 12 horas. Las clulas se cosechan por centrifugacin en condiciones de esterilidad y se lavan y se resuspenden con regulador de fosfatos, el cual mantiene el pH ptimo para la enzima succinato deshidrogenasa. Las suspensiones anteriores se emplean para elaborar una serie de cuatro ensayos: En el primero y segundo ensayo se utiliza un cultivo previo de Succinato, y se emplea como fuente de carbono adicional Succinato 0.5% y Glucosa 1.0%, respectivamente (SS y SG). En el tercer y cuarto ensayo el cultivo previo empleado es Glucosa, y la fuente de carbono adicionada es succinato 0.5% y Glucosa 1.0% respectivamente (GS, GG). En condiciones de esterilidad, se toman alcuotas de 4 mL y se leen las absorbancias a 600nm, al tiempo inicial y final de incubacin, de 37C por 5 horas, contra un blanco (medio de cultivo sin inculo), esto nos permitir conocer el efecto de la fuente de carbono en el crecimiento y actividad enzimtica de Escherichia coli. b) Efecto de la fuente de Carbono sobre la actividad de la succinato deshidrogenasa.

Celda espectrofotomtrica

Se utiliz una celda espectrofotomtrica debido a que se medir la transmitancia de la solucin en un espectrofotmetro

ste es un indicador de reaccin xido- reduccin que va a actuar como aceptor artificial final de electrones inespecfico al trmino de la cadena artificial creada 2,6 diclorofenol por medio del mtodo de Ells indofenol

KCN

Es un inhibidor de la enzima oxidasa terminal que permite que el 2,6 diclorofenil indofenol sea el aceptor final de electrones

 Se utiliz Regulador de Fosfatos con la finalidad de mantener un pH de 7.3 para poder crearse la cadena transportadora de electrones artificial y as mismo, es un Regulador de pH ptimo para medir la actividad de la Succinato Deshidrogenasa
Fosfatos

Se utiliz para realizar el mtodo de Ells en dnde acta como donador de electrones para llevar a cabo la cadena artificial de transporte y as medir el Succinato de efecto de la fuente de carbono sobre la actividad de succinato deshidrogenasa.
Sodio

Metosulfato de Fenazina

Es utilizado como transportador de electrones, ya que acopla la transferencia de electrones entre los nucletidos de piridina y el 2, 6- diclorofenil indofenol.

Suspensin celular

Se utilizaron 4 diferentes suspensiones de clulas de Escherichia coli crecidas en las siguientes fuentes de carbono : Succinato/Succinato, Succinato/Glucosa, Glucosa/Glucosa y Glucosa/ Succinato, con el fin de medir la actividad de cada uno de succinato deshidrogenasa..

En seguida que se agreg la suspensin celular, se sell la celda con papel parafilm y se agit rpidamente para comenzar a llevar a cabo la Mezclar por reaccin e inducir la formacin de la cadena artificial de transporte. inversin
Despus de haberse mezclado la solucin por inversin , inmediatamente se comienza a leer el %T de sta en un espectrofotmetro previamente calibrado contra un blanco de Regulador de fosfatos.

Lectura

Registrar datos

Finalmente se registran los datos de %T en un intervalo de 30 segundos por lectura.

Se realiza la determinacin de la actividad de la enzima succinato deshidrogenasa de la siguiente manera: Ya que ninguno de los componentes clave puede medirse directamente, la reaccin Succinato Fumarato se medir mediante la reduccin de un aceptor de electrones artificial, el colorante 2,6- diclorofenol indofenol, se aaden 0.25 ml de este colorante a una celda de espectrofotmetro, se adicionan 0.6 ml de KCN para bloquear la trayectoria normal de electrones a travs del sistema de transporte de electrones mitocondrial, inhibiendo la transferencia de electrones del citocromo a, al aceptor final de electrones (el oxgeno, se adicionan tambin a la celda 3.25 ml de regulador de fosfatos para mantener el pH ptimo de la enzima, 1.0 ml de Succinato de sodio como sustrato que la enzima oxidar, 0.4 ml de metosulfato de fenazina, compuesto que acta como acarreador para garantizar que los electrones sean captados por el aceptor artificial de electrones, y por ltimo se aade 0.5 ml de suspensin celular, que contiene a Escherichia coli, microorganismo del que se pretende lleve a cabo esta cadena artificial de transporte de electrones. Rpidamente la celda se sella con papel parafilm, se mezcla por inversin y se lee el porciento de transmitancia a 600nm contra un blanco de regulador de fosfatos. Leemos en realidad la reduccin del colorante (cambio de color azul a incoloro). Se registran lecturas cada 30 segundos por cinco minutos. Este procedimiento se realiza con los 4 ensayos, es decir suspensiones celulares SS, GS, GG y SG.

OBJETIVOS
Observar el crecimiento de E. coli al utilizar como fuentes de carbono a succinato y la glucosa. Inducir una cadena artificial de electrones para E. coli y as poder determinar la actividad enzimtica de succinato deshidrogenasa. Determinar qu fuente de carbono genera una mayor actividad enzimtica en succinato deshidrogenasa.

REGISTRO DE DATOS
EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO EN EL CRECIMIENTO DE E. coli
Despus del desarrollo experimental, se obtuvieron los siguientes datos: Se presentan las absorbancias inicial y final obtenidas a 600 nm, las cuales son un indicativo del crecimiento de Escherichia coli en los distintos cultivos y fuentes de carbono empleadas. *Cabe destacar que este ensayo no se realizo, por lo cual solo no se discutirn tcnicas experimentales

TABLA 1 EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO EN EL CRECIMIENTO DE E. COLI.

Cultivos previos en: Succinato Glucosa Matraces con medio base 1 2 3 + Fuente de carbono Succinato Glucosa Succinato Crecimiento (Absorbancia a 600nm) Inicial Final 0.712 1.005 0.720 1.200 0.894 1.105 Crecimiento

0.293 0.486 0.211

Glucosa

0.889

1.211

0.322

Y, a partir de estos datos, obtenemos la grfica correspondiente al ensayo: GRFICA 1 EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO EN EL CRECIMIENTO DE ESCHERICHIA COLI

0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 S-S S-G G-S G-G S-S S-G G-S G-G

SS = Cultivo previo en Succinato + adicin de Succinato como fuente de carbono. SG = Cultivo previo en Succinato + adicin de Glucosa como fuente de carbono. GS = Cultivo previo en Glucosa + adicin de Succinato como fuente de carbono. GG = Cultivo previo en Glucosa + adicin de Glucosa como fuente de carbono.

EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA

Se muestran los resultados obtenidos dnde las fuentes de carbono para los cultivos son: S-S: Succinato-succinato. S-G: Succinato-glucosa. G-S: Glucosa-succinato. G-G: Glucosa-glucosa.

TABLA 2 LECTURAS OBTENIDAS DE %T A 600 NM PARA ACTIVIDAD DE SUCCINATO DESHIDROGENASA EN LAS DIFERENTES FUENTES DE CARBONO . TIEMPO % DE TRANSMITANCIA A 600 nm DE LAS SUSPENCIONES CELULARES CRECIDAS EN LAS FUENTES DE CARBONO S-S S-G G-S G-G 15.5 15.6 16.2 16.3 17.4 16.5 17.4 19.8 19.5 17.3 17.8 20.8 22.8 18.1 18.6 22 25.5 19.2 19.2 22.8 28.4 16.2 19.5 24 31 17.1 20.6 24.9 34 18.1 21.3 25.9 36.8 18.7 21.7 26.7 40.1 19.3 22.3 27.3 43 19.8 23 28

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300

TABLA 3 DIFERENCIA DE %T A 600 NM PARA SUCCINATO DESHIDROGENASA EN LAS DIFERENTES FUENTES DE CARBONO.

TIEMPO 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300

%T S-S 0 1.9 4 7.3 10 12.9 15.5 18.5 21.3 24.6 27.5 S-G 0 0.9 1.7 2.5 3.6 0.6 1.5 2.5 3.1 3.7 4.2 G-S 0 1.2 1.6 2.4 3 3.3 4.4 5.1 5.5 6.1 6.8 G-G 0 3.5 4.5 5.7 6.5 7.7 8.6 9.6 10.4 11 11.7

GRFICA 2 ACTIVIDAD DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA DE E SCHERICHIA COLI CRECIDAS CON FUENTES DE CARBONO GLUCOSA Y SUCCINATO POR EL MTODO DE E LLS 30

25

20 %T a 600nm S-S S-G 10 G-S G-G 5

15

0 0 -5 50 100 150 200 250 300 350

Tiempo (min)

MANEJO DE DATOS
EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO EN EL CRECIMIENTO DE E. coli
Para el ensayo del efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de E. coli: Graficamos el crecimiento obtenido en cada uno de los diferentes ensayos con cultivos previos y fuentes de carbono adicionales, para esto obtenemos el de absorbencia, el cual corresponder al crecimiento total para cada ensayo: Matraz con cultivo previo en Succinato + Succinato como fuente de carbono: Abs600nm = A600nm final - A600nm inicial Abs600nm = 1.005 0.712 Abs600nm = 0.293

Matraz con cultivo previo en Succinato + Glucosa como fuente de carbono: Abs600nm = A600nm final - A600nm inicial Abs600nm = 1.2000.720 Abs600nm = 0.486

Matraz con cultivo previo en Glucosa + Succinato como fuente de carbono: Abs600nm = A600nm final - A600nm inicial Abs600nm = 1.105 0.894 Abs600nm = 0.211

Matraz con cultivo previo en Glucosa +Glucosa como fuente de carbono: Abs600nm = A600nm final - A600nm inicial Abs600nm = 1.2110.889 Abs600nm = 0.322

EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA

Se obtuvo la diferencia del % de transmitancia para cada cultivo cada treinta segundos durante 5 minutos a partir de los resultados registrados de la tabla 1.

EJEMPLO: Para el cultivo de succinato-succinato:

A Continuacin se muestra el comportamiento que se espera obtener en la medicin de la actividad de succinato deshidrogenasa para cada una de las condiciones de cultivo por el mtodo de Ells. Grfica. 3 Comportamiento Esperado de la actividad de succinato deshidrogenasa, medido como porcentaje de transmitancia en funcion del tiempo para cada una de las condiciones de cultivo 12

10

8 % Ts

gluc - succ succ - gluc

gluc - gluc succ - succ

0 0 50 100 150 200 250 300

Tiempo (seg)

DISCUSIN
Segn los resultados de efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de E. coli, se observa que la bacteria si puede incorporar succinato a su metabolismo 1, ya que s presento crecimiento en este medio de cultivo. La bacteria creci mejor en glucosa que en succinato ya que la absorbencias iniciales de los matraces 3,4 son mayores que las absorbencias de los matraces 1,2, (tabla 1) esto se debe a que el uso de glucosa como sustrato utiliza dos vas centrales en condiciones aerobias, la glicolisis y el ciclo de Krebs, lo cual genera un mayor poder reductor que se ver reflejado en mayor sntesis de ATP 2, mientras que el succinato es un sustrato que se va a incorporar en el ciclo de los cidos tricarboxlicos, pero produciendo menor poder reductor 3 . El mecanismo para que E. coli incorpore succinato a su metabolismo requiere una fase de adaptacin de mayor tiempo, ya que como se observo el cultivo s presento crecimiento en succinato pero de manera ms lenta en comparacin con las clulas crecidas en glucosa 4. El cambio en la fuente de carbono afecto el crecimiento celular ya que las lecturas finales de absorbencia de los matraces 1,2 y 3,4 no son iguales. En el matraz 2 (succinato - glucosa) Se observa que el crecimiento se acelero mas al cambiar las clulas pre incubadas en succinato por otra fuente de carbono como glucosa, esta observacin es notoria si restamos las absorbencias iniciales de las finales (los valores son de M1 =0.293 y M2 =0.486), mientras que para el matraz 1 donde no se cambio la fuente de carbono, las clulas continuaron replicndose pero de una manera un tanto ms constante. En los resultados del segundo par de matraces (3,4) se presento un mejor crecimiento en glucosa glucosa, comparado con el crecimiento glucosa succinato, los valores de absorbencia iniciales son similares pero al cambiar la fuente de carbono, el crecimiento en succinato fue afectado disminuyendo (matraz 3 Abs = 1.105) en comparacin con el de las clulas crecidas en glucosa (matraz 4 Abs = 1.211).La succinato deshidrogenasa es una enzima que est presente en procesos en la ltima parte del ciclo de Krebs, una conversin de succinato a fumarato, la des hidrogenacin depende de FAD . Esta enzima est unida a la membrana de E. coli y pasa los electrones del succinato a la CoQ, por medio del FAD para permitir que se lleva a cabo la fosforilacin oxidativa. 5 En los resultados de actividad de la enzima succinato deshidrogenasa se observa que la enzima de la bacteria presenta una mayor actividad cuando E. coli creci en los medios de cultivo succinato succinato. Tambin se observa que para el crecimiento en los medios de cultivo succinato glucosa se vio afectada la actividad de la succinato deshidrogenasa, pero no de manera determinante, es decir, que la enzima si presento actividad, si esta actividad se compara con las de enzimas de las clulas que crecieron en glucosa succinato podemos decir que la tendencia de stas rectas fueron muy parecidas. Para los ensayos de acuerdo a la bibliografa, se reporta que la actividad de la succinato deshidrogenasa se ve reprimida cuando E. coli es crecida en un medio que contiene glucosa, pero adems esta enzima incrementa su actividad cuando en el medio de cultivo existe succinato como la principal fuente de carbono 6. Si succinato deshidrogenasa es una enzima reprimible, se debe tener una clara disminucin en la actividad de la enzima para el crecimiento en glucosa glucosa y un aumento en el porciento de transmitancia (cuantificacin de la actividad) para el ensayo de succinato succinato. . En el caso de los otros dos ensayos se esperaba un comportamiento similar, de valores de porcentaje de absorbencia entre los de succinato succinato y glucosa glucosa, se realizo una tendencia de estos datos, representados en el grfico 3.

La metodologa por la cual se determino la actividad de la enzima es un conjunto de reacciones de oxido reduccin que conforman una cadena de transporte de electrones artificial, donde el ultimo aceptor de electrones fue el 2,6-diclorofenol indofenol, que genero un color verde 7, para que posteriormente se leyera la absorbencia en un espectrofotmetro, donde para el ensayo de glucosa glucosa se presento una desviacin muy notable en nuestros resultados, esto lo podemos atribuir a que como equipo tuvimos un error experimental en confundir las celdas en donde se midi esta actividad al agregar en vez de clulas de glucosa-glucosa a su celda correspondiente, agregamos otras clulas crecidas en succinato-glucosa. La tendencia de las graficas obtenidas no concuerda con lo reportado en la bibliografa 6 ya que como se dijo se presentaron errores experimentales, sobre todo en el ensayo donde utilizamos a las clulas crecidas en glucosa-glucosa cuyo valor debera ser muy diferente, pero cabe destacar que las condiciones de las clulas con las cuales se trabajo, no eran conocidas, ya que como se menciono en el registro de datos solo realizo la determinacin de la actividad enzimtica y no se incubaron estas. Por otro lado al ser un mtodo indirecto y colorimtrico las interferencias inherentes al mtodo, y, a los errores del espectrofotmetro fueron eliminadas mediante el tratamiento de datos. Los resultados del mtodo realizado, el cual era la formacin de una cadena artificial para medir la actividad de la enzima succinato deshidrogenasa, no son satisfactorios como se esperaba, ya que aunque estos resultados muestran que la enzima es inducible por la presencia de succinato no muestra que sea reprimible por la presencia de glucosa.

CONCLUSIONES
E. coli presenta un alto crecimiento en un medio que contiene clulas incubadas en succinatoglucosa. E. coli presenta un buen crecimiento en un medio de glucosa-glucosa comprado con el crecimiento en succinato-succinato. El crecimiento de E. coli disminuye con la presencia de succinato como principal fuente carbono y aumenta si la fuente de carbono es glucosa. Se determin que la mejor fuente de carbono que genera una mayor actividad enzimtica de succinato deshidrogenasa en E. coli fue cuando se utiliz slo Succinato. No obtuvieron resultados que demuestren que la enzima succinato deshidrogenasa de E.coli sea inducible segn la fuente de carbono presente en el medio.

Bibliografa
1. 2. 3. 4. 5. J. Monza, S. Doldan y S. Signorelli. Ciclo De Krebs http://www.unavarra.es/genmic/metabolismo/glucolisis.htm Mary K. Campbell, Shawn O. Farrell. Bioqumica. Edit. CENGAGE Learning. Pg 560 565. Curso Qumico Biolgico en Lnea de la UCV: http://www.bioquimicaqui11601.ucv.cl/ Christopher k. Mathew kensal e. Van hole kevin g. Ahern. Pearson. Bioquimica 3a edit. 586 587 6. J. Rufz Herrera y L. G. Garca. Marzo 1972. Regulation of succinate dehydrogenase in escherichia coli . Departamento de microbiologa, Escuela nacional de ciencias biolgicas, instituto politcnico nacional, Mxico 17, D. F. 7. H. Alan Ells. A colorimetric Method for the Assay of Succinic Dehydrogenase and Pyridineucleoticde Linked Deshudrogenases .

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

BIOQUMICA MICROBIANA DETERMINACIN DE ACTIVIDAD DE SUCCINATO DESHIDROGENASA DE Escherichia coli ALUMNOS:

ALVARADO RODRGUEZ DIANA KAREN MARTNEZ PINEDA MICHELLE RODRGUEZ RAMREZ ALEJANDRA GRUPO: 5IV1 SECCIN: 1 EQUIPO: 1

FECHA DE ENTREGA DE INFORME: 13/03/14