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Regulacin de la sntesis de la - Galactosidasa

OBJETIVO El alumno determinar mediante datos experimentales y conociendo los mecanismos de regulacin metablica, cul es el tipo de regulacin que lleva a cabo Escherichia coli en la sntesis de la enzima -galactosidasa. OBJETIVOS Medir la velocidad de induccin y represin catablica de la -Galactosidasa cambios en la fuente de carbono del medio de cultivo de la bacteria en cuestin. Observar el efecto de induccin y represin de la -Galactosidasa cuando se cambia la fuente de carbono.

FUNDAMENTOS Determinacin de la actividad de -Galactosidasa. El ONPG (orto-nitrofenil--D-galactopiransido), es un sustrato anlogo para la galactosidasa, dado su estructura qumica puede entrar fcilmente a la clula, es hidrolizado por la -galactosidasa produciendo D-galactosa y el ortonitrofenol, compuesto de color amarillo, el cual es utilizado para determinar la actividad de la -galactosidasa, por espectrofotometra a una longitud de onda de 420 nm. (1)

Velocidad de induccin y represin catablica. El cloranfenicol es un antibitico que inhibe la sntesis de protenas bloqueando la actividad de la enzima peptidil transferasa al unirse a la subunidad 50S del ribosoma evita la formacin del enlace peptdico., impidiendo el crecimiento celular; despus se trato con tolueno para disgregar la membrana celular, al ser los fosfolpidos solubles en sustancias no polares, y a si poder obtener a las protenas permeadas de la lactosa y poder trabajar con ellas cuantificando su actividad.2

Tolueno: Solubiliza la membrana para que entre el ONPG a la clula y sea hidrolizado por la -Galactosidasa.

DISEO EXPERIMENTAL. Determinacin de la actividad de - galactosidasa. De cada una de las suspensiones de clulas obtenidas se ajustan a 1.0 de absorbencia a 600 nm, esto para tener aproximadamente la misma cantidad de clulas para que la determinacin no se vea afectada. A una de esas suspensiones se le agrega tolueno y se agita vigorosamente en el vrtex por 2 minutos y se coloca en bao de hielo. En una celda para espectrofotomtrica se colocan 3.8 mL de regulador de fosfatos, ONPG que es un anlogo de la lactosa, lo utilizamos para conocer si un microorganismo posee galactosidasa se utiliza como sustrato este compuesto orgnico, y la suspensin celular, se agita y se lee inmediatamente a la absorbencia a 420 nm esto por la reaccin colorida que es de color amarillo. Las lecturas se registran cada minuto durante 10 minutos. El aparato se ajusta cero de absorbencia con una celda que contenga 3.9 mL de regulador de fosfatos y 0.1 mL de ONPG, esto para ajustarlo como blanco de reactivos.

Velocidad de induccin y represin catablica. Inocular con cultivo de 18 horas un matraz de Erlenmeyer con 200 mL de medio sinttico adicionado de glicerol e incubar a 37C en agitacin durante 3 horas, el medio sinttico por que tiene lo necesario para mantener al microorganismo con sus funciones vitales y

porque conocemos exactamente las cantidades de lo que est hecho. Retirar una alcuota de 10 mL y adicionar al cultivo que queda en el matraz el volumen de lactosa estril a una concentracin final de 1.2 %. Incubar a 37C en agitacin y seguir retirando las alcuotas de 10 mL a los 2.5, 5, 10, 15, 20 y 30 min. Al retirar la alcuota de 30 min, agregar inmediatamente el volumen de glucosa (50%) y continuar retirando alcuotas a los 35, 40, 50, 60 y 70 minutos. Esto nos dice que a partir del minuto treinta E. Coli empezar a utilizar a la glucosa para seguir creciendo. Todas las alcuotas se reciben en tubos cnicos de polipropileno para centrfuga que contengan 0.1 mL de cloranfenicol, un antibitico bacteriosttico, de amplio espectro ejerce sus efectos mediante la unin irreversible a la subunidad ribosomal 50s. Los tubos cnicos una vez recibiendo las alcuotas inmediatamente se conservan en bao de hielo, despus de retirar la ltima alcuota centrifugar a 3,000 rpm / 10 min. Se lava con regulador de fosfatos y ajustamos a 1.0 de absorbencia a 600 nm. Tratar con tolueno y medir actividad enzimtica conforme a lo indicado en el inciso anterior, efectuado las lecturas de absorbencia una a los cero min y otra a los 10 min. MANEJO DE DATOS

Velocidad de induccin y represin catablica; medicin de actividad enzimtica


respecto a densidad ptica. Tiempo de incubacin (min) 0 10 20 30 35 40 50 60 Absorbencia a 420nm en la determinacin de la actividad de galactosidasa. t= 0 min t= 10 min Abs 0.050 0.034 0 0 0.035 0.043 0.008 0.089 0.038 0.060 0.022 0.1483 0.050 0.139 0.089 0.2983 0.060 0.209 0.149 0.3860 0.061 0.152 0.091 0.3016 0.070 0.182 0.112 0.3346 0.175 0.299 0.124 0.1113

CLCULOS Determinacin de absorbancia velocidad de induccin y represin catablica

Ejemplo minuto 40

Determinacin de Ejemplo minuto 40: RESULTADOS 0.091 = 0.301

CINTICA DE INDUCCIN Y REPRESIN CATABLICA DE -GALACTOSIDASA EN Escherichia coli.


0.45 0.4 0.35

glucosa

Abs

0.3 0.2

0.25 0.15 lactosa 0.1 0.05 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Tiempo (minuto)

DISCUSION

En la grfica, observamos el comportamiento de la -galactosidasa al ser inducida por la lactosa, puesto que en los primeros tres tiempos se ve un incremento en su actividad claramente; al tiempo 30 en donde se adiciona glucosa al medio, comenzamos a observar una disminucin en la actividad de la misma y conforme pasa el tiempo esta sigue bajando, lo que nos dice que la glucosa acta como represora de la -galactosidasa, como sabemos cuando estos dos sustratos se encuentran presentes en el mismo medio el microorganismo prefiere consumo de la glucosa. Esto se da debido a un mecanismo de regulacin, denominado represin por catabolito, el cual impide la expresin de los genes para el catabolismo de la lactosa y otros azucares en presencia de glucosa; el efecto de la glucosa sobre la CRP est facilitado por la formacin del complejo CRP-cAMP. La CRP se une al opern lac con mayor afinidad cuando las

concentraciones de cAMP son altas. Con la glucosa la sntesis de cAMP se inhibe y se estimula la salida de la clula, a medida que las concentraciones de esta disminuyen la unin del complejo por igual y en consecuencia tambin se disminuye la expresin del opern lac. Debido a este mecanismo de regulacin despus de haber sido adicionada la glucosa la grfica sigue una tendencia descendente, , ya que en este tiempo la accin de represin que tiene la glucosa sobre el opern lac ya es ms evidente, debido a que para presentar una fuerte induccin en el mismo opern se requiere lactosa, para inactivar el represor lac, adems de una baja concentracin de glucosa, para tener un incremento del complejo CRP-cAMP.

Figura 6. Reaccin del ONPG.

Es importante mencionar que se utiliz tambin tolueno cuando la fuente de cabono fue lactosa, el tolueno es un disolvente orgnico que actuar sobre la membrana lpidica, lo que ocasionar que el transporte de lactosa sea ms rpido y eficiente, lo que provoca que al utilizar tolueno, la actividad de -galactosidasa sea mayor. Los niveles celulares de algunos productos gnicos aumentan disminuyen en respuesta a seales moleculares; esta es la expresin gnica regulada. Los productos gnicos que aumentan de concentracin bajo determinadas circunstancias moleculares se llaman inducibles; el proceso de aumento de su expresin se denomina induccin. (Nelson,2004) Los represores se unen a sitios especficos del DNA que en clulas procariticas estos sitios de uni se denominan operadores, que generalmente se encuentran cerca de un promotor. La unin de la RNA polimerasa, o su movimiento a lo largo del DNA despus de la unin, se bloquea cuando el represor est presente. La regulacin mediante una protena represora que bloquea la transcripcin se denomina regulacin negativa. La unin del represor al DNA se regula por una seal molecular (o efector), normalmente una

molcula pequea o una protena, que se une al represor y provoca un cambio conformacional. (Nelson, 2004)

Figura 7. A) En ausencia de lactosa, el represor lac se une al DNA y reprime la transcripcin del opern lac, B) la alolactasa u otro inductor se une al represor lac provocando su disociacin del DNA y la produccin del mRNA de lac.

Los activadores consituyen el contrapunto molecular de los represores; se unen al DNA y potencian la actividad de la RNA polimerasa en el promotor; se trata de la regulacin positiva. En el opern lac, en realidad el inductor natural no es exactamente la lactosa, sino el ismero alolactosa, que se orignia por nadams de la presencia de lactosa en la clula. La molcula unida a cada monmero de represor no es la lactosa sino alolactosa. La alolactosa, al igual que la lactosa, est compusta por glucosa y glactosa, pero el enlace entre los dos azcares es diferente. Sucede que una reaccin secundaria de la galactosidasa (que normalmente acta hidrolizando lactosa en glucosa y galactosa) convierte estos dos productos en alolactosa. La -galactosidasa convierte unas pocas moculas de lactosa en alolactosa, que posteriormente se unen al represor y provocan la induccin del opern. (Devlin, 2004)

Figura 8. Estructuras de la lactosa y los productos por accin de la -galactosa. Estructura de la Alolactosa.

Conclusiones. El opern de la lactosa de Escherichia coli es un operon catabolico inducible El opern lac est sujeto a regulacin positiva El Tolueno es un disolvente orgnico que ayuda a que el trasporte de lactosa sea ms eficiente. La glucosa participa en el mecanismo de represin catablica para el opern lac. El glicerol es la fuente de carbono para las clulas, se utiliza esta fuente de carbono por qu no induce la sntesis de la -galactosidasa. La alolactosa es el inductor para la sntesis de la -galactosidasa. .