LABORATORIO 2

“Técnicas de Siembra”

Estudiante:

2019
Índice

Introducción..............................................................................................

Objetivos....................................................................................................

Introducciòn..............................................................................................

Metodologìa ..............................................................................................

Discusiòn...................................................................................................

Bibliografía................................................................................................
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Introducción
La microbiota normal, corresponde a microorganismos que habitan zonas de nuestro
organismo en relación simbiótica o comensal con su hospedador (sin causar infección)
por ello muchas veces será necesario separar a esta microbiota del agente causal de
un cuadro infeccioso, o cuando tenemos más de un agente causal. Las colonias
bacterianas (unidad macroscópica formada a partir de al menos una bacteria en un
medio de cultivo sólido, UFC) cuando se encuentran aisladas pueden usarse para su
caracterización, identificación y definir tratamientos. Para ello la siembra por
agotamiento en estrías es una de las técnicas más usadas para aislar colonias de
microorganismos.

Sin embargo, no todos los medios tienen por función la obtención de colonias aisladas
muchas veces se utilizan para visualizar la presencia de estructuras o propiedades
bioquímicas, estos pueden ser sólidos, semisólidos o líquidos, deben ser sembrados a
partir de un cultivo axénico para que sus resultados sean representativos del género o
especie que se desea identificar o caracterizar.

En este laboratorio se realizan dos actividades. La actividad 1, dice relación una técnica
de siembra, que permitirá el aislamiento y/o separación de las comunidades
microbiológicas.

Esta actividad realiza la siembra en tres medios de cultivo: cromogénico, agar

MacConkey y agar nutritivo, cuyas características son las siguientes: el agar
cromogénico es mixto y selectivo para Gram negativas, el agar MacConkey es selectivo
y diferencial para gran (-) y fermentadoras de lactosa, el agar nutritivo no es selectivo.

Cuadro 1: características observables de cultivo de E. coli y Klebseilla en diferentes medios de cultivo.

Bacteria Cromogénico MacConkey Nutritivo
Escherichia coli Rojo-rosa Rosa Crema
(precipitado)
Klebsiella Rosa (mucosa) Azul oscuro Púrpura Crema
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En cuanto al aislamiento por agotamiento por estrías, se trata de un método rápido

simple de agotamiento progresivo que permite obtener un número reducido de bacterias
distribuidas individualmente sobre una placa Petri.
Figura 1: agotamiento por estrías

La actividad 2, ‘’medios separación y caracterización’’ consiste en observar el desarrollo

de E.coli y Klebsiella y se fundamenta en dos cosas: las características del medio de
cultivo en que se hará la siembra que permitirá el desarrollo de unas u otras bacterias
según las características metabólicas de cada microorganismo.

Las características de los medios utilizados permiten visibilizar las propiedades

bioquímicas, de cada bacteria: a) agar TSI, b) agar MIO y c) caldo nutritivo, medios de
cultivo con presentación: ‘solido inclinado’, ‘medio semisólido’ y ‘medio líquido’, en
tubos, respectivamente.

El agar TSI, (Triple Sugar Iron, agar triple azúcar y hierro), se utiliza para la
identificación de patógenos entéricos gram negativos. Se emplea para detectar la
fermentación de lactosa, sacarosa y glucosa, con formación de ácido y gas, y también
para detectar producción de ácido sulfhídrico.
Los posibles resultados:
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Taco ácido (amarillo): Glucosa fermentada. Bisel ácido (amarillo): Lactosa y/o sacarosa
fermentada.
Taco ácido (amarillo): Glucosa fermentada. Bisel alcalino (rojo): Lactosa y/o sacarosa
no fermentada.
Taco alcalino (rojo) y bisel alcalino (rojo): Ninguno de los tres glúcidos es fermentado
La aparición de burbujas en el taco indica que la fermentación se ha efectuado con
producción de gas.
Un ennegrecimiento en el medio indica la producción de ácido sulfhídrico.
Figura 2: Resultados posibles, agar TSI.

El agar MIO (motilidad, indol y ornitina) pues se usa para la identificación de

enterobacterias en base a su movilidad, producción de indol y actividad ornitina
descarboxilasa. La motilidad es la capacidad del microorganismo de moverse por la
presencia de flagelos, lo que se evidencia por turbidez en el tubo. Para que esta
propiedad pueda ser observada la consistencia del medio debe ser semisólida. La
producción de indol evidencia la presencia de la enzima triptofanasa que actúa sobre el
aminoácido triptófano, siendo necesario el uso de un reactivo revelador para hacer
visible la producción de indol. Su positividad se revela por la presencia de un anillo rojo
en superficie.
Finalmente, la ornitina determina si la bacteria es capaz de descarboxilar el aminoácido,
es decir, si cuenta con la enzima ornitina descarboxilasa.
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Objetivos

 Practicar siembra por agotamiento de estrías y lograr obtención de un

cultivo axénico (formado por una única especie).
 Caracterización de muestras con agar nutritivo, TSI y MIO.

Metodología
Actividad 1: ‘OBTENCIÓN DE UN CULTIVO AXÉNICOS EN PLACA POR MÉTODO
DE ESTRÍAS’

Materiales:

- 1 placa de agar Cromogénico - 2 placa de agar MacConkey - 2 placa de agar nutritivo

Procedimiento:

1. Ordene en su área de trabajo el material necesario para realizar la siembra.

2. Tome el asa y flamee en llama, calentando el filamento hasta que alcance un rojo
incandescente. Enfríenlo en la proximidad de la llama (10 -20 segundos)

3. Tome con la otra mano el tubo de muestra, agítelo ligeramente para homogenizar,
retire el algodón o tapa, afirmado con su dedo meñique y anular.

4. Trabajando siempre en la proximidad de la llama flamee la boca del tubo y tome un

inoculo pequeño con el asa estéril y transfiera a la placa en un sector próximo al
borde. Extienda formando estrías muy juntas

5. Flamee nuevamente el asa y enfriarla. Tomar una muestra a partir de la zona de

estrías del punto 4 extender en estrías más separadas en el sector adyacente
evitando tocar el sector anterior

6. Flamear el asa y enfriarla. Repetir el mismo proceso anterior, con estrías más
separadas. en el último sector de la placa evitando tocar las secciones anteriores.

7. Rotule e Incube a 37°C por 24 h.

Actividad 2: MEDIOS SEPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN

Materiales: - 2 tubos de agar TSI - 2 tubos de agar MIO - 2 tubos de caldo nutritivo
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Procedimiento:

1. Siguiendo las mismas consideraciones para la manipulación de asas de la actividad

anterior proceda.

2. Tubo Medio Solido inclinado: Con asa en loop haciendo un zig-zag sobre el
extendido.

3. Tubo Medio Semisólido: Con asa recta, haciendo un pinchazo recto hasta el fondo
del tubo.

4. Tubo Medio Liquido: Con asa en loop agitando en el medio receptor.

5. Rotule e Incube a 37°C por 24 h.

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Resultados
Actividad 1: ‘OBTENCIÓN DE UN CULTIVO AXÉNICO EN PLACA POR MÉTODO
DE ESTRÍAS’
Cuadro 2: E.coli en diferentes medios de cultivo (tomado de internet)

Agar cromogénico Agar MacConkey Agar nutritivo

colonias medio colonias lactosa colonias pequeñas, de bordes

cromogenico CPS positivas. enteros, circulares, brillantes, de
aspecto húmedo.

Actividad 2: MEDIOS SEPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN

Figura 3: Agar TSI. Resultado positivo a movilidad, indol y ornitina’ (tomado de internet)
(comparado con muestra de Vibrio cholerae, que evidentemente no es muestra de este
laboratorio por su nivel de bioseguridad mínimo)
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Figura 4: Agar MIO. Resultado positivo a movilidad, indol y ornitina’ (tomado de internet)

Figura 5: Agar MIO. Resultado negativo a movilidad, positivo a indol y negativo a ornitina’ (tomado de
internet)

Figura 6: Resultado E.coli en caldo nutritivo.

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Discusión de resultados
1. ¿Es posible obtener colonias aisladas? Como evaluarías la técnica de siembra
de tu grupo

Si es posible. La técnica resultó eficiente, pues se obtuvieron en el último sector

colonias individuales.

2. Explique el concepto de colonia, ¿Por qué es tan importante la obtención de

colonias aisladas en microbiología?

Colonia: unidad macroscópica formada a partir de al menos una bacteria en un medio

de cultivo sólido, UFC.

Es importante obtener colonias aisladas porque así es posible su caracterización,

identificación y definir tratamientos.

3. ¿Qué propiedades metabólicas y estructurales se pueden observar en los

medios TSI y MIO? Describa metabólicamente las bacterias sembradas.

El agar TSI, (Triple Sugar Iron, agar triple azúcar y hierro), se utiliza para la
identificación de patógenos entéricos gram negativos. Se emplea para detectar la
fermentación de lactosa, sacarosa y glucosa, con formación de ácido y gas, y también
para detectar producción de ácido sulfhídrico.

Los posibles resultados indican: Taco ácido (amarillo): Glucosa fermentada. Bisel ácido
(amarillo): Lactosa y/o sacarosa fermentada.
Taco ácido (amarillo): Glucosa fermentada. Bisel alcalino (rojo): Lactosa y/o sacarosa
no fermentada.
Taco alcalino (rojo) y bisel alcalino (rojo): Ninguno de los tres glúcidos es fermentado
La aparición de burbujas en el taco indica que la fermentación se ha efectuado con
producción de gas.
Un ennegrecimiento en el medio indica la producción de ácido sulfhídrico.
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El agar MIO (motilidad, indol y ornitina) pues se usa para la identificación de

enterobacterias en base a su movilidad, producción de indol y actividad ornitina
descarboxilasa. La motilidad es la capacidad del microorganismo de moverse por la
presencia de flagelos, lo que se evidencia por turbidez en el tubo. Para que esta
propiedad pueda ser observada la consistencia del medio debe ser semisólida. La
producción de indol evidencia la presencia de la enzima triptofanasa que actúa sobre el
aminoácido triptófano, siendo necesario el uso de un reactivo revelador para hacer
visible la producción de indol. Su positividad se revela por la presencia de un anillo rojo
en superficie.

Finalmente, la ornitina determina si la bacteria es capaz de descarboxilar el aminoácido,

es decir, si cuenta con la enzima ornitina descarboxilasa.

Cuadro 3: metabolismo de E.coli y Klebsiella en respuesta a características de los medios TSI (tres
azúcares y hierro) y MIO (movilidad, indol y ornitina)
Bacteria Indol H2S (TSI) Ornitina Movilidad Azúcares
descarboxilasa (glucosa, lactosa,
sacarosa)
E.coli + - - + +
Klebsiella - - - - +
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Bibliografía
 Cepario Unicach. Cepas microbiológicas de la Universidad de Ciencias y Artes de
Chiapas. https://cepariounicach.wordpress.com/2014/09/19/escherichia-coli/.
01/01/20

 Enseñanza de la microbiología. Blog spot.

https://hkoraa.blogspot.com/2014/12/agar-emb.html. 30/12/19.

 Guía de laboratorio de Microbiología. Universidad de las Américas. Vicerrectoría

académica. Instituto de Ciencias Naturales.

 Medios bioquímicos. Héctor Alexander. https://es.slideshare.net/Prymer/medios-

bioqumicos. 01/01/20.
 Manual de prácticas laboratorio de microbiología. programa de química. Academia
de microbiología y parasitología. Dpto. ciencias químico biológicas icb, uacj. 2012.
https://bivir.uacj.mx/Reserva/Documentos/rva2011296.pdf 31/12/19.

 Microbiología general. http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/microgeneral/wp-

content/uploads/2017/02/03-b-ESTERILIZACIÓN-2017.pdf. 31/12/19.