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LAB
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CIENCIAS DE LA VIDA Y DE
DEPARTAMENTO: CARRERA: INGENIERIA AGROPECUARIA IASA 1
LA AGRICULTURA
PERÍODO
ASIGNATURA: Acuicultura Oct 21-Mar22 NIVEL: 8vo
LECTIVO:
PRÁCTICA -
DOCENTE: Ing. Juan Cristóbal Ortiz Tirado NRC: 10041 3
INFORME N°:
Berrazueta Kimberly
Crizón Vanessa
ESTUDIANTE(s):
Obando Evelyn
Zurita Damian
TEMA DE LA
Métodos para determinar el recuento celular en Chlorella sp.
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
Las microalgas son organismos unicelulares fotosintéticos, que pueden crecer de modo autotrófico y heterotrófico,
tienen una alta capacidad de fijación de CO2 y en la utilización de la energía solar en la producción de biomasa.
Las microalgas tienen un papel de suma importancia en producciones primarias de la cadena trófica. Son la base de
las redes tróficas y su gran número de especies y su versatilidad permiten utilizarlas en diferentes campos
industriales con grandes posibilidades de éxito (Cajamar, 2015).

Este tipo de cultivos lleva más de 70 años, a pesar de ello se tiene una incipiente industria tan solo produciendo
unas 20.000 toneladas al año, ya que se ha llegado a utilizar en las industrias alimentaria, acuícola, farmacológica,
cosmética y, últimamente, energética. Las microalgas contienen lípidos, carbohidratos y proteínas, esto llega a ser
variable según la especie, el sistema y condiciones de cultivo (Cajamar, 2015).

Las microalgas poseen una capacidad ficorremediadora que consiste en la eliminación o biotransformación de
contaminantes de un medio líquido o gaseoso, por lo cual los compuestos contaminantes son captados por la
biomasa algal y son recuperados mediante su cosecha. La elección del tipo de sistema de cultivo es importante, y
debe realizarse en base a factores biológicos, técnicos, ambientales y económicos, definidos previamente, mientras
su cosecha es un procedimiento más complejo y costoso en el cultivo de microalgas, existiendo varias técnicas
diferentes tanto en eficiencia como en complejidad, todo esto adquiere una gran importancia debido a los
problemas ambientales globales existentes en la actualidad (Hernández & Labbé, 2014).

En este informe se realizará la cuantificación de esporas presentes en cada una de las diluciones de microalga
Chlorella, con la utilización de diferentes métodos como el espectrofotómetro, cámara de neubauer y el programa
de conteo de células IMAGEJ.

OBJETIVOS:
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Objetivo General:

1. Preparación de diluciones de microalga Chlorella para evaluar la cantidad de esporas presentes en cada
muestra.

Objetivos Específicos

2. Realizar diluciones a diferentes concentraciones de la muestra de microalga Chlorella

3. Determinar el grado de absorbancia de cada una de las diluciones

4. Cuantificar el número de esporas con el uso del programa IMAGEJ

MATERIALES y MÉTODOS:
Materiales

REACTIVOS: INSUMOS:

Agua destilada 3 Tubos aforados de espectrofotometría 10 ml

3 Vasos de precipitación 100 ml

3 Tubos de ensayo

4 pipetas pasteur

Cámara de neubauer

Cubreobjetos

Micropipeta 20-200 ul

Puntas de micropipetas

EQUIPOS: Microscopio electrónico

Espectrofotómetro de campo YSI 9000

MUESTRA: Chlorella

PROGRAMAS: ImageJ

Métodos
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1. Primero se agitó el cultivo para obtener una distribución homogénea.

2. Posterior a esto se tomó 1 mL de muestra del cultivo y se colocó en un tubo de ensayo de 10 mL.
3. A continuación se agitó la muestra y se succionó con una pipeta pasteur, se realizó tres diluciones 1:1, 1:10 y
1:50
4. Una vez realizadas las 3 diluciones se procedió a colocar una gota en la cámara de neubauer y se lo cubrió con el
cubreobjetos, se esperó a que las células se distribuyeran en la cámara.
5. Cuando ya se estabilizó la muestra se observó en el microscopio, se tomó fotografías de los diferentes
cuadrantes (A, B,C, D), con la ayuda del programa ImageJ se realizó el conteo de células presentes en los 4
cuadrantes, seguido de esto se sacó un promedio y se aplicó la siguiente fórmula para obtener la concentración
celular C:

C = N x10^4x FD
Dónde:
C = Concentración celular (cél/mL).
N = promedio del conteo celular de los cuadrantes (A, B, C, D).
104= factor de conversión de 0.1 μL a 1 mL.
FD = factor de dilución (cuando la densidad celular es muy alta > 500 células por cuadrante).

Concentración celular mediante densidad óptica

1. Como primer paso se calibró el espectrofotómetro a la longitud de onda seleccionada (680 o 550nm).
2. A continuación se enceró el equipo colocando 1 ml de agua destilada en un vial de medición.
3.Posterior a esto se agitó las diluciones para obtener una distribución homogénea de las células.
4. Se tomó 1 ml de muestra con una pipeta Pasteur.
5. Finalmente se colocó la muestra en un vial de medición y se la puso en el espectrofotómetro para medir la
absorbancia.

MARCO TEÓRICO
1. Microalgas
Son organismos unicelulares eucariotas fotosintéticos capaces de transformar la energía luminosa en energía
química con una eficiencia cuatro veces superior a la de las plantas. Su importancia radica en su papel como
productores primarios de la cadena trófica, que las constituyen en las primeras formadoras de materia orgánica. Por
su tamaño reducido y variado (5–50 µm en promedio) son de fácil captura y digestión por multitud de organismos
que se alimentan en forma directa del fitoplancton (Abalde, 2004).
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Las microalgas como organismos autótrofos fotosintetizadores, dependen de la luz para su desarrollo y producción
de materia orgánica. La respuesta fotosintética a la energía luminosa se caracteriza por una respuesta lineal baja al
incremento en la irradiancia, hasta llegar a su máxima capacidad fotosintética, donde las células son
independientes de la irradiación (Abalde, 2004).

Entre los compuestos de más interés obtenidos de las microalgas, destacan los carotenoides, biodiesel,
ficobiliproteínas, lípidos, polisacáridos, y compuestos con actividad biológica provenientes de las especies más
utilizadas tales como Dunaliella, Spirullina y Porphyridium. (Abalde 1995), además de Chlorella, y
Haematococcus. Se han identificado más de 600 carotenoides producidos naturalmente en plantas, animales y
hongos, de los cuales 400 han sido aislados y caracterizados; de éstos sólo un número reducido se utiliza
comercialmente destacando entre ellos el β-caroteno y la astaxantina y solo 50 poseen actividad provitamina A
(Barbarena, 1990).
2. Sistemas de cultivo
Los sistemas de cultivo de microalgas se pueden clasificar, según su configuración y tipo de funcionamiento, en
sistemas abiertos (estanques) y fotobiorreactores (FBRs) (Ho, 2011).
- Sistemas abiertos: Son los más comunes para la producción comercial de microalgas y son una tecnología
sencilla, activándose las microalgas en estanques de 20 a 50 centímetros de profundidad. Estanques de
canales son los más empleados; suelen ser canales de hormigón ovalados donde el cultivo se recircula y
mezcla para favorecer la estabilización del crecimiento y productividad de las microalgas. Las microalgas
obtienen el CO2 que necesitan por difusión desde la atmósfera o de emisiones de gases industriales, aunque
a veces es necesario instalar difusores en el fondo del estanque. La producción mediante estanques tiene la
gran ventaja de ser un método más barato que los FBRs, en inversión, mantenimiento y consumo
energético. Sin embargo tiene desventajas, como su facilidad de contaminación, mezclado poco eficiente, la
falta potencial de CO2 y la limitación de la luz en las capas inferiores.
- Fotobiorreactores: Son sistemas cerrados transparentes, de plástico o vidrio, con geometrías de diversos
tipos (tubulares, cilíndricas o planas). Su desarrollo es posterior al de los estanques y su configuración y
geometría dependen de condiciones locales, del producto a obtener y de las especificaciones económicas
del sistema. En estos sistemas se obtiene una mayor productividad, fundamentalmente porque mejora la
eficiencia de la fotosíntesis y la capacidad de fijación del CO2 .
3. Chlorella
Es un género de microalga verde acuática que forma parte de la familia Chlorophceae, son organismos simples, no
móviles. Estas fueron una de las primeras algas que se aislaron como un cultivo puro en 1980 por Matinus
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Beijerinck (Miyachi, 1992). Esta microalga se ha utilizado en estudios de fotosíntesis y respiración, además de que
mucho del conocimiento generado sobre la síntesis de carbohidratos en microalgas ha sido obtenido por estudios
de esta especia (Ramazanov, 2006).
3.1 Caracterización
Se caracterizan por tener forma elíptica o esférica, es un alga verde unicelular, que tiene un solo cloroplasto, pared
celular rígida y carece de flagelos. El modo de reproducción de estos organismos eucariotas es por vía asexual en
donde cada célula madre madura produce de 4 a 8 esporas. La división celular se lleva a cabo durante la noche y el
incremento de volumen celular en el día, dependiendo estos ciclos de la intensidad de la luz y a las temperaturas a
las cuales la microalga esté expuesta (Richmond, 1986).
RESULTADOS:
Los resultados obtenidos se presentarán en tablas y en gráficos a continuación

Tabla 1. niveles de absorbancia arrojados por espectrofotómetro

Diluciones de microalga Chlorella Absorbancia

1-1 0,500

1-10 0,910

1-50 0,048

Tabla 2. Datos arrojados de la muestra número 1 ( 1-1) por el programa IMAGEJ : número de esporas, área total,
tamaño promedio

Tabla 3. Datos arrojados de la muestra número 2 (1-10) por el programa IMAGEJ : número de esporas, área total,
tamaño promedio
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Tabla 4. Datos arrojados de la muestra número 3 (1-50) por el programa IMAGEJ : número de esporas, área total,
tamaño promedio

Tabla 5.Datos resumen obtenidos del programa IMAGEJ del conteo de esporas de cada muestra

Muestras de Chlorella Número total de esporas Número de esporas promedio por

cuadrante de cámara de
neubauer

1-1 14054 3513,5

1-10 24172 6043

1-50 21506 5376,5

Como se observa en la tabla resumen número 5 la dilución con mayor esporas es la 1-10, cabe resaltar que el
conteo se hizo en un programa no tan exacto, por lo que pueden existir fallas.

C = N x10^4x FD
Dónde:
C = Concentración celular (cél/mL).
N = promedio del conteo celular de los cuadrantes (A, B, C, D).
104= factor de conversión de 0.1 μL a 1 mL.
FD = factor de dilución (cuando la densidad celular es muy alta > 500 células por cuadrante).

Muestras Concentración celular (cél/mL).

1-1 35135000

1-10 604300000

1-50 28800000
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Gráfico 1. Resultado arrojado por el programa IMAGEJ de la muestra número 1 (1-1) de cada cuadrante de la
cámara de neubauer
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Gráfico 2. Resultado arrojado por el programa IMAGEJ de la muestra número 2 (1-10) de cada cuadrante de la
cámara de neubauer
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Gráfico 3. Resultado arrojado por el programa IMAGEJ de la muestra número 3 (1-50) de cada cuadrante de la
cámara de neubauer

DISCUSIÓN:
Según (Hernández, 2014), la elección de las especies va directamente relacionado con la finalidad que se le desea
brindar a la biomasa, si esta es para ficorremediación las especies predominantes dentro de un sistema abierto
dependen de factores ambientales, operacionales y parámetros biológicos, las microalgas para ficorremediación
deben cumplir con 3 condiciones como una alta tasa de crecimiento, alta tolerancia a la variación estacional, diurna
si es un sistema abierto y buena capacidad para formar agregados.

Según (Calderón, 2019), las algas están expuestas a diferentes fuentes de estrés, la tasa de producción de especies
reactivas de oxígeno aumenta significativamente, por la acumulación de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
reducida (NADPH), aumentando la actividad antioxidante. La catalasa degrada el peróxido de hidrógeno sin
consumir reductores celulares, ya que esta enzima proporciona a la célula de un mecanismo eficiente
energéticamente para remover el peróxido, aunque hay complementos enzimáticos, como glutatión reductasa (GR)
y Ascorbato peroxidasa (APX) las cuales también realiza el proceso de detoxificación para remover peróxido de
hidrógeno.
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CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:
CONCLUSIONES
Al realizar las tres diluciones se puedo observar que la mayor concentración en cuanto al recuento celular en
Chlorella sp se dio en la dilución 1:10, con lo cual se llega a la conclusión que a pesar de ser la segunda muestra
más diluida es la poseedora de mayor cantidad de células, sin embargo este resultado es algo dudoso por lo que se
piensa que el programa empleado puede tener un grado de inexactitud al momento de hacer el recuento mediante la
imagen que se tomó en el microscopio.
Al hacer uso del espectrofotómetro en cuanto a la determinación de la concentración celular mediante densidad
óptica de igual manera se tuvo el mejor resultado con la dilución 1:10 con una absorbancia de 0,910 seguida por la
dilución 1:1 con una absorbancia de 0,500 y por último se tuvo a la dilución 1:50 con una absorbancia 0,048, con
estos resultados se confirma que hay mayor cantidad de células en la concentración 1:10.
El uso de programas como el IMAGEJ son de gran utilidad ya que mediante estos facilitan el proceso de recuento
de esporas, además nos permite ahorrar tiempo en el laboratorio, sin embargo resulta muy importante tener una
buena calidad en las imágenes tomadas para que así el programa pueda arroja buenos resultados.
RECOMENDACIONES
- Se recomienda tomar buenas fotografías para que el programa pueda detectar e identificar con facilidad.
- Verificar que la muestra esté bien tomada, es decir sin que se generen burbujas en las pipetas y
micropipetas.
- Cuando existe una gran concentración de esporas se recomienda hacer diluciones para poder evitar
superposiciones y poder realizar un conteo adecuado.
- Se recomienda usar guantes para manipular los tubos aforados para el espectrofotómetro, ya que las huellas
dactilares pueden afectar la lectura de la absorbancia.
ANEXOS

Anexo 1.Diluciones de Anexo 2.Diluciones al Anexo 3.Diluciones de Anexo 4.Análisis en

muestra de microalga 1:1; 1:10; 1:50 de muestra de microalga espectrofotómetro de
Chlorella microalga Chlorella Chlorella para análisis muestra al 1-50
en espectrofotómetro
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Anexo 5.Análisis en Anexo 6.Análisis en Anexo 7.Conteo de Anexo 8.Conteo de

espectrofotómetro de espectrofotómetro de esporas de microalga esporas de microalga
muestra al 1:50 muestra al 1:50 Chlorella en cámara de Chlorella en cámara de
neubauer (C1-M1) neubauer (C2-M1)
Cuadrante 1 de la
muestra 1

Anexo 9.Conteo de Anexo 10.Conteo de Anexo 11.Conteo de Anexo 12.Conteo de

esporas de microalga esporas de microalga esporas de microalga esporas de microalga
Chlorella en cámara de Chlorella en cámara de Chlorella en cámara de Chlorella en cámara de
neubauer (C3-M1) neubauer (C4-M1) neubauer (C1-M2) neubauer (C2-M2)
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Anexo 13.Conteo de Anexo 14.Conteo de Anexo 15.Conteo de Anexo 16.Conteo de

esporas de microalga esporas de microalga esporas de microalga esporas de microalga
Chlorella en cámara de Chlorella en cámara de Chlorella en cámara de Chlorella en cámara de
neubauer (C3-M2) neubauer (C4-M2) neubauer (C1-M3) neubauer (C2-M3)

Anexo 17.Conteo de Anexo 18.Conteo de

esporas de microalga esporas de microalga
Chlorella en cámara de Chlorella en cámara de
neubauer (C3-M3) neubauer (C4-M3)

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA:

Abalde, J. (2004). Microalgas en acuicultura: calidad nutricional. ALGAS 32 Diciembre de 2004. 40pp: p 16-18.

Abalde J.(1995). Microalgas Cultivo y Aplicaciones, Universidad de la Coruña. Departamento de Biología Celular y

Molecular, Facultad de Ciencias. La Coruña, España. 210 pp.

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Barbarena, C. (1990). Crecimiento, ciclo de vida y tolerancia a la salinidad de la microalga Dunaliella viridis Teodoresco.

Revista de la Facultad de Oceanografía Pesquera y Ciencias Alimentaría. 2: 34-53.

Cajamar, (2015). ¿QUÉ SON LAS MICROALGAS? INTERÉS Y USO. Retrieved noviembre 22, 2021, from

https://www.cajamar.es/storage/documents/microalgas-1444391623-ca345.pdf

Calderon, I. (2019). RESPUESTAS FISIOLÓGICAS Y CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE Chlorella vulgaris (Chlorellaceae)

EXPUESTA A FENANTRENO. Retrieved novimbre 22, 2021, from

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Hernández, A. (2014). Microalgas, cultivo y beneficios. Retrieved noviembre 22, 2021, from

https://scielo.conicyt.cl/pdf/revbiolmar/v49n2/art01.pdf

Ho, S. (2011). Perspectives on microalgal CO2 -emission mitigation systems - A review. Biotechnology Advances 29:

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Miyachi, D. (1992). Chlorella. Microalgal biotechnology. Cambridge University Press. p. 3-26.

Ramazanov, A. (2006). Isolation and characterization of a starchless mutant of Chlorella pyrenoidosa. Phycological

Research. 54:255-259.

FIRMAS EVALUACIÓN

Formato (3):
Bibliografía (5):
Análisis estadístico (5):
Fundamento científico (7):
F: F:
…………………………………… …………………………………
Docente ………………………………………
Jefe de Grupo Nombre: Nota: /20
Nombre: Ing. Juan Ortiz T.
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