Universidad de Puerto Rico -Recinto de Ciencias Médicas

Escuela de Profesiones de la Salud

Programa de Tecnología Médica

TMED 4001
Preparado por Prof. Ruth Rosario, MS MT(ASCP)
Enzimas de Importancia Clínica
 Isoenzimas

 Múltiples formas naturales de una enzima

catalizando la misma reacción en una
especie en particular
 No se clasifican a base de su distribución

en tejido sino de la reacción que catalizan

 Si
se encuentran en diferentes tejidos pero
catalizan la misma reacción son isoenzimas
 Isoenzimas

 Pueden diferir químicamente (estructura),

físicamente e inmunológicamente
 En el laboratorio clínico las podemos

distinguir a base de:

 Su movilidad electroforética hacia el ánodo(+)
 Inactivación ante anticuerpos

 Inactivación a
 Clasificación de las Isoenzimas - IUB

1. Proteínas genéticamente independientes

2. Variantes genéticas en estructura de

proteínas

3. Heteropolímeros- dos o más sub-unidades

que se unen de forma diferente
 cadenasde polipéptido que son parte integral
de una proteína o enzima
Composición de las Isoenzimas
 Proteínas compuestas de dos o más
cadenas polipéptidos o sub-unidades

* Ejs. 2 sub-unidades de dos tipos A y B

3 isoenzimas - AA, AB, y BB
5 isoenzimas - AAAA, AAAB,
AABB,ABBB y BBBB
Métodos de Análisis Isoenzimas
Función

 Asociada a regeneración de ATP en

sistemas de transporte y contráctiles
 Función fisiológica predominante es
células musculares
 Almacena energía en forma de fosfato de

creatina
 Fuentes en Tejido

 Se encuentra grandes cantidades en

músculo esqueletal, músculo cardíaco y
cerebro

 Y en pequeñas concentraciones en vejiga,

placenta, tracto gastrointestinal, tiroides,
útero, riñones pulmón, próstata, bazo,
hígado y páncreas
 Importancia Clínica

Aumentada
 Desórdenes músculo cardiaco y esqueletal :

 “Acute Myocardial Infarction (AMI) “

 Distrofia muscular - “Duchenne muscular
distrophy “ (50-100 veces lo normal)
 Desórdenes sistema nervioso central
(ocasionalmente)
 Hipotiroidismo

 Condiciones no patológicas como el hacer

ejercicio e inyecciones intramusculares
Isoenzimas
 Tienen dos subnidades de heteropolímeros
 B (Brain) y M (muscle)

 Tiene tres isoenzimas de dos unidades

*CK1- BB *CK2- MB *CK3- MM

 Su migración en electroforesis da origen a

sus números
Migración Electroforética
CK 1 -CKBB

 Se encuentra en cantidades pequeñas en los

tejidos y además tiene una media vida corta
(1-5 horas)

 Está en concentraciones altas en el Sistema

Nervioso Central, Sistema Gastrointestinal
y en el útero durante el embarazo.
 CK2 -CKMB
 En el tejido cardiaco se encuentra el 20%
CK-MB total
 CK-BM > 6% del CK total indica daño al AMI.
 AMI el CK-MB comienza a subir 4-8hrs., pico 12-
24 hrs. y baja 48-72 hrs.
 Diagnóstico de AMI debe ser hecho en
conjunto otras enzimas AST y LD
 Proteínas Troponina I y Troponina T

 Mejores indicadores de AMI

Time Course of Enzyme Activity
in Miocardial Infarction
Time Course of Enzyme Activity
in Miocardial Infarction

Onset of Peak Duration of

Enzyme Elevation (h) Activity (h) Elevation (days )

CK 4-8 12-24 3-4

CK MB 4-8 24-38 2-3
AST 8-12 24 5
LDH 12-24 72 10
LDH1> 12-24 5
LDH2
CK 3 - CKMM
 Fracción que se encuentra principalmente
en el músculo estriado
 Suero normal consta de aproximadamente
el 94% de CK-MM
 La actividad del corazón está atribuida
mayormente a CKMM
 Aumentado en hipotiroidismo debido a la
implicación del tejido muscular
 Isoenzimas CK Atípicas

 Macro CK
 Complejos de CK-BB con las IgG e IgA
 Complejos de CK-MM con lipoproteínas
 No se asocia con ninguna patología

 CK-Mi
 Está unida a la superficie exterior de la membrana
mitocondrial interna del músculo, el cerebro y el
hígado
 Existe como un dimero de subunidades idénticas
Isoenzimas CK Atípicas (cont)
 CK-Mi no está presente en el suero normal
 No se correlaciona con una enfermedad
específica, pero es un indicador de enfermedad
grave como tumores malignos y anomalías
cardíacas.

FIGURE 12-5.
Electrophoretic migration pattern of normal and atypical CK isoenzymes.
Métodos de Análisis
 Electroforesis - Método de selección
 Se
visualizan las bandas de AK (quinasa de
adelinato) -bandas atípicas en muestras
hemolizadas
 Cromatografía de Intercambio Iónico
 Inhibición de Anticuerpos de M – Mide
CK-MB
 Seinactiva fracción M y se mide el CK total
antes y después de la inhibición.
Métodos de Análisis
 RIA - Mide CKMB
 No hay reacción cruzada porque mide la
concentración de la proteína (enzima) y no la
actividad enzimática
 Puede detectar CKMB inactivado

 Método de Oliver-Rosaki
 Mide el cambio en absorbancia a 340 nm.
mediante el uso de una reacción acoplada
 Directa: NADH a NAD+

 Reversa: NADPH+ a NADPH

 Reacción Acoplada

 Directa

 Reversa
CK

Muestra de Fuentes
Selección de Error
 Suero  Evitar muestra
 Inhibida por EDTA, hemolizada
citrato y fluoruro  >3.2mg/dl Hgb -
aumenta AK
 Plasma con heparina  Inactiva con la luz
 Estable 4°C (24 hrs.)
-20°C (> 24 hrs)
Valores de Referencia
 CK total
Mujeres 15-130 IU/L
Hombres 15-160 IU/L

 CKMB
0-5.4 ng/l < 6% CK total
 Función

 Cataliza la conversión de ácido láctico y

ácido pirúvico

 Es una enzima de transferencia de

hidrógeno y utiliza como coenzima NAD+
 Fuentes en Tejido

 Se encuentra grandes cantidades en corazón,

hígado, músculo esqueletal, riñones y
eritrocitos

 Pequeñas concentraciones en pulmón,

músculo liso y cerebro
 Importancia Clínica
Aumentada:
 Enfermedades cardíacas como AMI

 Desórdenes hematológicos como anemia

perniciosa , leucemias y hemolisis
 Desórdenes hepáticos como hepatitis
virales y cirrosis
 Infartos pulmonares

 Enfermedades músculo esqueletal y

renales
Time Course of Enzyme Activity
in Miocardial Infarction
Time Course of Enzyme Activity
in Miocardial Infarction

Onset of Peak Duration of

Enzyme Elevation (h) Activity (h) Elevation (days )

CK 4-8 12-24 3-4

CK MB 4-8 24-38 2-3
AST 8-12 24 5
LDH 12-24 72 10
LDH1> 12-24 5
LDH2
Isoenzimas
 Dos sub-unidades diferentes: H(heart) y
M(muscle)

 Arregladas en 5 formas o isoenzimas

diferentes
LD1(HHHH) LD2(HHHM) LD3(HHMM)
LD4(HMMM) LD5(MMMM)
Migración Electroforética
LD1 y LD2
 El tejido cardíaco y las células rojas de la
sangre contienen una mayor concentración
de LDH-1
 Aumentado en AMI y en hemólisis intravascular

 Razón LDH1/LDH2 > 1

 Suero de muestras hemolizadas
LD1 y LD2
 “Flip pattern” - LDH-1> LDH-2
 Sugestivo de AMI
 Ocurre 12-24 hrs. luego del infarto y persiste
hasta por 5 días, estando presente aún cuando
el CK-MB haya disminuido
LDH3 ,LDH4 y LDH5

 LD3
 Pacientescon Edema Pulmonar y en pacientes
con varios carcinomas

 LDH4 y LDH5
 Pacientes con desórdenes hepáticos y en las
distrofias musculares.
Isoenzimas LDH Atípicas

 LDH 6 - Alcohol deshidrogenasa

 Pacientes con insuficiencia cardiovascular
arteriosclerótica
 Pronóstico grave y de muerte inminente

 Macro LDH
 Complejos de LDH con IgG e IgA
 Métodos de Análisis
 Cromatografía intercambio iónico

 Inmunoinhibición

 Inmunoensayo

 Especificidad por sustrato

 Km-LD1
LDH

Muestra de Fuentes
Selección de Error
 Suero  Hemólisis interfiere
 Los  RBC contienen [LD] de

anticoagulantes 100-150X que el suero

interfieren normal
 Estable 4°C por 48 hrs.,
25°C por 24 hrs.
 Congelarla hace que se
pierda la actividad enzima
Valores de Referencia

90-320 IU/L
Función
 Cataliza la transferencia de un grupo amino
a un  ceto-ácido

 Utiliza co-enzima “piridoxal5 fosfato” - (P5P)

Función

 Importante en síntesis y degradación de

aminoácidos
 Los ceto-ácidos se oxidan en TCA para
proveer una fuente de energía
 “Serum glutamic-oxaloacetic transaminase
(SGOT, or GOT)”
 Isoenzimas

 Citoplasmática y mitocondrial
Fuentes en Tejido
 Distribuido a través de todo el cuerpo
humano

 Mayor concentración en:

 Tejido cardíaco, hígado y músculo esqueletal

 Pequeñas cantidades en:

 Riñones, páncreas y eritrocitos
 Importacia Clínica
Aumentada
 AMI

 Aumenta en 6-8 hrs., pico en 24 hrs. y regresa

a lo normal en 5 días
 “Acute Hepatocelular disorders”
 Hepatitis viral- 100X normal
 Cirrosis- 4X normal

 Distrofias musculares y condiciones

inflamatorias - 4-8X normal
Time Course of Enzyme Activity
in Miocardial Infarction
Time Course of Enzyme Activity
in Miocardial Infarction

Onset of Peak Duration of

Enzyme Elevation (h) Activity (h) Elevation (days )

CK 4-8 12-24 3-4

CK MB 4-8 24-38 2-3
AST 8-12 24 5
LDH 12-24 72 10
LDH1> 12-24 5
LDH2
Métodos de Análisis

 Colorimétrico- Reitman &

Frankel
AST
oxaloacetato +2,4dinitrofenilhidrazina
producto con color
505 nm
Métodos de Análisis
 Cinético – “Méthodo Karmen”
 Reacción acoplada

340 nm
AST

Muestra de Fuentes
Selección de Error
 Suero, plasma  Hemólisis es inaceptable
 Anticoagulantes  Eritrocito [10X normal]
no interfieren  Lipemia interfiere en los
métodos colorimétrico
 Estable a 48 hrs a R.T.
7 días 3-4°C
Valores de Referencia

5-30 U/L
Función

 Cataliza la transferencia de un grupo

amino a un  ceto-ácido

 Utiliza P5P como coenzima

Fuentes en Tejido
 Distribuida en todos los tejidos del cuerpo

 Concentraciones aumentadas en:

 Hígado -altamente específica a este
órgano

 Concentraciones pequeñas
 Tejido cardíaco
Importancia Clínica

 Evaluación de desórdenes hepáticos

 Aumenta y se mantiene así por más
tiempo porque tiene media (1/2) vida
más larga

 Concentración no cambia en AMI

Métodos de Análisis

 Colorimétrico- Reitman & Frankel

ALT
piruvato + 2,4 dinitrofenilhidrazina color
505 nm

 Cinético
 enzima LDH como indicador
LDH
piruvato + NADH lactato + NAD+
340 nm
 ALT

Muestra de Fuentes
Selección de Error
 Suero  Hemólisis no interfiere
 Oxalato, heparina
y citrato no  Estable 3-4 días de 2-8°C
inhiben su
actividad pero
pueden causar
turbidez
Valores de Referencia

6-37 U/L
 Función

 Catalizan la hidrólisis de fosfomoesteres

un pH alcalino

 Enzima poco específica

 Fuentes en Tejido

 Presente en casi todos los tejidos del

cuerpo humano
 Altas concentraciones en:
 Hígado
 Hueso
 Riñones
 Intestinos
 Placenta
Importancia Clínica
Desórdenes hepatobiliares
 Condiciones obstructivas

 Obstrucción tracto biliar hay un aumento en la

síntesis de la enzima debido a la colesostasis
(3-10X)

 Condiciones no obstructivas
 Hepatitis o cirrosis (< 3X)
Importancia Clínica
Desórdenes de hueso
 Actividad confinada a los osteoblastos-
crecimiento de hueso

 Aumentada en:
 “Paget’s disease”(Osteitis deformans)
 Facturas de huesos
 Periodos de crecimiento fisiológico en
niños
 Isoenzimas ( 5 fracciones)

 Hígado
 Hueso

 Riñón

 Placenta

 Neoplasmas
 Fracción de Hígado

 Migra más rápido en electroforesis

 Se subdivide en dos: banda mayor de

hígado y banda menor de hígado

 Si ALP total está aumentada usualmente

esta fracción es la que está elevada
 Fracción de Hueso

 Elevada en niños durante periodos de

crecimiento y adultos mayores 50 años

 Lábil al calor

 Elevada en “Metastatic carcinoma”

 Fracción de Placenta
 Embarazo
 Normal 16-20 semanas
 Aumenta hasta el término del embarazo
 Luego del parto retorna a valores normales en 3-
6 días

 Embarazos complicados como preclamsia,

eclampsia y abortos

 Estable al calor
Fracción de Intestino

 Depende del grupo sanguíneo del

individuo y su estatus de secretor
 Grupo B u O que son secretores tienen
más probabilidad de tener esta fracción

 Aumentada en lesiones del intestino

delgado
Otras Isoenzimas

 Asociadas a neoplasma (3-15 % pacientes

cáncer)
 No se utiliza para diagnóstico, su uso es en
el monitoreo de terapia
 Más comunes Regan y Nagao
(Carcinoplacental ALP)
 Regan - más estable al calor- resiste
denaturación a 65°C por 30 min.
Separación Isoenzimas

 Electroforesis

 Inhibición química

 Inactivación por calor

Migración Electroforética
Acetato de Celulosa
Migración Electroforética
Gel Poliacrilamida
 Separation Properties of ALP Isoenzimes

Property Liver Bone Intestine Placental

Polyacrylamide Moves fastest 2nd fastest 3rd fastest Overlaps with
gel electrophoresis bone and liver
bands
Heat inactivation 50-70 90-100 50-60 0
(% inactivity)
L-Phenylalanine 0-10 0-10 75 75
inhibitors
(% inactivity)
Urea inhibitor Strong Very strong Moderate Moderate
 Métodos de Análisis

 Electroforesis
 Bowers & McComb
 Calculala actividad de ALP basado en
absortividad molar de p-nitrofenol
ALP
p-Nitrofenol-fosfato p-Nitrofenol + Ión fosfato
pH 10.2
incoloro amarillo

Aumento en absorbancia a 405 nm /directamente

proporcional actividad enzimática de ALP
 ALP

Muestra de Fuentes
Selección de Error
 Suero  Hemólisis es tolerable si
 Plasma heparinizada es poca
 otros  Dieta en pacientes
anticoagulantes secretores
interfieren al  Su actividad aumenta
formar un lentamente en
complejo con el almacenamiento, es mejor
Mg+2 analizar la muestra el
mismo día de tomada
Valores de Referencia

 Dependiente del sexo y la edad

 Menores de 12 años < 350 U/L

 Adulto 30-95 U/L
Función

 Pertenece al mismo grupo de ALP, una

hidrolasa, que cataliza la misma reacción
pero aun pH ácido
Fuentes en Tejido

 Se encuentra principalmente en la
próstata

 Puede haber actividad de ACP en hueso,

hígado, bazo, riñones, eritrocitos y
plaquetas
Importancia Clínica
 Diagnóstico carcinoma prostático
 Hoy existe un mejor marcador PSA

 Utilidad en medicina forense- casos de

violación
 Puedeser examinada en lavados vaginales
porque en fluido seminal persiste hasta por 4
días
Importancia Clínica

 Aumentada
 Hiperplasia de próstata

 Enfermedades de hueso que envuelven

osteoclastos

 Trombocitopenia por destrucción de

plaquetas
Métodos de Análisis

 Mismos que se usan para medir ALP

pero a un pH ácido

 Inhibición por tartrato

 Medir ACP prostática ya que es la única
fracción que es inhibida por tartrato
 ACP

Muestra de Fuentes
Selección de Error
 Suero y plasma  Hemólisis aumentan
 Heparina, EDTA actividad 6-315%
 Rápida inactivación a R.T.
 Fluido seminal y pH > 6
hisopo - en vagina  Disminuye la actividad un
 medio con caldo 50% en 1 hr.
acidificado Acidificada es
estable por 2 días R.T
Valores de Referencia

ACP total
 Hombres 2.5 - 11 U/L
 Mujeres 0.3 - 9.2 U/L

ACP prostática
0.2- 5.8 U/L
Función

 Cataliza la degradación de almidón

(amilosa y amilopectin) y glucógeno
 AMS hidroliza los enlaces glucosídicos  1,4

 Activadores
 Cloruro , bromuro, nitrato, clorato, fosfato
Fuentes en Tejido

 Principalmente en las células acinares

del páncreas y en las glándulas
salivares

 Menor concentración en músculo

esqueletal, intestino delgado, trompas
de falopio
Importancia Clínica
 Aumentada
 Desórdenes del páncreas como pancreatitis
aguda, cáncer
 Desórdenes salivares como paperas,
paratiroides
 Enfermedades intra-abdominales como
apendicitis aguda, obstrucción intestinal,
coleostasis, úlcera peptídicas
 Otros desórdenes como ruptura de embarazos
ectópicos, insuficiencia renal y ceto-acidosis
diabética
Importancia Clínica
 Disminuida
Condiciones de hígado como cirrosis,
carcinoma, hepatitis

Otras condiciones como alcoholismo,

toxemia embarazo y administración de
glucosa
Pancreatitis Aguda
 Niveles de AMS en suero comienzan a
subir 2-12 hrs., tienen un pico a las 24
horas y vuelven a lo normal dentro de 3-5
días

 Niveles de AMS en orina pueden estar

aumentados hasta por 10 días
Macroamilasemia
 Condición asintomática donde hay
aumento de amilasa en suero y
disminución en orina

 Complejos de IgG e IgA con la enzima

Isoenzimas

 “S-type”
 S1, S2, S3
 Origen salivar, pulmonar y trompas de
falopio
 “P-type”
 P1, P2, P3
 Origenpancreático
P3- elevada en pancreatitis aguda
 Métodos de Análisis
 Amiloclástico
 Mide la disminución en sustrato (almidón)

almidón + I azul obscuro AMS

almidón + I
Se mide disminución en color

a. cronométricos- mide el tiempo que se toma

hidrolizar almidón
b. amilométricos-mide cuanto queda fijado luego de
un tiempo dado
 Métodos de Análisis

 Sacarogénico (Somogyi mod.

por Henry & Chiamori)
 Método clásico de referencia
 Mide formación de producto

almidón AMS maltosa + glucosa

Se mide glucosa “Alkaline copper reagent”

Métodos de Análisis

 Cromogénico
 “Dye method”

almidón + tinte AMS cambio en color

(“triazine derivative”)

Aumento en color es proporcional [AMS]

 Métodos de Análisis

 Enzimático (1)

AMS
almidón maltosa + glucosa + dextrinas
maltosa 2-glucosa
glucosa + O2 gluconolactona + H2O2

Se mide consumo de O2
 Métodos de Análisis

Enzimático (2)
AMS
maltopentosa maltotriosa + maltosa
maltosa +maltotriosa glucosa
glucosa + ATP glucosa 6-fosfato + ADP
glucosa 6-fosfato + NAD+
340 nm 6-fosfoglicolato + NADH
265 nm
 AMS

Muestra de Fuentes
Selección de Error
 Suero  Estable- R.T./ una
 Plasma semana y a 4°C/ 2 meses
heparinizada  Evitar pipetear por boca
 Muestras lipémicas
 EDTA, citrato y disminuyen actividad
oxalato quelan enzima
el Ca+2  Morfina y opiatos causan
 Orinas no falsos positivos
acidificadas
Valores de Referencia

Suero
95-290 U/L

Orina
35-4000 U/24 hrs
 Función

 Hidroliza los enlaces de ésteres de las grasas

en las posiciones 1 y 3 para producir alcohol
y ácidos grasos

 Substrato debe estar emulsificado

 Rapidez de la reacción aumenta en presencia de
la colipasa y de sales biliares
Lipasa

 Calcio
 Potencia actividad enzimática
combinándose con los ácidos grasos
 Debe añadirse en cantidades pequeñas
ya si Ca+2 aumenta mucho puede tener
un efecto adverso (inhibidor)

 Necesita agentes emulsificantes

 Sales biliares y albúmina


Fuentes en Tejido

 Se encuentra principalmente en el
páncreas

 Presente en el estómago e intestinos

Importancia Clínica
 Pancreatitis aguda
 Es más específico pero menos sensitivo que
AMS
 Aumenta en suero igual que AMS pero persiste
hasta por 5 días
 LPS es normal en condiciones glándulas
salivares
 Tres isoenzimas

 L2 es la más sensitivay específica

 Métodos de Análisis

 Titulación - Cherry & Crandall

 Usa como sustrato un emulsión amortiguada de
aceite de oliva al 50%
 Modificación - usa triolina que es una forma pura
triglicéridos
 Mide los ácidos grasos libres titulándolos con
NaOH y fenoltaleína
*24 hrs. incubación
Métodos de Análisis

 Turbidimétrico
 Triglicéridos en solución forman
emulsión turbia

 Colorimétricos
 Utiliza reacciones acopladas con
enzimas tales como peroxidasa y
quinasa de glicerol
 LPS

Muestra de Fuentes
Selección de Error
 Suero  Estable:
25ºC una semana
 Fluido duodenal 4°C tres semanas

 Evitar la hemólisis
 Inhibe la actividad de
la enzima
Valores de Referencia

Suero
0-1.0 U/L
Función

 Transferencia de residuos de -glutamil, de

peptidos de -glutamil a aminoacidos

GGT

 Función fisiológica no está clara pero se cree

que está envuelta en la síntesis de proteínas
y péptidos
Fuentes en Tejido

 Se encuentra en hígado, riñón, cerebro,

próstata y páncreas
Importancia Clínica

Aumentada
 Condiciones hepatobiliares

 Valores más elevados en obstrucción biliar

 Indicador sensitivo de alcoholismo

Normal
 Enfermedad ósea o embarazo
Metodo de Análisis

Rosaki & Tarlow

GGT
 glutamil-p-nitranilida + glicilglicina
-glutamil-glicilglicina + p-nitroanilina

405 – 420 nm.

 GGT

Muestra de Fuentes
Selección de Error
 Suero  Hemólisis no interfiere
 Inhibida por
citrato, oxalato y  Estable a 4° C una
fluoruro semana
Valores de Referencia

Hombres 6-45 U/L

Mujeres 5-30 U/L
Preguntas

Comunicarse con la Prof. Ruth Rosario

vía email ruth.rosario1@upr.edu