Instrumentación en Hematología

CELL-DYN SAPPHIRE

Principios de Instrumentación
UPR-RCM – TMED 4135
ASEM
Introducción
La instrumentación automatizada de
recuento de células proporciona una
mayor exactitud y una mayor precisión
que los métodos manuales. Desde la
década de 1980, la instrumentación ha
reemplazado prácticamente el conteo
manual de células. (Longanbach et al.,
2007)
 Cell-Dyn Sapphire
Analizador hematológico automatizado y multi-
parámetro desarrollado por la compañía Abbott ©.
◦ Para contar y caracterizar células de la sangre:
 WBCs, RBCs, CD3/4/8 T-cells
Equipo contiene:
◦ Analizador, PC, printer, 5 reactivos
◦ 1 probe: manual y automático
◦ 4 posiciones, se agita 16 veces
Puede realizar:
◦ 105 CBC/h
◦ 69 (CBC + retics)/h
 Componentes del instrumento

HgB

Óptico
Retic
Impedancia
WBC
Impedancia A&B
*Espectrofotómetro

Óptico Diluyente
*Espectrofotómetro: Tubería y caja de color negro para proteger de luz
 Descartar
HGB
(espectrofotometrí
HGB a)

1:215 Blanco con

reactivo de Hgb

WBC, % de NEU,
Sangre LYM, MONO, EOS # (calculado)
completa WBC y BASO (óptico)
(120μL)
1:35 nRBC y NR/W
(óptico/FL)

RETIC Retic %, Retic #

1:1,160 (calculado), IRF

RBC/PLT
PLTo y RBCo
1:290
RBCi, MCV, HCT calculado
RDW, PLTi, MPV
 Tipos de análisis que realiza
CBC
◦ WBCs y diferencial de 5 partes
 Lectura óptica absoluta y %
◦ RBCs – lectura óptica e impedancia
 Se reporta lectura de impedancia
◦ Hgb – lectura espectrofotométrica
◦ Hct – calculado
◦ Índices – MCV, MCH, MCHC, RDW (calculados)
◦ Retics – lectura óptica (%) y IRF
◦ Conteo de nRBCs
◦ PLTs – lectura óptica e impedancia
 Se reporta lectura de óptica
*RBCo y PLTi son QC internos
*IRF = Immature Retic Fraction
Tipos de muestras
Sangre en tubos con EDTA
No validado para CSF
◦ Sensibilidad 97.4%
◦ Especificidad 45.6%
◦ Arroja muchos falsos positivos
(De Smet et al., 2010)
WBC 4.00-11.00 Thou/uL
MCV 80.0-96.0 fL Mujeres
MCH 27.5-33.0 pg
MCHC 33.0-35.5 g/dL RBC 4.00-5.00 Mills/uL
RDW 11.0-14.0 % HGB 12.0-14.5 g/dL
PLT 150-450 Thou/uL HCT 35.0-45.0 %
MPV 6.90-10.80 fL
NE% 40.0-75.0 %
LY% 18.0-42.0 %
MO% 5.0-11.0 %
EO% 0.0-4.0 %
BA% 0.0-1.0 % Hombres
NE# 1.80-7.00 Thou/uL
LY# 1.00-3.50 Thou/uL RBC 4.50-5.80 Mills/uL
MO# 0.00-0.80 Thou/uL HGB 13.5-17.0 g/dL
EO#0.00-0.50 Thou/uL HCT 40.0-50.0 %
BA# 0.00-0.20 Thou/uL

Valores normales
PRINCIPIOS
Medición óptica
 Citometría de flujo
◦ Foco hidrodinámico
 Líquidos a diferentes presiones
permiten que no se mezclen
entre sí. Además, organiza las
Granularidad Lobularidad
células en una sola fila al centro
de la cubeta con un diluyente
líquido, libre de células y de Complejidad
rápido movimiento.
 Fluido de envoltura (8psi)
 Muestra + diluyente (15psi)

◦ Células individuales pasan por

la zona de detección e
interactúan con el rayo de
Tamaño
láser. Figuras del Manual de Cell-Dyn Sapphire provisto por la Lcda. Lebrón
Medición óptica
Citometría de flujo
◦ Diluciones: 3 porciones de la
muestra se transfieren de
cubetas a Optical Flow Cell
(RBC/PLT, WBC y Retics).
◦ Muestra diluída llega a la zona Granularidad Lobularidad
de detección y células
interactúan con rayo de laser
Complejidad
(luz monocromática).
◦ Se mide la luz dispersada y no
dispersada por la superficie y
estructuras internas de la célula.
◦ Se mide fluorescencia de ácidos
nucleicos teñidos de las células.
Tamaño
Figuras del Manual de Cell-Dyn Sapphire provisto por la Lcda. Lebrón
Medición óptica Lobularidad
(WBC, PLT/RBCo,
nRBC)

Granularidad Complejidad
(WBC, PLT/RBCo,
(WBC, nRBC) RETIC, nRBC)

Tamaño
(WBC, nRBC)

Figuras del Manual de Cell-Dyn Sapphire provisto por la Lcda. Lebrón

Fluorescencia

◦ Def. Es la luz absorbida a un λ y emitida otro λ un poco más largo.

◦ Detectada por un PMT (Fotomultiplicador).
◦ FL1 = RNA de Retics absorbe a 488nm y emite a 530nm
◦ FL2 = identificación de CD3/4/8
◦ FL3 = identificación de nRBCs y DNA de WBCs no viables y frágiles emite a 630nm
 Viabilidad WBCs → membrana rota o deteriorada → núcleo expuesto

La data obtenida de dispersión

óptica se coloca según la
intensidad de la señal en 256
canales y se generan gráficas:
◦ Histogramas
◦ “Scatterplots”
◦ “Contour plots”
 Datos en 2D a ser visualizado para
identificación de picos y valles
 Equipo no la genera
Figura 39-8 del libro de texto de la clase (Longanbach et al., 2007, p.
 NEU,
MONO, NEU,
LYM EOS

nRBC

RETIC,
Nucleated
cells,
mature
RBC

Resultados de reportes provistos por la Lcda. Lebrón

 Impedancia
Corriente constante entre dos
electrodos
Pasan células y generan pulsos
Parámetros: RBCs, PLTs, MCV,
RDW, MPV
Se puede determinar el volumen
celular midiendo la magnitud del
pulso que es generado.
Factor de corrección de
coincidencia:
◦ Dos o más células pasan a través de la
zona del sensor al mismo tiempo.
◦ Conteos altos: RBC, PLTs
Figura 39-1 del libro de texto de la clase (Longanbach et al., 2007,
 Mecanismo para evitar que células p. 542)

recirculen a la zona de detección.

Espectrofotometría
Es un método analítico que usa las
propiedades de la luz para hacer medidas
cualitativas y cuantitativas de un analito.
Estas medidas dependen de las
propiedades de onda y de partícula de la
luz.
Se utiliza para la medición de Hgb.
◦ 8 lecturas de Hgb.
Sistema completamente cerrado que posee una
cubeta de vidrio herméticamente sellada para
que no pase luz. Este aguanta la muestra de Hgb
diluída o el blanco.
LED verde – ilumina la muestra diluída o el
blanco.
Filtro – solamente a 540nm pasa la luz.
Foto detector – mide cantidad de luz que pasa
por la muestra o blanco.
Ley de Beer
Describe la relación de la absorción de la
luz por una solución y la concentración de
esa solución.
La concentración de una sustancia es
directamente proporcional a la cantidad de
luz absorbida.
A mayor concentración, mayor luz
absorbe.
 Interferencias

Aglutinin Auto WBCs Aglutini

Agregado as frías aglutini no nas frías
s de NEU Lipemi
nas viables
PLTs a Auto
PLTs LYM aglutinin
RBCs gigantes
as
resistente gigante frágile Cuerpos
s a lisis Hemólis s s de Heinz
is y Howell-
↑ WBCs RBCs RBCs Jolly
Grumos microcític resistente Malaria y
de PLTs ↑ WBCs os s a lisis Babesiosis

1-2) Fotos de WBCs y RBCs por Lara Figueroa 5) http://www.cdc.gov/dpdx/artifacts/index.html#miscblood

3) http://www.bio.davidson.edu/courses/molbio/molstudents/spring2010/hua/Hemoglobin.html
4) http://www.jbc.org/content/278/51.cover-expansion 6) http://cmdi.medicine.dal.ca/Human_Histology/Lab7/61_LO10.JPG
Mantenimiento
Limpieza diaria de pozos/cubetas
Limpieza automática de líneas y apertura del transductor
“Background”
◦ Correr CBC al diluyente
 Se espera que no lea nada
 No contaje falso – ej. Reactivo contaminado
“Auto-drain” y “auto-rinse”
Calibración cada 6mo
Linealidad
◦ WBC → 0.0-250.0 x 103/μL
◦ RBC → 0.0-7.50 x 106/μL
◦ Hgb → 1.0-25.0 g/dL
◦ PLTo → 0.0-2000 x 103/μL
Control de calidad
Para determinar:
◦ Si hay errores del instrumento o del operador.
◦ Si el error es específico, aleatorio o del procedimiento.
◦ Qué pasos tomar para corregir el error.
Se corren 3 controles:
◦ Diarios (bajo, normal y alto) cada 12h.
◦ Después de cambiar el lote de reactivos.
◦ Después de mantenimiento, reemplazo de
componentes o servicio técnico.
◦ Después de calibrar.
Problemas más comunes
Manejo del equipo por diferentes
personas.
Arreglo de líneas, limpieza de pozos y
demás partes para ejecución óptima.
CBC y WBC extendido toma más tiempo
para realizar la lectura.
RBCs de bebés toman más tiempo para
romper por HgB fetal.
Ventajas y desventajas
• Equipo delicado

• Requiere mucho
mantenimiento
• Poco volumen de preventivo (6mo)
muestra (120μL)
• Realiza otras
• Porcentaje de pruebas
nRBCs
• Costo
• Viabilidad de
• Adiestramiento
WBCs
del personal
• Óptica de PLTs

• Automatizado
Referencias
Abbott Diagnostics. (2014). CELL-DYN Sapphire. Retrieved from
http://www.abbottdiagnostics.com/Products/Instruments_by_Platform/?
system=cell-dyn&suffix=sapphire
De Smet, D., Van Moer, G., Martens, G. A., Nanos, N., Smet, L.,
Jochmans, K., & De Waele, M. (2010). Use of the Cell-Dyn Sapphire
Hematology Analyzer for Automated Counting of Blood Cells in Body
Fluids. Am J Clin Pathol, 133, 291-299. doi:
10.1309/AJCPY7J7OLASZAPC
Longanbach, S. A., Chapman, D. H., Bourlier-Waldron, K., & Miers, M.
K. (2007). Automated Cell Counting Instrumentation and Point of Care
Testing. In B. F. Rodak, G. A. Fritsma, and K. Doig (Eds.), Hematology:
Clinical Principle and Applications (pp. 541-544, 549-552). St. Louis,
MO: Saunders-Elsevier.
Rodríguez, J. (2014). Técnicas analíticas: Radiación electromagnética.
San Juan, PR: TMED-4135.
Rosario, R. (2014). Contadores de partículas. San Juan, PR: TMED-4135.