Determinación de poblaciones Impacto

Microbiano y técnicas de recuento

Aplicada para evaluar la calidad microbiana, para el estudio del crecimiento de
microorganismos en diversos procesos en los que se encuentran envueltos como la
producción de alimentos (dx lácteos y alimentos fermentados).
Para garantizar la calidad de los alimentos que se procesan, que se cosechan y producen.

➢ Seguimiento del crecimiento

Una población microbiana en el tiempo se puede determinar de una manera directa o
indirecta, dependiendo del ambiente, medio o sistema en donde esté creciendo.

Métodos Directos: Implican una Observación Métodos Indirectos

de la célula al microscopio

● Número de Células Observadas al ● Cuenta Viable o Unidades

Microscopio
Cámara de Neubauer: Dispositivo
parecido a un lámina portaobjetos
gruesa que tiene dibujada una
cuadrícula en donde se depositan
células de una suspensión de
microorganismos para ser contados
en un área determinada asociada a
un volumen.
Al emplear el microscopio, dependiendo
del tipo de células observadas, algunas
veces se puede determinar de paso si
están vivas o muertas.
● Número de Células con Contador
de Partículas
Coulter Counter: Utiliza la
interferencia de Rayos láser de una
vía para determinar cuántas
partículas están en una muestra)
Si solo se tiene células, cada
partícula contará como célula.
Con el Coulter Counter solo son
partículas, puede que estén vivas o
puede que estén muertas.
Formadoras de Colonia:
Asociados a la POSIBILIDAD de que los
microorganismos que hay en una muestra al
tenerlos en una población no tan densa,
cada microorganismos se va a dividir o
replicar, y al final terminan formando una
colonia agrupandose en ciertas formas
caracterizado el cultivo.
● Número Más Probable:
Técnica de probabilidad de determinar la
presencia de un mco.
● Densidad Óptica:
Parecida al Contador de partículas solo que
se observa de manera masiva la
TURBIEDAD en una muestra; provocando
una asociación de esa turbiedad o esa
densidad con el número de células.
● Peso Seco:
Filtrar las células y retenerlas en una
membrana y después determinar la cantidad
de masa de las células. Sirve para mohos
junto con el Paquete Miceliar.
● Paquete Miceliar:
Caso especial para los mohos, por su forma
de crecer, en donde por centrifugación se
forma un pellet en el fondo de un tubo de
centrífuga, la altura del pellet se asocia con
el contenido de células.
● Determinación de Proteínas, ADN,
ARN, Metabolitos Excretados:
Depende de cómo estén creciendo los mco,
a veces es indetectable pero su excreción es
innegable (también ATP)
 ➢ Cámara de recuento de células (Cámara de Neubauer)
Consiste en hacerse sobre una lámina gruesa con un par de canales y una plataforma en
donde está dibujada la cuadrícula.
Una lámina es la que la cubre, cumple con el objetivo de crear un espacio (volumen) con
altura de 0.1 mm (altura del espacio que se da entre la laminilla y la plataforma donde está
dibujada la cuadrícula)

La cuadricula posee cuatro tipos de dibujo:

1. Cuadrículas Exterior: Son cuatro las cuadrículas puestas en la esquina (4x4) Canda
una limitada por TRES LÍNEAS.
2. Cuadrícula Central: Con la misma área que las cuadrículas situadas en el exterior,
solo que esta en particular está dividida en 5x5 y una de esta cuadrículas á sus ves
está dividida en 4x4. ESTÁ A ESCALA 1 EN 25 A LA DE AFUERA

Al observar en el microscopio se posee objetivos 4x (Camara completa) 10x (Cuadrícula

exterior) 40x (Cuadro de la Cuadrícula central) y 100x (En el campo solo se observará un
cuadro de la 10x*40x)

La cuadrícula tiene un 1 mm de lado con Lado: 0.1 cm

una altura limitante de 0.1 mm se posee Alto: 0.01 cm; Volumen: 0.1cm x 0.1cm x
un volumen 0.001ml porque 1ml= 1cm³ 0.01 cm
(1cm=10mm) VOLUMEN de la cámara= 0.0001 ml

La muestra se va esparcir por la cámara, los límites de tres líneas son los que delimitan la
cuadrícula, para el conteo de microorganismos se deben escoger dos artistas (dos lados
contiguos Forman una L) para determinar el recuento y saber que es lo que se acepta y no
en el recuento. Si yo tomo el límite superior y el derecho, no se cuentan las células que
toquen los límites inferiores e izquierdos.
En este ejemplo se toma el límite superior y el isiqueror fueron tomados para el recuento
Tendría 7 Células/ 1x10-4 ml que es el volumen de este cuadro (7x10-4 Células/ml)

En esta imagen hay 61 Células/ 1x10-4 ml que es el volumen de este cuadro (6.1x10-5 Células/ml)
De 196 Células / 1x10-4 ml ➝ 2 x 10 6 Células/ml (Dos millones de células en 1 ml) se
redondea a veces, si la población es más grande toca diluir la muestra es como si se
sembrara en agar y se veria muy turbio.

Crecimiento en Agar: Cuenta Viable o Unidades Formadoras de Colonia

Hay dos maneras de efectuar la técnica del crecimiento en agar:

1. Extensión en Superficie: Consiste en extender sobre la superficie de un agar sólido
la muestra empleando un asa de vidrio, para poder incubar y ver las colonias sobre
la caja.

Recomendaciones:
● Inmediatamente luego de colocar la muestras se debe extender la
muestra, de lo contrario, los mcos en la suspensión se depositaran
sobre la caja y ya no los podremos extender
● El volumen agregado (0.1-0.5 ml) Evita que la caja quede muy
mojada. El agua de la suspensión debe quedar absorbida para poder
ver colonias individualizadas y no un manchón de crecimiento.

2. Vertido en Placa: A diferencia del anterior, se emplea una caja de petri vacía y
esteril en un inicio, se coloca la muestra para luego verter una porción de agar (15-
20 ml Máximo fundido a 48°C). Siguiente a esto, con diez aprox. movimientos en
forma de ocho se homogeniza la muestra, sin regar el agar, se deja solidificar.
 Algunas colonias crecen dentro del agar y otras quedarán en la superficie.

Recomendaciones:
● Generalmente en el laboratorio se emplea 1.1 ml, o puede requerir
más de 5 ml teniendo en cuenta el poner 20 ml de agar para que el
agar quede firme y no suelto.

¿Cómo preparamos el sistema completo?

1. Tener una muestra líquida X: leche o sólida X: pedazo de carne o queso, verdura o
fruta.
2. Pesar cantidad de muestra (normalmente 10g)
3. Homogeneizar en 100 ml de Diluente (Sln salina al 0.85% SENCILLO Y BARA)
De manera opcional, para proporcionar un medio propicio a los mcos se puede
agregar peptona de carne 1 g/l aprox. junto con un Buffer de fosfatos para un pH de
6.5-7.0, ajustando la sal para un medio ISOTÓNICO.
4. Para homogeneizar una muestra sólida (Stock Maker):
a. Dentro de bolsas tipo ziploc estériles se colocar la muestra sellada
b. Agrega el vehículo (líquido)
c. Lo coloca en el equipo y los rodillos del equipo lo homogenizan
d. Se toma la muestra
i. Depende del alimento (Carne tome un área no un bloque; con las
verduras lo mismo pero con un lavado y tomar la muestra del medio
líquido)

5. Ya con la primera dilución (Muestra del medio Sólido: 10-1; Para un líquido
puede ser directamente 100)
6. Toma 1 ml de muestra llevándolo a un tubo de ensayo con 9 ml (Sólido 10-1 hasta
10-7; Líquido 10-1 hasta 10-6)

Al tener dos técnicas, vertido en placa y extensión en superficie, en cada caso se escoge
cual es la más indicada para el recuento:
 X: Recuento de organismos mesófilos totales, se emplea: (lo mismo para mohos y
levaduras) Con su Agar apropiado.
X: Al tener los medios selectivos diferentes se emplea la técnica de extensión en
superficie.

Recordar que el volumen empleado depende de la expectativa de la presencia de mco que

uno quiere buscar

También se puede usar la membrana, empleada usualmente en muestras con un bajo

contenido de mcos y además soluciones que no tapan la cuenta. Muy empleada para el
control microbiológico del agua, porque los niveles permitidos de contaminación son bajos.
(Máximo unas 100 Unidades formadoras de colonias/ 100 ml de muestra).

La muestra pasa a través de la membrana, está retiene los mcos, la colocamos sobre un
agar nutritivo para hacer creer y a contar. Se puede cambiar de medios, para mesófilos
mohos o levaduras o emplear agares diferenciales selectivos y detectar la presencia de
mcos.
Técnica del Número Más Probable
Técnica que ha caído en desuso, fue diseñada para detectar la presencia de un grupo de
bacterios LOS COLIFORMES (organismos indicadores de la contaminación fecal), en
productos procesados los operarios de manera accidental pueden contaminar si no hay un
lavado de manos (en la leche el ordeño requiere limpieza de las ubres o lavado de manos
por parte del ordeñador si se hace manual).
Características de los coliformes:
● Gram -
● Mesófilos
● Lactosa +
● Producen Gas (Gas +)
● Móviles

¿Cómo podemos hacerlos crecer?

Los medios diferenciales como BRILLA (Bilis; Verde Brillante; Lactosa)
La bilis y el verde brillante inhiben la flora acompañante Gram + permitiendo crecer la Gram -
Dentro de los Gram - hay algunos Lactosa + (Producen gas al degradar) y Lactosa -.
Si es gas + es lactosa +
Es móvil debido a que la muestra es depositada en la superficie del tubo sin homogeneizar, los mcos se
depositan en la campana y dejan una zona blanca una burbuja.

1. Dilución (muestra líquida o dilución de una muestra sólida)

2. Hace dos diluciones 10-1 y 10-2
3. De cada dilución tomar 9ml de la muestra y coloca 1ml de cada uno
 4. De la siguiente así SIN HOMOGENEIZAR
5. Incubación
6. Contar cuántos tubos tienen una burbuja en su campana
(Contar cuantos vienen de la muestra original, cual de la dilución 10-1 y 10-2)

7. Recurre a la tabla normalizada internacionalmente y refiere el número más probable

de mco por gramo o por ml de producto.

Esta técnica también se adaptó para muestras con un bajo número de mcos,
fundamentalmente para el agua, ya no se hacen tres réplicas sino cinco por cada dilución.
Utiliza 10 ml de muestra en el ensayo y lo mezcla con 10 ml de caldo brilla de doble
concentración, así al mezclar la muestra con el caldo el medio de cultivo quedará con la
concentración original.
Se analizan 50 ml de muestra para poder capturar el número bajo de mcos.
La tabla normalizada cambia, ahora va de cero a cinco para cada dilución.

Medidas de Masa Celular: Densidad Óptica