TECNICAS DE CULTIVO

Introducción
Diversos análisis realizados en los laboratorios de microbiología incluyen un recuento
de microorganismos presentes en una muestra. Aunque se puede usar el microscopio
para enumerar los microorganismos, esta técnica presenta tres limitaciones. Primero,
es difícil de diferenciar las células vivas de las células muertas. Segundo, es casi
imposible observar la bacteria a la luz del microscopio con una densidad celular de
menos de 106 por mililitro. Tercero, los materiales sólidos como partículas de
nutrientes no pueden ser vistos sin una ruptura mecánica debajo de la luz de un
microscopio de alta potencia (Swanson, Petran y Hanlin; 2001).

Seguido de la incubación, la población de microorganismos originalmente presente

puede ser estimada por un recuento del número de colonias o el número de tubos que
muestran evidencia del crecimiento y multiplicación a través de la dilución que fue
agregada a las placas o tubos. En el caso de muestras como los alimentos, existe un
límite para recuento de bacterias en estos, que ya están establecidos por la norma
siendo permitidos dentro de un rango de 30 a 300 u.f.c./ml.

Generalmente los microorganismos se encuentran mezclados unos con otros en una

muestra, por lo que se realizan aislamientos para estudiar un microorganismo objetivo
a través de un cultivo puro. Esto porque viven de forma sinergística, es decir hay una
cooperación entre ellos. En esta practica se explican las principales técnica usadas
para el cultivo del microorganismo, y las técnicas de siembra en medio liquido, solido y
semisolido.

SWANSON M. J. Katherine, Ruth L. Petran, y John H. Hanlin. 2001. Compendium of

Methods for the Microbiological Examination of Foods- Chapter 6. American Public
Health Association. 4 th edition.

OBJETIVOS

 Identificar las técnicas de siembra de diferentes medios de cultivo: solido,

líquido y semi sólido.
 Interpretar los resultados en el crecimiento bacteriano de cada tipo de medio de
cultivo.

INFORME 3: Metodología
Procedimiento
Caracterización macroscópica:
A partir de los cultivos de bacterias en medio sólido, describir las características que
observa, teniendo en cuenta el color, aspecto y consistencia de las colonias de los
microorganismos en el medio de cultivo.
Realización de frotis:

 A partir de medio líquido: Cargue el asa bacteriológica con una gota de cultivo
y deposítela en un portaobjetos limpio realizando una extensión en forma
circular de la muestra hasta conseguir una capa fina (frotis).
 A partir de un medio sólido: Ponga una gota de solución salina fisiológica (NaCl
0,9%) estéril en el portaobjetos. A continuación cargue el asa con una pequeña
cantidad de bacterias de una colonia del cultivo y re suspéndala en la gota
hasta homogeneizar. Hágalo de forma circular.
Fijación al Calor:

 La preparación se deja secar al aire libre, cerca al mechero.

 Una vez seca, se procede a la fijación, haciendo pasar la preparación 3-4
veces por la llama del mechero (la llama debe tocar la parte posterior del
portaobjetos).
 A partir de este momento la preparación está lista para teñir y el procedimiento
a seguir depende del tipo de tinción
Tinciones a realizar:
Coloración de azul de metileno (Tinción simple)
Técnica que permite teñir el interior celular. Tiñe microorganismos procarióticos (vivos
o muertos). Los eucarióticos sólo se tiñen si están muertos. Algunas estructuras, como
los corpúsculos metacromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el
resto de la célula.
Procedimiento

 Tome una muestra de los cultivos de cada microrganismo

 Acercar al calor la muestra.
 Cubrir con azul de metileno la preparación y esperar 2 minutos.
 Lavar con agua.
 Secar al aire y pasar por el mechero tres veces.
 Observar al microscopio hasta llegar al objetivo de 100x utilizando aceite de
inmersión.
Coloración de Gram (Tinción Diferencial)
Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol
que arrastrará al colorante sólo en las Gram negativas, mientras que en las Gram
positivas el colorante queda retenido y las células permanecerán azules-púrpuras. Las
células Gram negativas se teñirán después con un colorante de contraste (safranina)
para que puedan observarse, estas quedan rosadas.
Procedimiento

 Añadir 1 ó 2 gotas de cristal violeta a la preparación, hasta que se cubra por

completo. Dejar actuar el colorante durante 1 minuto. Una vez transcurrido el
tiempo, lavar la preparación con agua.
  Agregar 1 ó 2 gotas de solución lugol a la preparación, y dejar actuar 1 minuto.
 Transcurrido el tiempo, lavar con agua.
 Con cuidado, añadir gota a gota el alcohol-acetona dejar actuar 30 segundos,
luego lavar con agua
 Añadir el colorante de contraste, safranina-fushina (1 ó 2 gotas) y dejar actuar
durante 1 minuto luego lavar con agua
 Escurra y deje secar al aire y observar al microscopio a 100X con aceite de
inmersión.

Bibliografía

 Fijación al calor. Accesible en URL:

https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-
microbiologia/indice/observacion-microscopica/fijacion Consultada el 4 de julio
de 2015.
 Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case. Microbiology. 10th
Edition. Pearson Education. 2010.