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Tecnicas de coloracion y observacin de microrganusmos

Introduccin:

Los exmenes microscpicos o directos juegan un papel importante en el proceso primario de


caracterizacin e identificacin de los microrganismos . los exmenes en fresco estn mal
caracterizados para bacterias y protozoos, sobre todo , en el caso de las bacterias nos permite
determinar la movilidad

Los exmenes de tincin se usan para revelar el tamao , la forma y la agrupacin de los
microrganismos , para demostrar sus estructuras internas y externas, lo cual nos ayuda a la
clasificacin e identificacin de los diferente microorganismos .

Los colorantes son compuestos organicos que estn constituidos por un grupo cromoforo y
auxocromoforo , unidos a un anillo bencnico . tiene afinidad particular por sustancias celulares
especificas las soluciones empleadas para teir a las bacterias son generalmente acuosas .

Objetivos:

Entrenamiento en preparacin de extendidos y realizacin de coloraciones

Obbservacion microoscopica de morfologa y agrupamiento bacterianos

Materiales:

Lamina portaobjetos

Lamina excavadora

Asa deplatino

Cristalizador

Pinzas portaobjetos

Mechero

Microscopio

Aceite de inmersin

Alcohol isopropilico

Gradilla porta laminas

Set colorantes gram


Azul de metileno

Set colorante esporas (esporas)

Set colorantes capsula ( de hiss o nigrosina)

Set colorante de loeffer

Set colorante Albert

Set colorante ziehl neelsen

Cepas bacterianas:

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Bacillus subtilis

Bacillus cereus

Klebsiela pneumonia

Neisseria spp

Observacion de las bacterias:

a) Observacin macroscpica

El tamao de las bacterias impide verlas a simple vista. Sin embargo, las colonias que forman sobre
medios solidos si son visibles , y en ellas se puede estudiar una serie de caractersticas que nos
ayudan a su identificacin. A nivel morfolgico, podemos estudiar la forma de las colonias , su
tamao, aspecto del borde( liso, rugoso, ondulado , ramificado, etc), presencia de brillo, color, etc.
Incluso sobre medio liquido las bacterias producen modificaciones de inters para su clasificacin
y que tiene que ver esencialemnte con las caractersticas de su metabolismo. Asi se observa si la
turbidez es uniforme , si crecen en el fondo, si lo hacen en la zona superficial, si producen
pigmentos, etc.

b) Observacin microscpica:

Puesto que la inmensa mayora de las bacteias son incoloras, la nica forma de onservarlas bien en
el microscopio ptico consite en incrementar su contraste con respecto al medio. Esto se consigo
mediante su teido con colorantes o mediante la disposicin de una ptica especial contraste ,
generalmente de fases , en el microscopio.
Para observar las bacterias teidas , hay que proceder previamente a su fijacin . inicialmente se
prepara un frotis a partir de medio liquido o dispersando en una gota de agua una porcin de
clulas crecidas en solido. Posteriormente se deshidrata el frotis por calentamiento suave
utilizando el reverso de la mano como control de temperatura tras pasar repetidamente el
portaobjeto sobre la llama del mechero. Tyras la fijacin por calor se procede a la tincin.

Preparacin de extendido y coloracin

Coloracin simple:

Reactivos

Violeta de genciana

Fucsina bsica diluida

Azul de metileno

Tcnica

Depositar con una asa de platino una gota de material a examinar en el centro de un portaobjetos
bien limpio y desengrasado , extender suavemente hasta ocupar una superficie de
aproximadamente 1cm2

Secar y fijas la preparacin con calor. Para ello se toma el portaobjetos con las pinzas y se corta 3-4
veces la llama del mechero

Se deja enfriar el portaobejtos para evitar la precipitacin del colorante

Inundar la preparacin con la solucin del colorante elegido manteniendo el tiempo adecuado
para su activacin.

Lavar con agua destilada para arrastar el exceso de colorante

Secar la preparacin al aire o con calor suave

Observar al microscopio con el obejtivo x100 aadiendo una gota de aceite de inmersin en el
centro de la preparacin

Tiempo y coloraciones de los reactivos empleados

Los tiempo indicados nen la tabla son los establecido segn el mtodo . pueden modificarse
dependiendo del tiempo que lleve preparado el reactivo, pero esa variacin ser indicada por el
profesor si lo considera necesario

Violeta de genciana

Fuchsna bsica diluida


Azul dde metileno

Tcnica de la gota pendiente: Este procedimiento es la forma ms sencilla de observacin de


organismos vivos, nos proporciona informacin sobre la morfologa, tamao, color y movilidad de
las bacterias. Sin embargo, debido a la falta de contraste con el entorno es una prctica que se
utiliza nicamente para la observacin del movimiento.

Procedimiento

Tomar una gota de un cultivo lquido reciente (24 horas) usando un asa de siembra o una pipeta
Pasteur estril.

Colocar en el centro de un cubreobjetos y aadir cuatro pequeas gotas de aceite en los cuatro
extremos.

Colocar el portaobjetos excavado sobre el cubreobjetos, cuidando que la gota quede situada en el
centro de la depresin.

Dar la vuelta al portaobjetos

Colocar una gota de aceite de inmersin y observar con objetivo de inmersin (100x).

Coloraciones diferenciales:

Preparacin de frotis a partir de una muestra obtenida por raspado farngeo


Con un hisopo esteril proceder a tomar una muestra de la regin oro fariingeo de un estudiante.
Ayudarse con un abate lengua

Extender la muestra en una lamina portaobejtos

Fijar al calor del mechero o al aire libre

Proceder a colorear con gram

Coloracin de gram:

Esta tincin diferencial fu propuesta por el medico dans Christian Gram que examinando tejido
pulmonar de enfermos fallecidos por neumona observ que la bacteria Streptococcus
pneumoniae, presente en los pulmones, retena el colorante conocido como marrn Bismark
posteriormente por el cristal violeta), mientras que el tejido pulmonar no era capaz de retener el
colorante.

Es la tincin diferencial ms utilizada de forma rutinaria y prcticamente la primera prueba a la


que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una
informacin esencial, adems de sobre la forma, tamao y agrupacin celular, como es el tipo y
composicin de la pared que presentan las bacterias. La tincin de Gram divide a las bacterias con
pared del Dominio Bacteria en dos grandes grupos: bacterias con pared de tipo gram positiva y
bacterias con pared de tipo gram negativa.

Material biolgico:

Cultivos bacterianos de microrganismos (escherichia coli, Staphylococcus aureus, bscillus subtilis y


neisseria spp.)

Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequea alcuota de un cultivo bacteriano
con el asa de siembra estril.

Hacer el frotis, formando una pelcula homognea sobre el portaobjetos con el asa de siembra.
Dejar secar.

Fijar la preparacin, pasando a travs de la llama del mechero el portaobjetos.

Cubrir con unas gotas de cristal violeta durante 1 minuto.

Lavar el exceso de colorante con agua.

Aadir el mordiente lugol, solucin de yodo-ioduro potsico, durante 1 minuto.

Lavar el exceso de mordiente con agua.


Lavar la preparacin con alcohol formando un ngulo con la preparacin, durante 30 segundos (el
tiempo de decoloracin es clave para un resultado correcto).

Lavar inmediatamente con abundante agua.

Cubrir con el colorante de contraste, safranina durante 1 minuto.

Lavar el exceso de colorante con agua.

Dejar secar al aire.

Aadir una gota de aceite de inmersin.

Observar con objetivo de inmersin (100 x).

Coloracin de Ziehl neelsen:

Material biolgico

Cultivos bacterianos de microrganismos (mycobacterium smegmatis y staphtlococclus aureus)

Procedimiento:

Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequea porcin de un cultivo bacteriano
con el asa de siembra estril.

Hacer el frotis, formando una pelcula homognea sobre el portaobjetos con el asa de siembra.
Dejar secar.

Fijar la preparacin, pasando a travs de la llama del mechero el portaobjetos.

Cubrir con unas gotas de fuchina fenicada y aplicar calor con un hisopo de lana de vidrio,
mantener 5 minutos desde el comienzo de la emisin de vapores

Lavar el exceso de colorante con agua.

Aadir unas gotas de cido ntrico al 33% durante 30-40 segundos.

Lavar el exceso de colorante con agua.

Lavar la preparacin con alcohol de 96 durante 30 segundos.

Lavar con abundante agua.

Cubrir con el colorante de contraste, azul de metileno durante 1 minuto.

Lavar el exceso de colorante con agua.

Dejar secar al aire.


Aadir una gota de aceite de inmersin.

Observar con objetivo de inmersin (100 x)

Coloracion de estructuras:

Material biolgico

Cultivos bacterianos de microrganismos (bacillus subtilis, bacillus cereus y bacillus sphaericus)


cultivo problema

Coloracin de endosporas:

Los cultivos baterianos debern encontrarse en fase estacionaria, para que se favorezca la
esporulacin. Con ellos se prepran extensiones en portaobjetos y tras secar al aire se fija con calor
segn ya ha sido indicado. Se proporcionara cepas de un cultivo problema y de bacillus subtili ,
bacillus cereus y bacillus sphaericus

Tcnica de wirtz

1.Preparar los frotis bacterianos indicados.


2.Teir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de la llama del
mechero de forma que el colorante humee durante 5 min.
3.Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
4.Teir con safranina 1 min.
5.Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
6.Secar la preparacin.
7.Observar la preparacin al microscopio. Anotar la disposicin y la morfologa de las tres especies
del gnero Bacillus.

Tcnica de scheaffer y fulton


1- Prepare un dos extendidos del microorganismo aislado del cultivo de
microorganismo uno de Bacillus Suptillus y otro de Bacillus cereus
2- Fijar por calor y cubrir todo el portaobjeto con una solucin de verde de
Malaquita.
3- Calentar hasta emisin de vapores y seguir dicho calentamiento durante
3 minutos (no permitir que se seque el colorante. Si esto ocurriera,
agregar colorante, sobre el preexistente y no sobre la parte seca, hasta
cubrirlo nuevamente.)
4- Lavar con agua y cubrir con solucin deSafranina. Dejar actuar 30
segundos. Lavar con agua, secar y observar con objetivo de inmersin.
5- Informar: morfologa, color y tipo de espora.

Resultado: las esporas aparaceran de color verde y las formas vegetativas


en rojo. Determinar si la bacteria problema forma esporas o no.
Coloracin de capsula:
Material biolgico
Cultivo bacteriano de microrganismos (klebsiella pneumoniae)
Tcnica de hiss:
Hacer frotis y dejar secar al medi ambiente
Fijar con formol al 40%, sumergiendo la lamina en un recipiente con el
fijador hasta que se vuelva opaco.
Lavar con agua destilada por sumercion en un recipiente
Cubrir con colorante de hiss( solucin acuosa de crital violeta al 0.1%)
y calentar suavemente hasta la emisin de vapores.
Eliminar el colorante y lavar prolongadamente con solucin acuosa de
sulfato de cobre al 20%. No lavar con agua
Secar con papel de filtro y observar con lente de inmersin
La capsula aparece de color violeta palido : el cuerpo bacteriano en azul
violeta

Coloracin de granulos metacromaticos


Lo corpsculos metacromaticos, tambin denominados granulos con volutina,
son inclusiones citoplasmticas que aparecen en algunas bacterias y que,
aunque su funcin no es conocida en detalle, podran considerarse una
reserva de energa.
Material biolgico
Cepas de lactobacillus delbrueckii nsub. Bulgaricus y streptococcus
thermophilus.
Alternativo:yogurt

Tcnica de Albert

Aplicar sobre la muestra seca y fijada al calor , el colorante de Albert


y teir durante de Albert y teir durante cinco minutos. Lavar con agua
el exceso de colorante y aplicar una solucin de lugol dejando actuar
durante cinco minutos.
Lavarcon agua y dejar secar
Examinar la preparacin almicroscopio con el objetivo de inmersin. En
este caso los corpsculos metacromaticos se observan como puntos verde
oscuro o negros dentro de una celula de color verde palido

Tcnica de loeffler
Aplicar sobre la muestra, seca y fijada suavemente a la llama del
mechero , la solucin de azul de metileno alcalima de loeffler . se deja
actuar de 3 a 5 minutos
Eliminar el colorante con agua y secar al aire o con ayuda de un papel
secante.
Examinar la preparacin al microscopio con el objetivo de inmersin .
observando los granulos metacromaticos coloreados de azul intenso,
mientras que el citoplasma celular aparece de color azul mas claro.
Resultados:

Conclusiones:

Bibliografa:
http://revistareduca.es/index.php/biologia/article/viewFile/819/834
http://www.educa2.madrid.org/web/educamadrid/principal/files/0e8a6919-7eeb-423f-9fa8-
b9c866aab3ff/T%C3%89CNICAS%20DE%20VISUALLIZACI%C3%93N%20MICROSC%C3%93PICA%20
DE%20MICROORGANISMOS.pdf

Cuestionario:
Que es un colorante? Clases de colorantes y 4 ejemplos de cada uno
Sustancias orgnicas coloreadas que se utilizan para colorear otros objetos; solubles en
medio cido, neutro o bsico, que poseen una estructura molecular no saturada, Es decir son
electrnicamente inestables y por eso absorben energa a determinada longitud de onda, si
fueran estables absorberan todas o rechazaran todas.
Los grupos responsables de la absorcin de la luz se llaman:
CROMOFOROS: Son todos aquellos compuestos que tienen electrones resonando a determinada
frecuencia y por eso absorben y luz al unirse refuerzan la absorcin de radiacin.
AUXOCROMOS: Son los responsables de la fijacin al sustrato a teir, son capaces de fijar la
molcula del colorante y en algunos casos intensificar la labor de los cromforos.
CROMOFOROS AUXOCROMOS

Grupo etileno C-C Grupo sulfonico - H2SO4

Grupo carbonilo R-C=O Grupo Carboxlico R - COOH

Grupo nitroso -N=N- Grupo Hidroxilo R - OH

Grupo nitro - NO2 Grupo Aminito - NH2

Grupo azo Cloro Cl2

Grupo azoxi Bromo Br2

Grupo quinoideo

Nota:
El grupo sulfnico permite en la mayor parte de los colorantes la solubilidad en agua y el vehculo usado
para teir en la curtiembre es el agua, aunque no todos los colorantes usan como vehculo el agua.
Los grupos cloro, bromo e iodo tambin actan como auxocromo transmitiendo la solidez a los
colorantes. El sulfnico, carboxlico y el hidroxlico dan carcter aninico a la molcula del colorante,
mientras que el amnico le proporciona un carcter catinico. Aunque hay colorantes que presentan
aminas y por lo tanto tienen su parte bsica en la molcula, entonces depende a qu pH los usemos, son
anfteros, o sea pueden ser catinicos o aninicos, la misma molcula puede estar cargada distinto.
Normalmente en la curtiembre no se hacen cambios tan bruscos de pH como para que un colorante que
es aninico normalmente a pH 3 o 4 pase a ser catinico para lo que se necesitara un pH 1-2.

o Algunos compuestos naturales coloreados.


Naftoquinonas: JUGLONA (color caf en la nuez)
LAWSONA (tinte rojo del cabello)
Antraquinonas: ACIDO CARMINICO (pigmento rojo de la cochinilla,
Constituida por los cuerpos rojos de los insectos)

CLASES DE COLORANTES
Existen dos mtodos de clasificar colorantes. El primero est basado en la constitucin qumica de los
sistemas Cromofricos, y el segundo en base a los mtodos de aplicacin.
Ninguno de estos dos sistemas es completamente satisfactorio, debido a que existen colorantes incluidos
en el mismo sistema Cromofrico que difieren ampliamente en su aplicacin.

La utilidad de un colorante para un uso particular es gobernado por: tamao molecular, grupos
solubilizantes, grupos aceptores de protones, longitud de la cadena, grupos alquilo, etc. Hay, segn la
constitucin qumica alrededor de 25 diferentes clases de colorantes.

Tal vez el mejor modo de introducirnos a la qumica de los colorantes, es ir en mayor detalle a la
clasificacin de los mismos en funcin de su aplicacin, haciendo mencin de los mismos en el siguiente
orden:
Los colorantes se clasifican segn:

APLICACIN:
o Colorantes directos o sustantivos: Son los que tien directamente el tejido, sin necesidad de alguna
ayuda posterior
NH2 NH2
SO3H SO3H
Rojo congo
o Colorantes indirectos o adjetivos: No pueden ser empleados directamente sino que requieren la ayuda
de ciertos compuestos denominados mordientes.

REACCION:
o Colorantes cidos: Son sales sdicas de cidos sulfonicos y nitrofenoles. tien directamente las fibras
animales, pero no las vegetales.
o Colorantes Bsicos: llevan auxocromos bsicos. Tien directamente las fibras animales y a las vegetales
o Colorantes sobre Mordiente: si el colorante es cido se requiere mordiente bsico.
o Colorantes a la tinta: no se fijan directamente a la fibra para obviar esto se reducen, y con el compuesto
formado, que es soluble, se tie la fibra
o Colorantes desarrollados: Los colorantes a la tinta vienen a ser un tipo especial de los denominados
colorantes desarrollados, en los cuales la ltima etapa de la sntesis del colorante se realiza sobre la fibra.
o Colorantes azoicos: Constituyen la clase ms numerosa de los tintes.

Donde radica la propiedad de colorear de un colorante? Formula qumica

SEGN SU ORIGEN:

NATURALES: como la hematoxilina, el carmn y la orcena.

SINTETICOS O ARTIFICIALES: como el azul de


metileno, la safranina, azul de anilina, el naranja G, etc..

SEGUN SUS PROPIEDADES QUMICAS


La mayora de los colorantes empleados en histologa actan como cidos o
bases y tienden a formar uniones salinas con radicales ionizables presentes en los
tejidos.

colorantes cidos: como por ejemplo la eosina, colorante cargado en


forma negativa, se une a componentes celulares cargados positivamente. Estos
componentes cargados positivamente se denominan acidfilos, porque tienen
afinidad por los colorantes cidos. Por ejemplo, estos colorantes se unen a
grupos aminos de las protenas. Estas protenas pueden pertenecer al
citoesqueleto de la clula o hallarse en la matriz extracelular. Debido al elevado
contenido de protenas del citoplasma la eosina es un excelente colorante
citoplasmtico. La eosina se une tambin a las membranas plasmticas, sin
embargo, se desconoce la naturaleza qumica de esta unin. Las clulas que
presentan un gran desarrollo de membranas (muchas mitocondrias, mucho
retculo endoplasmtico liso, etc.) son sumamente acidfilas, o sea, se tien
intensamente con la eosina.

colorantes bsicos: como por ejemplo el azul de metileno, colorante


cargado positivamente, se une a componentes celulares cargados negativamente.
Estos componentes cargados negativamente se denominan basfilos, porque
tienen afinidad por los colorantes bsicos. Por ejemplo, estos colorantes se unen
al ncleo y ciertas regiones del citoplasma.
Como caso particular, la hematoxilina no tiene carga, para teir un tejido se la
une a un mordiente que junto a la hematoxilina forman una laca. La laca es
bsica y por lo tanto se une a cargas negativas de la clula o matriz extracelular.

colorantes neutros: son colorantes en los que la porcin cida y la bsica


colorean. Tien las partes bsicas de una clula de un color y las partes cidas de
otro. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro. Ej. el eosinato de azul
de metileno.

colorantes indiferentes: tien aquellas estructuras o sustancias que los


disuelven ms fcilmente que el lquido en que estn preparados. Un ejemplo es
el colorante sudan, un colorante de lpidos.

CROMOFOROS AUXOCROMOS

Grupo etileno C-C Grupo sulfonico - H2SO4

Grupo carbonilo R-C=O Grupo Carboxlico R - COOH


Grupo nitroso -N=N- Grupo Hidroxilo R - OH

Grupo nitro - NO2 Grupo Aminito - NH2

Grupo azo Cloro Cl2

Grupo azoxi Bromo Br2

Grupo quinoideo

Qu es una coloracin vital?


Las tinciones vitales son aquellas que se efectan sobre clulas que estn vivas, mediante la
introduccin de un colorante en la circulacin de un organismo vivo. Son colorantes vitales,
por ejemplo, el verde Jano y el azul de metileno.
Qu es una coloracin supravital? Clases y ejemplos
Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre clulas o tejidos vivos, pero que
estn aislados del organismo del que proceden. Las tinciones no vitales se realizan sobre
clulas muertas. La coloracin de clulas muertas requiere un proceso previo de fijacin, que
tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie
del portaobjetos. La fijacin puede realizarse mediante calor, aunque habitualmente se realiza
con etanol o metanol

Que es una coloracin supravital? Clases y ejemplos


Cualeselproposito de fijar el frotis con calor
Cuales son lascaracteristicas que debe de tener un frotis bacteriano que este bien hecho
Que funcin cumple ellugaol
Cul es el punto critico de lacoloracion gram y porque se llamaasi?
Qu factores influyen para obtener una buena coloracin?