Los métodos de aislamiento y recuento requieren por lo general una
preparación previa de la muestra, que suele consistir en liberar en un medio fluido (diluyente) los microorganismos que se encuentran entre las estructuras del alimento. Para ello se utilizan aparatos que trituren y mezclen el alimento con el diluyente para obtener una suspensión lo más homogénea posible.
Homogenización mediante “Stomacher”-Homogenizador de Palas
Se trata de un aparato dotado de unas palas que golpean la muestra sin entrar en contacto directo con ella. Se introduce la muestra y el diluyente (en una relación 1:10) en una bolsa estéril y se homogeniza cierto tiempo (1-1,5 min. según alimento). Las paletas golpean la muestra y los fragmentos son eficazmente disgregados. Entre sus ventajas destacan que alimento y diluyente no contactan directamente con paletas, no se genera calor y no es necesario limpiar el equipo entre muestras, ya que la bolsa es de uso único. Como desventajas se cita que en los productos muy duros hay que realizar un troceado previo y que es poco eficaz para alimentos con alto contenido graso (>20%).
Diluyente Es un factor importante si se quiere obtener resultados óptimos. Hay que utilizar un diluyente adecuado, que no permita la multiplicación rápida de los microorganismos, pero que al mismo tiempo, aporte los nutrientes necesarios para mantener las necesidades metabólicas. No debe ser tóxico, ni producir daños subletales. Se suelen utilizar agua destilada, solución salina fisiológica, solución tampón fosfato, solución Ringer, solución de peptona al 0.1%... MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS| PROF. PEDRO BARZOLA
Dado el tamaño de las poblaciones microbianas que pueden estar
presentes en un alimento, que van desde algunos miles hasta varios millones de células por gramo, su determinación cuantitativa requiere la preparación de diluciones conocidas de la muestra; y es costumbre utilizar cifras decimales para facilitar los cálculos.
Lo más adecuado es preparar una dilución primaria y, a
partir de ella, todas las necesarias para poder contar los microorganismos presentes; pueden ser dos diluciones decimales consecutivas, es decir, 1:10 y 1:100 o superiores, según la carga microbiana esperada en el alimento.
II. OBJETIVO
Preparar adecuadamente las muestras de los alimentos bajo estudio.
Preparar diluciones para determinar el contenido microbiológico. Realizar siembras para el análisis microbiológico.
III. MATERIALES Y EQUIPOS
Pipetas de 1 ml Pipetas de 10 ml Agua peptonada 0.1% Placas de agar Triptona extracto de levadura Autoclave u Horno a 180°C Balanza digital Refrigerador Incubadora a 35°±2°C IV. PROCEDIMIENTO A partir del homogenizado, se pueden realizar siembras en los medios de cultivo, pero normalmente es necesario llevar a cabo diluciones para poder alcanzar un nivel de microorganismos que permita el recuento. Se suelen realizar diluciones de factor diez (reducir 10 veces la carga de microorganismos de la muestra), pero se pueden usar otros factores cuando sea necesario (factor dos, factor cinco). MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS| PROF. PEDRO BARZOLA
Para realizar diluciones de factor diez se sigue el siguiente proceso:
a) Mezclar cuidadosamente el homogenizado b) Pipetear una alícuota de 1 ml (10 ml) en un tubo que contenga 9 ml (90 ml) del diluyente c) Mezclar cuidadosamente d) Repetir los pasos 2 y 3 hasta obtener el número necesario de diluciones. La concentración disminuye diez veces en cada dilución sucesiva
Métodos de recuento en placa
Los métodos utilizados habitualmente para el recuento en placa son:
1) Método estándar para recuento en placa a) Sembrar por duplicado 1 ml de cada una de las diluciones en placas de Petri estériles b) Verter en cada placa unos 15 ml del medio fundido y atemperado a 45ºC Mezclar bien el inóculo con el medio y dejar que solidifique c) Incubar las placas en posición invertida en las condiciones de tiempo y temperatura adecuadas d) Elegir todas las placas que presenten menos de 300 colonias para realizar el recuento
2) Método de recuento por extensión en superficie
a) Sembrar por duplicado 0,1 ml de cada una de las diluciones sobre la superficie de placas con medio sólido b) Extender el inóculo tan pronto como sea posible sobre la superficie del medio con ayuda de una varilla de vidrio acodada c) Dejar secar la placa durante 15 minutos d) Incubar las placas en posición invertida en las condiciones de tiempo y temperatura adecuadas e) Elegir todas las placas que presenten menos de 300 colonias para realizar el recuento. MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS| PROF. PEDRO BARZOLA
3) Método de recuento por siembra de gotas en superficie
a) Marcar el exterior de placas con medio sólido, dividiéndolas en tres secciones iguales b) Sembrar dos o tres gotas de 0,02 ml de cada una de las diluciones sobre los sectores marcados en las placas c) Dejar secar la placa durante 15 minutos (hasta que se observe que las gotas se han secado) d) Incubar las placas en posición invertida en las condiciones de tiempo y temperatura adecuadas e) Elegir todas las placas que presenten menos de 20 colonias por gota para realizar el recuento
CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Después de efectuar el análisis en cuestión, aplicar el factor de dilución; por tratarse de diluciones decimales, el factor es el inverso de la dilución. Es decir, que si los resultados estadísticamente confiables se obtuvieron en la dilución 10-3, el factor de dilución es 103. Si se usó otra proporción en las diluciones, el inverso de la proporción en que se diluyó será el factor de dilución.
V. BIBLIOGRAFIA 1. Luna Fontalvo, Jorge. Manual de prácticas de laboratorio de Microbiología. Editorial Unimagdalena.España.2012 2. Madigan Michael, Martinko John: Brock–Biología de los Microorganismos.10a Ed. Editorial Prentice Hall-Iberia. España MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS| PROF. PEDRO BARZOLA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS| PROF. PEDRO BARZOLA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS| PROF. PEDRO BARZOLA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS| PROF. PEDRO BARZOLA
