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MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS| PROF.

PEDRO BARZOLA

PRACTICA N°

HOMOGENIZADOS Y SIEMBRAS PARA EL ANÁLISIS


MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS

I. INTRODUCCION

Los métodos de aislamiento y recuento requieren por lo general una


preparación previa de la muestra, que suele consistir en liberar en un
medio fluido (diluyente) los microorganismos que se encuentran entre
las estructuras del alimento. Para ello se utilizan aparatos que trituren
y mezclen el alimento con el diluyente para obtener una suspensión
lo más homogénea posible.

Homogenización mediante “Stomacher”-Homogenizador de Palas


Se trata de un aparato dotado de unas palas que golpean la
muestra sin entrar en contacto directo con ella.
Se introduce la muestra y el diluyente (en una relación 1:10) en una
bolsa estéril y se homogeniza cierto tiempo (1-1,5 min. según
alimento). Las paletas golpean la muestra y los fragmentos son
eficazmente disgregados.
Entre sus ventajas destacan que alimento y diluyente no contactan
directamente con paletas, no se genera calor y no es necesario
limpiar el equipo entre muestras, ya que la bolsa es de uso único.
Como desventajas se cita que en los productos muy duros hay que
realizar un troceado previo y que es poco eficaz para alimentos con
alto contenido graso (>20%).

Diluyente
Es un factor importante si se quiere obtener resultados óptimos. Hay
que utilizar un diluyente adecuado, que no permita la multiplicación
rápida de los microorganismos, pero que al mismo tiempo, aporte los
nutrientes necesarios para mantener las necesidades metabólicas.
No debe ser tóxico, ni producir daños subletales. Se suelen utilizar
agua destilada, solución salina fisiológica, solución tampón fosfato,
solución Ringer, solución de peptona al 0.1%...
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Dado el tamaño de las poblaciones microbianas que pueden estar


presentes en un alimento, que van desde algunos miles hasta
varios millones de células por gramo, su determinación cuantitativa
requiere la preparación de diluciones conocidas de la muestra;
y es costumbre utilizar cifras decimales para facilitar los cálculos.

Lo más adecuado es preparar una dilución primaria y, a


partir de ella, todas las necesarias para poder contar los
microorganismos presentes; pueden ser dos diluciones
decimales consecutivas, es decir, 1:10 y 1:100 o superiores,
según la carga microbiana esperada en el alimento.

II. OBJETIVO

Preparar adecuadamente las muestras de los alimentos bajo estudio.


Preparar diluciones para determinar el contenido microbiológico.
Realizar siembras para el análisis microbiológico.

III. MATERIALES Y EQUIPOS

Pipetas de 1 ml
Pipetas de 10 ml
Agua peptonada 0.1%
Placas de agar Triptona extracto de levadura
Autoclave u Horno a 180°C
Balanza digital
Refrigerador
Incubadora a 35°±2°C
IV. PROCEDIMIENTO
A partir del homogenizado, se pueden realizar siembras en los
medios de cultivo, pero normalmente es necesario llevar a cabo
diluciones para poder alcanzar un nivel de microorganismos que
permita el recuento.
Se suelen realizar diluciones de factor diez (reducir 10 veces la carga
de microorganismos de la muestra), pero se pueden usar otros
factores cuando sea necesario (factor dos, factor cinco).
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Para realizar diluciones de factor diez se sigue el siguiente proceso:


a) Mezclar cuidadosamente el homogenizado
b) Pipetear una alícuota de 1 ml (10 ml) en un tubo que contenga 9
ml (90 ml) del diluyente
c) Mezclar cuidadosamente
d) Repetir los pasos 2 y 3 hasta obtener el número necesario de
diluciones. La concentración disminuye diez veces en cada
dilución sucesiva

Métodos de recuento en placa

Los métodos utilizados habitualmente para el recuento en placa son:


1) Método estándar para recuento en placa
a) Sembrar por duplicado 1 ml de cada una de las diluciones en
placas de Petri estériles
b) Verter en cada placa unos 15 ml del medio fundido y atemperado a
45ºC
Mezclar bien el inóculo con el medio y dejar que solidifique
c) Incubar las placas en posición invertida en las condiciones de
tiempo y temperatura adecuadas
d) Elegir todas las placas que presenten menos de 300 colonias
para realizar el recuento

2) Método de recuento por extensión en superficie


a) Sembrar por duplicado 0,1 ml de cada una de las diluciones
sobre la superficie de placas con medio sólido
b) Extender el inóculo tan pronto como sea posible sobre la
superficie del medio con ayuda de una varilla de vidrio
acodada
c) Dejar secar la placa durante 15 minutos
d) Incubar las placas en posición invertida en las condiciones
de tiempo y temperatura adecuadas
e) Elegir todas las placas que presenten menos de 300 colonias
para realizar el recuento.
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3) Método de recuento por siembra de gotas en superficie


a) Marcar el exterior de placas con medio sólido, dividiéndolas
en tres secciones iguales
b) Sembrar dos o tres gotas de 0,02 ml de cada una de las
diluciones sobre los sectores marcados en las placas
c) Dejar secar la placa durante 15 minutos (hasta que se
observe que las gotas se han secado)
d) Incubar las placas en posición invertida en las condiciones
de tiempo y temperatura adecuadas
e) Elegir todas las placas que presenten menos de 20 colonias
por gota para realizar el recuento

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS


Después de efectuar el análisis en cuestión, aplicar el factor de
dilución; por tratarse de diluciones decimales, el factor es el
inverso de la dilución. Es decir, que si los resultados
estadísticamente confiables se obtuvieron en la dilución 10-3, el
factor de dilución es 103. Si se usó otra proporción en las
diluciones, el inverso de la proporción en que se diluyó será el
factor de dilución.

V. BIBLIOGRAFIA
1. Luna Fontalvo, Jorge. Manual de prácticas de laboratorio de
Microbiología. Editorial Unimagdalena.España.2012
2. Madigan Michael, Martinko John: Brock–Biología de los
Microorganismos.10a Ed. Editorial Prentice Hall-Iberia. España
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