BIOQUÍMICA II-Implementado 2020-I

Dra. Gladys A. Moscoso Mujica Escuela Académico Profesional de Farmacia y Bioquímica

BIOQUÍMICA II-Implementado 2020-I

PRÁCTICA N° 08

ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

A. INTRODUCCIÓN
Cuando se aplica un campo eléctrico a una solución de moléculas con carga neta, éstas
se desplazarán hacia el polo contrario a su carga. En este principio se basa la técnica
denominada electroforesis y el desplazamiento depende de dos factores: la carga y
tamaño.
Un equipo de electroforesis consta de una fuente de poder, que genera el campo
eléctrico y una cuba, recipiente con dos compartimientos con un electrodo cada uno. La
electroforesis en gel es una técnica muy utilizada para separar moléculas o fragmentos
de ácidos nucleicos. Los materiales más comunes para separar las moléculas de ácido
nucleico son polímetros como la acrilamida y la agarosa. Estos geles van en la cuba,
sumergidos en un tampón, con pH superior a 8. De esta manera, las moléculas de DNA
o RNA sometidas a electroforesis se desplazarán al polo positivo, porque poseen carga
neta negativa a pH superiores a 5.
Cuando la electroforesis se realiza en un gel, éste se comporta como un tamiz molecular
y permite separar moléculas cargadas basándose en su tamaño y forma. Así, una mezcla
de DNA de diferentes de tamaños, que puede resultar una reacción con enzimas de
restricción, se separarán en función de su tamaño.
En la figura 1 se observa un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, donde se
visualizan las bandas que corresponden a fragmentos de DNA con diferente masa
molecular. Las moléculas de DNA de mayor masa molecular migran menos respecto a
las moléculas de DNA de menor masa molecular, que quedan mas próximas al polo
positivo. Es importante el empleo de un marcador de masa molecular conocido porque
permite calcular la masa molecular de las bandas de DNA: la movilidad relativa suele
ser una función lineal del logaritmo de la masa.

Factores implicados en la electroforesis

• Matriz o soporte y tamaño del poro
• Disolución tampón de electroforesis (tris-borato, tris-acetato)
• Campo eléctrico (50 – 100 V en agarosa, hasta 1000 V en PAGE de
secuenciación)
• Temperatura
• Estructura y naturaleza de las moléculas a separar (carga, tamaño y forma)

El tamaño es el primer factor que permite la separación y que tanto se mueve la

molécula en gel (las de gran tamaño son retardadas y las más pequeñas se mueven más
rápidamente y migran más lejos).
La conformación es el segundo factor de importancia en la separación. Algunos ácidos
nucleicos a pesar de ser de gran tamaño, son super-enrolladas (fuertemente
empaquetadas) y por lo tanto compactos, lo que les permite moverse más rápidamente
que si no estuvieran enrolladas.

La electroforesis en gel de agarosa se utiliza para:

• Determinar la concentración y pureza del ácido nucleico
• Estimar el tamaño del ácido nucleico

Dra. Gladys A. Moscoso Mujica Escuela Académico Profesional de Farmacia y Bioquímica

BIOQUÍMICA II-Implementado 2020-I

• Determinar formas de las moléculas

La agarosa es un polímero de carbohidratos que se extrae de las algas marinas. El polvo

de agarosa se disuelve en una solución amortiguadora generalmente TAE (tris-ácido
acético-EDTA) o TBE (tris-ácido bórico-EDTA) con pH 8.2 y se funde a 56 grados
antes de ser vaciada en un molde, que servirá como soporte de las muestras de DNA a
ser separadas. El porcentaje de agarosa en el gel varía (generalmente entre 0.7 a 4.0 %)
e influye en la migración y separación de las distintas fracciones del DNA.
Si la secuencia de DNA es menor a 1 KB se utilizara un gel 1 %. Las muestran se
colocan en los pozos que se forman en el gel a partir de un peine que se coloca antes de
licuar la agarosa. Estas se mezclan con un colorante de carga a razón de 1 microlitro
hasta 20 microlitros, dependiendo de la concentración del ácido nucleico. Después de la
separación, el gel se sumerge en una solución de bromuro etidio (10 mg/ml) por 2-5min
para visualizar las bandas fluorescentes del DNA bajo la luz UV. La separación se lleva
a cabo a 8 V/cm en un tiempo de 35-50 min.

El término electroforesis se usa para describir la migración de una partícula cargada

bajo la influencia de un campo eléctrico. Muchas moléculas importantes biológicamente
(aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos…) poseen grupos
ionizables y existen en solución como especies cargadas, bien como cationes, o bien
como aniones. Estas especies cargadas se van a separar en función de su carga cuando
se aplica un voltaje a través de los electrodos. Existen muchos tipos de electroforesis,
que se engloban en dos categorías fundamentales:
-Electroforesis de frente móvil.
-Electroforesis de zona.
Actualmente, sólo se utiliza la electroforesis de zona, en la cual la muestra se desplaza
sobre un soporte sólido, como papel de filtro, celulosa o gel (agarosa, acrilamida…) y
los componentes de la muestra migran en forma de pequeñas bandas, también llamadas
zonas.
La electroforesis en gel es una técnica muy utilizada para separar moléculas o
fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos. Los materiales más comunes para separar
moléculas de ácidos nucleicos son polímeros como la poliacrilamida o la agarosa. Estos
geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un tampón de pH
alrededor de 8. De esta forma, las moléculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis
se desplazarán al polo positivo ya que a pH superiores a 5 poseen carga negativa. Los
geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en
función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño, van a
emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis. La distancia recorrida por cada
fragmento de DNA va a ser inversamente proporcional al logaritmo de su peso
molecular. Es importante la utilización de marcadores de tamaño conocido porque nos
permitirán calcular los pesos moleculares de las muestras de DNA problema. En el caso
de los geles de agarosa, se le añade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre
las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la
electroforesis, se visualiza el gel con una lámpara de luz UV, y se verán las bandas
correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los marcadores de peso molecular.

Dra. Gladys A. Moscoso Mujica Escuela Académico Profesional de Farmacia y Bioquímica

BIOQUÍMICA II-Implementado 2020-I

Tabla 1. Concentraciones de agarosa según la longitud de los fragmentos a

separar.

En la cámara de electroforesis el gel se coloca entre dos cámaras que contienen el

amortiguador y la conexión eléctrica entre las dos cámaras se realiza a través del gel.
Debido a que los ácidos nucleicos tienen cargas negativas, los pozos que contienen a las
muestras se colocan del lado del electrodo negativo para que estos migren hacia el lado
positivo (Figura 1).

Figura 1. Unidad de electroforesis horizontal en geles de agarosa.

Los ácidos nucleicos son comúnmente separados en geles de agarosa, la cual es un

polisacárido altamente purificado, derivado del agar. La velocidad de migración de los
ácidos nucleicos en matrices de agarosa está determinada por factores como:
- Tamaño molecular: Las moléculas más grandes migran más lentamente.
- Forma o conformación: El ADN super-enrollado migra más rápido que el ADN
lineal.
- Concentración de agarosa: Al disminuir la concentración de agarosa, los poros
del gel son más grandes y las moléculas migraran con mayor velocidad.
- Amortiguador de electroforesis: La composición y fuerza iónica del
amortiguador influencia en la electroforesis. En agua desionizada la
conductividad eléctrica es mínima y los ácidos nucleicos migran lentamente.
- Voltaje aplicado: La velocidad de las moléculas es directamente proporcional al
gradiente del voltaje

B. OBJETIVOS

• Integra los fundamentos de la electroforesis de ácidos nucleicos para interpretar

los resultados obtenidos.
• Diferencia las aplicaciones de la electroforesis de ácidos nucleicos.

Dra. Gladys A. Moscoso Mujica Escuela Académico Profesional de Farmacia y Bioquímica

BIOQUÍMICA II-Implementado 2020-I

E. RESULTADOS

1.- Calcular y preparar:

a) Agarosa 1% 20 mL.
b) Buffer TAE 1X 100 mL.
c) Buffer de muestra 10 mL.

2.- De la imagen obtenida del gel mediante la visualización con luz UV, discutir los
resultados obtenidos y hacer los comentarios convenientes, teniendo en cuenta: los
carriles donde se ha aplicado la muestra de ADN plasmídico, cuantas bandas se
ven?, que intensidad y tamaño presentan?, Que tipo de enrollamiento presentan el
ADN plasmidico?.

Dra. Gladys A. Moscoso Mujica Escuela Académico Profesional de Farmacia y Bioquímica

BIOQUÍMICA II-Implementado 2020-I

3.- En forma individual deberán calcular el tamaño, expresado en pares de bases,

de cada una de las tres bandas, haciendo uso de la recta patrón que tendrá que
construir con los marcadores de peso molecular utilizados en la electroforesis.

F.- CUESTIONARIO:
1.- Que es ADN plasmídico?
2.- El voltaje para electroforesis en gel de agarosa es de 1 a 5 V/cm, que significa esta
relación?
3.- Cuales son los intervalos de voltaje que puedan ser aplicados en la cámara utilizada?
4.- Que otras macromoléculas pueden ser separadas por electroforesis en gel? ¿Cuál es
el polímero más utilizado para cada una de las macromoléculas?
5.- Mencione cuatro geles disponibles comercialmente y sus características

Dra. Gladys A. Moscoso Mujica Escuela Académico Profesional de Farmacia y Bioquímica

BIOQUÍMICA II-Implementado 2020-I

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Nelson DL, Cox MM. Lehninger: Principios de Bioquímica. 6ta ed. Editorial
Omega. Barcelona, 2014
2. Bio-Rad: Protocolo que acompaña al “Quantum Prep Miniprep Kit”. Nelson DL,
Cox MM (2001): “Principios de Bioquímica”, 3ª ed. Editorial Omega
(Barcelona, España), pp 1119-1128.
3. Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003): “Bioquímica”, 5ª ed. Editorial Reverté
(Barcelona, España), pp 152-154.
4. Cao M, Arechaga E, Bravo A, Gonzales C, Le Borgne S. Manual de práctica de
laboratorio de Biologia molecular. UAM-Cuajimalpa. 2019. Pag 79-82.
5. Herrera Castillón, E. Bioquímica. 1ra ed. Editorial ELSEVIER. España, 2014.
6. Brown T. A. Gene Cloning & DNA Analysis. 6th Edition. Wiley-Blackwell
7. Sambrook, J. y Russel, D. (2001). Molecular Cloning. A laboratory manual (3
Ed). New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
8. Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K. y Walter, P. (2008).
Molecular Biology of the Cell (5 ed.). USA: Garland Science, Taylor & Francis
Group.
9. TRIzol Reagent (www.lifetechnologies.com)
10. http://www.fc.uaslp.mx/informacion-para/material-
didactico/ManualIntroduccionalaBIOLOGIAMOLECULAR-
VERSIONCORREGIDA2018.pdf

Dra. Gladys A. Moscoso Mujica Escuela Académico Profesional de Farmacia y Bioquímica