UNIVERSIDAD NACIONAL

JOSÉ FAUSTINO SÁNCHEZ CARRIÓN

ESCUELA DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

CURSO:

MICROBIOLOGIA GENERAL

PRACTICA N°04:

“RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN PLACA”

PRESENTADO POR: GRUPO N° ….

1.………………………………………….

2.………………………………………….

3.………………………………………….

4.………………………………………….

5.………………………………………….

6.………………………………………….

DOCENTE:
Ing. Edson Max Caro Degollar

HUACHO – 202…
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA GENERAL UNJFSC

PRÁCTICA DE LABORATORIO N° 04

1. TÍTULO: RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN PLACA

2. COMPETENCIAS:
 Aplica técnicas de homogenización y dilución de muestras para ser analizadas
microbiológicamente.
 Emplea técnicas de siembra de microorganismos en diferentes tipos de medios
de cultivo.
 Realiza cuantificación de microorganismos mediante las técnicas de recuento
en placa.

3. FUNDAMENTO TEÓRICO.

Existen diferentes métodos para cuantificar el número o peso (biomasa) de células

microbianas en un cultivo; los métodos pueden ser directos e indirectos. Entre los
directos se pueden mencionar a la determinación de peso seco y el recuento de células
en cámara de Neubauer.

La forma de cuantificar células viables más utilizada en Microbiología, es la de hacer

diluciones y cuenta en placa con medios de cultivo específicos para la población de
interés. Esta técnica se basa en la suposición de que cada bacteria incluida en un medio
de agar o en su superficie se multiplicará y producirá una colonia visible, en
consecuencia, el número de colonias que se observarán a simple vista será igual al
número de bacterias viables o unidades formadoras de colonias (UFC) inoculadas en el
agar multiplicadas por la dilución. Esta técnica aplicada en muestras complejas, dará una
estimación aproximada del número total de microorganismos, dependiendo del medio de
cultivo utilizado, ya que no hay un medio y condiciones de incubación que favorezcan el
crecimiento de todos los microorganismos. También pueden presentarse problemas
relacionados con falta de homogeneidad de las diluciones y en la inoculación de las
muestras, por lo que se pueden obtener bajos valores si es que las células no se separan
bien y valores elevados si las tomas de las muestras se hacen del fondo del tubo donde
se han concentrado por gravedad los microorganismos.

En microbiología las diluciones seriadas corresponden a un método empleado de manera

rutinaria con el fin de aislar células microbianas viables desde muestras sólidas o líquidas
y cuantificar su cantidad. Las células viables son aquellas con la capacidad de dividirse y
formar descendencia y, en la mayoría de los casos es el tipo de células que interesa. A
través del método de diluciones seriales una célula viable se puede aislar e identificar
como una colonia o Unidad Formadora de Colonia – UFC.

Las diluciones seriales se realizan cuando el tamaño de las poblaciones microbianas en

una muestra es demasiado alto, y sembrarlas en un medio sólido puede conducir a la no
formación de colonias o fusión de estas haciendo difícil el aislamiento y recuento. Para
obtener un número apropiado de células que puedan formar colonias aisladas en placa

2
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA GENERAL UNJFSC

(entre 30 y 300 unidades formadoras de colonias UFC) se requiere de la dilución de la

muestra y, como rara vez se conoce con antelación el número de células viables,
normalmente se hace más de una dilución, siendo usual realizar diluciones decimales.
Para hacer una dilución decimal de 10-1 se mezclan 1mL en 9 mL de diluyente. Si se
necesita una dilución 10-2, se pueden mezclar 0.1mL con 9.9 mL o de modo seriado
haciendo dos diluciones de tipo 10-1 así sucesivamente si se sospecha que la muestra
esta densamente poblada. Si se parte de muestras sólidas o líquidas densas (suelos,
alimentos, etc), para asegurar una muestra representativa, la primera dilución se realiza
mezclando 10 g o 10 mL de muestra en 90 mL del diluyente.

Otros factores de relevancia en el método de diluciones seriales están relacionados con

la homogenización de la muestra, el diluyente seleccionado y, la identificación de las
muestras y cultivos. Generalmente, la liberación de las células desde las muestras al
fluido posiblemente requiera de dispositivos de trituración y mezcla para lograr una buena
homogenización. Como diluyente de uso general está el agua peptonada al 0.1%, aunque
se puede trabajar con solución salina fisiológica con 0.1% de peptona. La identificación
de la muestra se refiere a la forma como se debe rotular para no confundirla o perderla, el
rotulo debe incluir: nombre y tipo de producto, fecha de recolección, cantidad, empaque,
fecha de producción y de vencimiento, así como fecha de análisis y características
organolépticas (color, olor, sabor, aspecto); los cultivos por su parte deben indicar el
número de dilución, tipo de medio, nombre del analista y fecha.

Figura 1. Método de las diluciones seriadas.

3
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA GENERAL UNJFSC

Métodos de siembra
Para la siembra de las diluciones seriales existen diferentes métodos, no
obstante, los extendidos y usados son: el método de extensión en placa y el
método de vertido en placa.

a) Método de extensión o siembra en superficie:

Un volumen que no suele ser superior a 0.1 mL, se extiende en la superficie de
una placa con medio sólido, utilizando un asa estéril de extensión (asa
digralsky). Es importante que la superficie del medio esté seca de modo que el
líquido de la muestra se absorba y las células queden fijas. La placa se incuba
a una temperatura adecuada hasta que aparecen las colonias.

b) Método de vertido en placa o profundidad:

Se pipetea un volumen conocido (normalmente 1mL) de muestra en una caja
Petri estéril sobre la que se añade el medio con agar fundido. Se realiza una
mezcla con movimientos suaves de la placa sobre la superficie de la mesa
antes de dejar solidificar. En este método se debe tener precaución con la
temperatura del agar fundido, la cual debe mantenerse entre 45°C - 50°C,
temperaturas superiores podrían matar las células. En la placa las colonias se
forman por toda la caja y no solamente en la superficie.

Figura 2. Métodos de siembra.

El número de colonias que se obtiene en la determinación de células

microbianas viables no solo depende del tamaño del inoculo, también de lo
adecuado que sea el medio de cultivo, de las condiciones y duración de la
incubación. Si se usa un cultivo mixto, por ejemplo, no todas las células
depositadas en la placa desarrollarán colonias a la misma velocidad, y si se

4
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA GENERAL UNJFSC

emplea un corto tiempo de incubación se obtendrán menos colonias de las

posibles.

Medios de cultivo
Existen diversos grupos de microorganismos cuyo aislamiento resulta relevante
para el análisis de determinadas muestras. Así, por ejemplo, cuando se desea
analizar un alimento, los microorganismos mesófilos (microorganismos que
crecen entre 15 – 45°C), mohos y levaduras (hongos), y coliformes se convierten
en los grupos más importantes a evaluar ya que su presencia y cantidad
determina la inocuidad de dicho alimento. Para la estimación de estos
microorganismos se eligen medios de cultivo específicos que favorecen su
crecimiento:
 Agar nutritivo o plate count: son medios generales usados para el cultivo de
microorganismos mesófilos.
 Agar PDA o Sabouraud: favorecen el aislamiento de mohos y levaduras.
 Agar VRB: estos medios son usados para determinar la presencia de
coliformes. El medio chromocult es además un medio diferencial en el cual se
podrán identificar diferentes tipos de coliformes.

4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Preparar los medios de cultivos y todo el material, de modo que al momento de

comenzar con las diluciones todo este estéril y listo para ser usado.

4.1. SELECCIÓN DE LA MUESTRA

Esta práctica se desarrollará en grupo. Cada grupo deberá seleccionar una
muestra solida o líquida desde la cual desee evaluar la presencia, aislar y
cuantificar microorganismos; se puede seleccionar un alimento (líquido o
sólido, preferiblemente alimentos que se comercialicen en la calle), una
muestra de suelo, muestras de agua, etc. Si la muestra es sólida como
mínimo deberá llevar 15 g o 15 mL si es líquida.

4.2. PREPARACIÓN DE HOMOGENIZADOS Y DILUCIONES

 En caso de que la muestra sea solida disminuir su tamaño con ayuda de un
mortero o, cuchillo y superficie de corte previamente desinfectados con
etanol al 70%. NOTA: si se pueden esterilizar los elementos mejor.
 Pesar 10 g de la muestra sólida o medir 10 mL de la muestra líquida (con
ayuda de una pipeta graduada o macropipeta).
 Diluir la muestra en 90 mL de solución salina peptonada, dejar en agitación
por 5 minutos.
 Dejar reposar 10, 15 o 30 minutos para permitir la liberación de los
microorganismos a la solución diluyente. (Dilución 1:10 (10-1)).

5
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA GENERAL UNJFSC

 De la dilución 1:10 (10-1) tomar 1 ml (usar micropipeta y punta estéril) y

depositarlo en tubo que contenga 9 ml de diluyente para obtener la dilución
1:100 (10-2).
 De la dilución 1:100 (10-2) tomar 1 ml y depositarlo en tubo que contiene 9
ml de diluyente para obtener la dilución 1:1000 (10-3).
 Continuar las diluciones sucesivamente si se requiere.
 Para el análisis microbiológico de alimentos se deben utilizar 3 diluciones
como mínimo.
 Luego de preparar las diluciones no deben pasar más de 20 min antes de
estar sembradas.

4.3. SIEMBRA EN PROFUNDIDAD (MESÓFILOS)

 Rotular las cajas con el nombre del equipo de trabajo, medio de cultivo
fecha y dilución.
 Tomar con pipeta estéril alícuotas de 1 ml de cada una de las diluciones
(empezando de la más diluida a la más concentrada) y depositarlo en la
base de una de las cajas de Petri estéril previamente marcadas.
 Inmediatamente verter en cada caja de 12 a 15 ml de agar nutritivo o plate
count fundido a 45ºC y mezclar el inóculo con el agar imprimiendo
movimientos de vaivén a la placa sobre el mesón: 5 veces en sentido
horizontal, 5 veces en sentido vertical, 5 veces en el sentido de las
manecillas del reloj, 5 veces en el sentido contrario a las manecillas del
reloj y 5 veces haciendo un ángulo recto. NOTA: El medio de cultivo debe
ser translúcido debido a que las unidades formadoras de colonias quedarán
en la superficie, en el medio y en el fondo de la caja.
 Lo ideal es que por cada dilución se siembren al menos dos cajas Petri,
para este ejercicio solo se inoculará una.
 Incubar a 30°C por 72 horas.
 Después de la incubación contar el número de colonias en las diluciones
donde hayan crecido entre 30 UFC y 300 UFC. NOTA: Cuando el número
de bacterias viables es inferior a 1 el número promedio se toma como 1.
 Obtener la concentración de bacterias en la solución de acuerdo con la
siguiente formula:

𝐶𝐵 = 𝑍 ∗ 𝑅

Donde:
- CB = Concentración de bacterias (UFC/mL o g)
- Z = valor promedio de UFC en dos cajas de Petri (solo en caso de
haber sembrado dos cajas Petri por dilución)
- R = Factor de dilución o inverso de la dilución donde se pudo
realizar el conteo (101, 102, 103, etc)

6
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA GENERAL UNJFSC

4.4. SIEMBRA EN SUPERFICIE (MOHOS Y LEVADURAS)

 Rotular las cajas con el nombre del grupo de trabajo, medio de cultivo
fecha y dilución.
 Tomar con pipeta estéril alícuotas de 0.1 ml de cada una de las diluciones
(empezando de la más diluida a la más concentrada) y depositarlo en la
superficie de una de las cajas de petri con el medio de cultivo y
previamente marcadas.
 Inmediatamente extender el inóculo con asa de Dryglaski sobre toda la
superficie.
 Incubar a temperatura ambiente por 3, 4 y 5 días (cada día se debe evaluar
crecimiento).
 Después de la incubación contar el número de colonias en las diluciones
donde hayan crecido entre 15 UFC y 150 UFC. NOTA: Cuando el número
de hongos viables es inferior a 1 el número promedio se toma como 1.
 Obtener la concentración de bacterias en la solución de acuerdo con la
siguiente formula:

1
C𝐵 = 𝑍 ∗ 𝑅 ∗
0 ,1

Donde:
- CB = Concentración de bacterias (UFC/mL o g)
- Z = valor promedio de UFC en dos cajas de Petri (solo en caso de
haber sembrado dos cajas Petri por dilución)
- R = Factor de dilución o inverso de la dilución donde se pudo
realizar el conteo (101, 102, 103, etc)

4.5. CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS.

Después de los diferentes periodos de incubación, realice un conteo en cada
una de las cajas con ayuda de un contador de colonias (ver en procedimiento
indicaciones sobre número de colonias posible de ser contadas y cálculos).
Observar y consignar en una tabla los resultados encontrados en el
crecimiento microbiano.

5. MATERIALES Y EQUIPOS:

a) Equipos

- 1 Autoclave de 50 L.
- 1 Horno de 25 L
- 1 Incubadora

b) Materiales
- 7 tubos de ensayo 13x100 con torunda

7
 ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA GENERAL UNJFSC

- 7 tubos de ensayo 18x150 con torunda

- 7 placas Petri (estéril)
- 7 Pipetas de 10 mL (estéril)
- 1 Mechero
- 1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL con torunda.
- 1 Aplicadores de madera.
- 1 Pinzas de disección punta roma.
- 1 asa de Dryglaski
- 1 paquete de 25 bolsas reclosables transparentes (medidas 20 x 17 cm a
más)

c) Sustancias y reactivos
- Agar Plate Count (PCA)

- Agar VRB
- Agar Dextrosa Sabouraud
- Algodón
- 1 L Alcohol 96°
- 1 L agua estéril para inyección

d) Materiales de protección e higiene personal

- 1 Jabón liquido
- Guantes descartables.
- Guardapolvo
- Cofia

6. RESULTADOS

(Presentar los resultados obtenidos del trabajo realizado en el laboratorio)

7. CONCLUSIONES:
(Indique sus conclusiones)

8. DISCUSIONES:
(Mínimo consultar a tres autores para las discusiones)

9. INTERROGANTES ADICIONALES
a. Mediante un esquema indique como obtener una placa o caja de Petri con
una dilución 10-7 mediante:
- Siembra en profundidad
- Siembra en superficie

10. BIBLIOGRAFÍA.
(Indique la bibliografía consultada)

8
 ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA GENERAL UNJFSC

11. ANEXOS
(Colocar fotografías o esquemas de la práctica con su respectiva leyenda)