1. Numero de la Cepa.

LIPIMC 0224 (Kluyveromyces marxianus)

2. Interés médico o industrial.

Producción de etanol a partir de lactosuero (interés Industrial).

3. Aislamiento.
Kluyveromyces marxianus se ha aislado a partir de las uvas, sin embargo, también puede
aislarse a partir de bebidas fermentadas como el kéfir y el pulque, así como otros
alimentos como el queso, el yogur, la leche y fermentaciones espontaneas.

Sustrato.
suero de leche(lactosuero.)
lactosa, (proveniente de la producción de
quesos)

5. Morfología.

oval, esférica o casi cilíndrica.

6. Materiales.

2 matraz Erlenmeyer de 100 ml.

1 matraz Erlenmeyer de 250 ml

13 cajas Petri.

1 aza bacteriológica.

1 mechero de bunsen.

1 cámara de Neubauer.

Tubos de ensayo con tapón.

Equipo

Cámara de flujo laminar

incubadora
7. Reactivos.
YPD (peptona de caseina 2%, extracto de levadura 1% y D-glucosa 2%.)
agar urea de Christensen
Agar Harina de Maíz
Medio de cultivo (reducción de nitratos y nitritos)
 8. Desarrollo de metodología para activación de la cepa

La cepa Kluyveromyces marxianus será activada en una cámara de flujo laminar, que previamente
será desinfectada y mantenida bajo la acción de la luz ultravioleta, dentro de la cámara se
romperá cada cápsula de vidrio en la que viene el liofilizado de la cepa.

Luego se dispuso cada cepa dentro de un matraz de 100 mL que contenía: 10 mL de caldo YPD
(peptona de caseina 2%, extracto de levadura 1% y D-glucosa 2%.) previamente esterilizado, a una
temperatura ambiente (Padín y Díaz, 2009).

Posterior a la inoculación, la levadura K. marxianus se somete a incubación con una temperatura

de 32°C por 48 h tiempo en el cual el medio presenta turbidez (Padín y Díaz, 2009).

9. Desarrollo de metodología para su identificación (pruebas bioquímicas) en diagrama de bloques,

fundamentar las pruebas bioquímicas.

Realizar las pruebas bioquímicas para las dos colonias seleccionadas, las pruebas bioquímicas a
realizar son:

 Prueba de la ureasa.
 Morfología de las levaduras en agar harina de maíz.
 Prueba de asimilación de carbohidratos (Fermentación de carbohidratos en Agar TSI
(Triple Sugar Iron Agar).
 Prueba de la reducción de nitratos y nitritos (la asimilación de nitrato).

PRUEBA DE LA UREASA.

Fundamento
Esta prueba consiste en detectar la presencia de la enzima ureasa en un determinado
microorganismo problema. Esta enzima cataliza la hidrólisis de la urea, que da lugar a dióxido de
carbono y amoniaco.

Suspender 24 g del Dejar reposar

inicio
Preparación del medio polvo en 950 ml de por 5 minutos.
agua purificada.

Vaciar en tubos de ensayo Calentar con

Vaciar en recipientes agitación frecuente
y dejar solidificar el medio
apropiados y esterilizar a y llevar a ebullición
en punta de flauta con
121°C durante 15 min. para llevar a
fondo profundo.
disolución total.
siembra

Sembrar el microorganismo
Tomar un poco de la Incubar a 37ºC
en un medio de agar urea de
muestra problema hasta un máximo
Christensen. Haciendo uso
con la aza de seis días.
bacteriológica de la técnica por lengüeta.
 final

MORFOLOGÍA DE LAS LEVADURAS EN AGAR HARINA DE MAÍZ.

El cultivo de levaduras en agar harina de maíz favorece la formación de pseudohifas y

blastoconidios, de modo que puede hacerse en la identificación presuntiva de especies de
Cándida.

Suspender 17 gramos Mezclar bien y disolver

Inicio de medio en un litro calentando con
Preparación del medio. de agua destilada. agitación frecuente.

Enfriar a 50ºC, mezclar bien Esterilizar en autoclave a Hervir durante un

y dispensar en placas de 121ºC durante 15 minuto hasta disolver
Petri. minutos. por completo.

siembra

Tomar un poco de la muestra Colocar un Incubar las placas a

problema y sembrar en forma cubreobjetos 25±2 ºC durante 48-60
de estriando las placas con sobre las marcas horas.
Agar Harina de Maíz de estrías.

Observar la formación
de colonias en el
Final.
cubreobjetos bajo un
microscopio.
 PRUEBA DE ASIMILACIÓN DE CARBOHIDRATOS (FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN AGAR TSI
(TRIPLE SUGAR IRON AGAR).

Fundamento:

En la prueba de Asimilación de carbohidratos los patrones de asimilación de azúcares (glucosa,

lactosa, sacarosa, maltosa, galactosa, dextrosa y rafinosa) permiten identificar las diferentes
especies de Candida spp. Interpretación:

Positivo: viraje del color del medio de cultivo hacia el amarillo.

Negativo: no se produce viraje de color, permaneciendo el color del medio de cultivo.

Inicio

Preparación del medio.

Mezclar bien, calentar Vaciar en tubos de ensayo

Suspender 62.5 g de polvo
en un litro de agua
purificada.
Dejar
con agitación frecuente y llenándolos con un volumen
reposar 5
hervir de 1 a 2 minutos que ocupen la tercera parte
minutos.
hasta disolución total. de los mismos.

Esterilizar en autoclave a Enfriar y dejar solidificar

Tomar una parte de la
121ºC durante 15 minutos. el agar en pico de flauta
muestra problema y sembrar
profundo.
picando el fondo y
extendiendo sobre la
Siembra.
superficie del mismo.

Incubar a 35 o 37°C Final.

durante 18 a 24 hrs
10. Desarrollo de método de conteo.

INOCULO PARA LA FERMENTACIÓN Y CRECIMIENTO CELULAR.

La preparación de inoculo de fermentación se desarrolla en 2 ciclos sucesivos:

Teniendo en cuenta que para la preparación del inoculo en un proceso de fermentación se deben
tener conteos aproximados de 106 a 108 UFC/mL (Garzón y Hernández, 2009).

Para poder obtener la concentración deseada para el desarrollo de estas fermentaciones, se

llevará a cabo 2 ciclos sucesivos de crecimiento de la levadura, utilizando para el primer ciclo
siembra por agotamiento en agar YPL (Peptona de caseína 2%, extracto de levadura 1% y lactosa
2%) y segundo ciclo en caldo YPL (Padín y Díaz, 2009).

En el primer ciclo se realizará una siembra masiva por agotamiento de la cepa de levadura
primaria en 5 cajas de Petri con agar YPL y se incubaran por 48 h a 32°C.

Para el segundo ciclo se tomarán 4 cajas de las cajas que en el primer ciclo presentaron mayor
crecimiento de levadura, éstas se inocularon de medio sólido a medio líquido en un matraz
Erlenmeyer con 300 mL de caldo YPL, este caldo inoculado se incuba a 32°C de donde se tomaron
lecturas de ufc/mL desde el momento de la siembra hasta evidenciar turbidez de medio.

estas lecturas se realizarán en el microscopio mediante cámara de Neubauer, cuyo incremento en

el tiempo demostrara la viabilidad de las levaduras, facilitándose la estimación del
comportamiento celular en el microorganismo.

Preparación de la muestra:

1- Lavar la cámara y el cubre con agua destilada y alcohol 96%.

2- Secar bien con papel suave.
3- Poner el cubreobjetos encima de la cámara.
4- Homogeneizar removiendo bien el cultivo en donde residen las levaduras.
5- Tomar con pipeta una muestra.
6- Poner la punta de la pipeta en una de las dos ranuras de la cámara y, por capilaridad, las
levaduras se distribuirán en la cámara.
7- Si se crea una cámara de aire repetir la operación desde el principio.
8- Fijar la cámara de recuento en la platina del microscopio para realizar la observación
microscópica.
9- Esperar unos minutos antes de contar para que las levaduras se depositen en la cámara.
Preparativos del microscopio:
El enfoque del microscopio se empieza con el objetivo de menor aumento que posteriormente
pasaremos a uno de más. Se centra el objetivo del microscopio a ojo en el centro teórico de la cruz
de la cámara, luego se coloca el objetivo lo más cerca posible del cubreobjetos, pero sin tocarlo y
posteriormente se irá alejándolo hasta que la imagen sea lo más clara y nítida posible. Se aconseja
trabajar a 400 aumentos.

Contabilizar levaduras totales: se presenta contabilizar las levaduras contenidas en los grupos de
25 y 16 cuadros respectivamente según la cámara usada.

Y aplicar la fórmula genérica siguiente:

Volumen útil de la cámara Neubauer = 0.2mm x 0.2mm x 0,1mm x 25 = 0,1 mm 3

11. Desarrollo de metodología para su conservación.

Realizar una siembra por agotamiento en 4 cajas de Petri por cada cepa, la cual contiene agar YPL
(peptona de caseina 2%, extracto de levadura 1% y lactosa 2%).

se incuba la levadura a 32°C por 48 h hasta observar crecimiento de colonias.

NOTA: Para garantizar las condiciones de conservación se exponen los sistemas a enfriamiento a
4ºC inhibiendo de esta manera el crecimiento y la actividad enzimática del microorganismo (Padín
y Díaz, 2009).

Para la conservación de las cepas de estas cajas de Petri con la cepa, se toman dos cajas de Petri
para hacer repiques y se guardan otras dos de la nueva siembra.

NOTA: Esto logra disponer en todo momento de la cepa original en estado latente, manteniendo
las características metabólicas de la especie evitando que las cepas pierdan viabilidad debido a los
continuos repiques.

12. Bibliografía en formato APA.

Agar YPD - Condalabwww.condalab.com › int

Padín, C. y Diaz, M. (2009). Fermentación alcohólica del lactosuero por Kluyveromyces

marxianus y solventes orgánicos como extractantes. Revista de la Sociedad Venezolana de

Microbiología. Retrieved October 12, 2016, from

Garzón, S,. Hernández L. (2009). Estudio comparativo para la Producción de Etanol entre
Saccharomyces cerevisiae silvestre, Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 Y Candida utilis ATCC
9950. Universidad Tecnológica de Pereira

http://www.ecorfan.org/bolivia/researchjournals/Sistemas_Experimentales/vol3num9/Revista_de
_Sistemas_Experimentales_V3_N9_7.pdf

https://www.interciencia.net/wp-content/uploads/2017/10/305-c-ARAUJO6.pdf

http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=199414957008

https://www.researchgate.net/publication/237029140_Fermentacion_alcoholica_del_lactosuero_
por_Kluyveromyces_marxianus_y_solventes_organicos_como_extractantes

https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5af086c156e97.pdf

http://shop.gabsystem.com/data/descargas/Camara%20Thoma%20Neubauer_SP.pdf