Instituto Universitario De La Paz.

Escuela De Ciencias.
Laboratorio De Biotecnología. Código 460704.
Practica No. [1]. TINCIÓN Y OBSERVACIÓN DE
MICROORGANISMOS Y PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE
MEDIOS DE CULTIVOS.
ALZATE, Miguel. Cód.: 1096241706. ARENAS, Jaime. Cód.: 1096211082.
Fecha de elaboración de la práctica: 05-Agosto-2017.
Fecha de presentación del informe: 29- Agosto-2017.

RESUMEN
La morfología de una bacteria se puede observar por la tinción diferencial, en un microscopio óptico. Una de
estas técnicas es la tinción de Gram la cual me permite diferenciar la morfología de las bacterias presentes y
clasificarlas en Gram positivas y Gram negativas dependiendo de su coloración; en esta práctica se utilizó dicha
técnica para la identificación de bacterias en cultivos y en la saliva humana. Se preparó dos medios de cultivo
utilizando Plate Count Agar y Agua Peptonada en los cuales se realizó la siembra de una muestra de un cultivo
que se encontraba en los laboratorios del centro de investigación santa lucía.

Palabras claves: Tinción, bacteria, siembra, medio de cultivo.

1. INTRODUCCIÓN muerte celular y algunas modificaciones

Los microorganismos vivos o activos son
por lo general incoloros (excepto algas y
cianobacterias), por los que no se
observarán con facilidad en un
microscopio óptico de campo claro por la
falta de contraste entre las células y el
medio circundante, por lo que es necesario
fijarlos y teñirlos en un frotis.
Un frotis se prepara distribuyendo una
pequeña suspensión de los
microorganismos sobre una superficie
transparente que, posteriormente, se fija a
la superficie con calor o solventes
orgánicos; lo que causará la inactivación o
de sus características.
Existen diferentes tipos de tinciones:
simple, diferencial y selectiva, de acuerdo
con el número y tipo de colorantes
utilizados y de los objetivos de estudio. La
tinción que hace uso de un solo colorante
es la simple.
Las tinciones diferenciales permiten
diferenciar microorganismos con
características superficiales distintas, por
lo que requieren más de un colorante. La
más utilizada en bacteriología es la
propuesta por el médico danés Christian
Gram en 1884, que clasifica los cultivos
bacterianos de menos de 24 horas en Gram Uno de los sistemas más importantes para
positivas y Gram negativas. (Aquiahuatl, y la identificación de microorganismos es
otros, 2012). En la práctica se aplicó la observar su crecimiento en sustancias
tinción de Gram a tres muestras, una era un alimenticias artificiales preparadas en el
frotis de la boca y las otras dos medios laboratorio. El material alimenticio en el
cultivos que se encontraban en laboratorio, que crecen los microorganismos es el
se utilizaron solución de cristal violeta, Medio de Cultivo y el crecimiento de los
azul de metileno, safranina y solución microorganismos es el Cultivo (Yuly,
decolorante (alcohol etílico y acetona 1:1), 2017). Un medio de cultivo es un sustrato
esta técnica clasifica las bacterias en Gram o una solución que contiene nutrientes que
positivas las cuales toman un color morado permiten el desarrollo de
debido al cristal violeta, ya que este se microorganismos. Los medios de cultivos
queda atrapa en la capa gruesa de se clasifican según su origen:
peptidoglucano que rodea a la célula y las
 Naturales: son los preparados a
Gram negativas que tienen una capa de
partir de sustancias naturales de
petidoglucano mucho más delgada es por
origen animal o vegetal como ser
ello que no retiene el violeta cristal y por
extractos de tejidos o infusiones y
esto las células se tiñen con safranina y las
observamos rojas. cuya composición química no se
conoce exactamente.
Las baterías se clasifican en cocos, bacilos  Sintéticos: son los medios que
y helicoidales, según su morfología y estas contienen una composición
a su vez en subclases: química definida cualitativamente
y cuantitativamente. Se utilizan
Cocos Bacilos Helicoidales
Diplococo: Diplobacilo:Vibrio: para obtener resultados
Cocos en Bacilos en ligeramente reproducibles.
grupos de forma decurvados y en  Semisintéticos: son los sintéticos a
dos. dos. forma de los que se les añaden factores de
coma
crecimiento bajo una forma de un
Tetracoco: Cocobacilo: Espirilo: en
Cocos en bacilo oval forma extracto orgánico complejo, como
grupos de de forma helicoidal por ejemplo extracto de levadura.
cuatro. intermedia rígida o en
entre coco y forma de
bacilo. tirabuzón. Su consistencia:
Estreptococ Estreptobac Espiroqueta
 Líquidos: se denominan caldos y
o: Cocos en ilos: : en forma
contienen los nutrientes en
cadenas. Bacilos en de tirabuzón
forma de (helicoidal solución acuosa.
cadena flexible).  Sólidos: se preparan añadiendo un
Estafilococo agar a un medio líquido (caldo) a
: Cocos en razón de 15g/litro. El agar es
agrupacione  Semisólidos: contienen 7,5 g de
s irregulares agar /litro de caldo. Se utilizan para
o en racimo. determinar la motilidad de las
 especies en estudio. (López Tévez
& Torres, 2006 ).
2. METODOLOGÍA
Preparación del medio de
cultivo Plate Count Agar.
Se pesó 3.5 g de Plate Count
Agar.
Se diluyo esta cantidad en 200 ml
de agua en un matraz de 250 ml.
Se llevó a ebullición con
agitación constante.
Se dejó enfriar el recipiente, se
realizó un tapón con papel
aluminio, algodón y papel craft.
Se introdujo al autoclave durante
15 minutos, bajo las siguientes
condiciones una libra de presión
y 121 ° C.
Se esterilizo el espacio con
hipoclorito de sodio y se prendido
un mechero, se agregó a las cajas
de Petri, y se dejó enfriar
Se realizó la siembra.
Preparación del medio de
cultivo agua peptonada.
Se pesó 2.2 g de agua peptonada.
Se diluyo en 220 ml de agua en
un matraz de 250 ml.
Se midió 90 ml en una probeta y
se transfirió a un matraz, se
realizó por duplicado.
Se midió 9 ml en una probeta y se
transfirió a un tubo de ensayo, se
realizó por cuadruplicado.
Se realizó un tapón con papel
aluminio, algodón y papel craft y
se introdujo al autoclave durante
15 minutos bajo las mismas
condiciones del procedimiento
anterior.
Se dejó enfriar dentro del
autoclave y se introdujo en la
nevera.
Nota: Para la preparación del
Plate Count Agar, se tiene en
cuenta las instrucciones del
medio de cultivo que son 17.5 g
para un litro y para el agua
peptonada no se tiene en cuenta
sus instrucciones.
Preparación del extendido
previa a la coloración.
Se esterilizo el área donde se
trabajó con hipoclorito de sodio.
Se tomó un portaobjetos
desengrasado se hizo un circulo
en la mitad.
Se tomaron dos capsulas las
cuales contenían un cultivo.
Se prendido el mechero y se
esterilizo el asa de platino.
Se colocó una gota de agua con la
asa de platino en el centro del
circulo dibujado.
Se colocó la caja de Petri detrás
de mechero y se destapo
Se esterilizo el asa y se hizo un
frotis en el cultivo con mucho
cuidado sin romper el medio de
cultivo.
Se transfirió al portaobjetos y se
emulsiono con la gota de agua y
se dejó secar.
Se realizó la fijación del
extendido. Para ello se pasó
lentamente el portaobjeto, en
forma horizontal, sobre la llama
del mechero manteniendo el
extendido hacia arriba.
La operación se repite hasta
sequedad total, cuidando evitar la
combustión
Se agregó ladel extendido
solución de violeta
cristal y se dejó un minuto y se
lavó con agua.
Se agregó la solución de azul de
metileno se dejó dos minutos y se
lavó con agua.
Se agregó la solución de alcohol
etílico y acetona 1:1 se dejó
treinta segundos y se lavó con
agua y se lavó con agua.
Se agregó la solución de
safranina se dejó un minuto y se
lavó con agua.
Se secó y se llevó al microscopio
óptico en 100 x.
Con un escobillón se realizó el
frotis en la boca y se froto en el
portaobjetos.
Se realizaron los pasos del 9 al 14
 3. RESULTADOS
A continuación se exhiben 3 imágenes
según lo observado a través de la cámara
del microscopio óptico de contraste de
fases, las dos primeras imágenes
corresponden a un cultivo de bacterias
presentes en el intestino de la mojarra o
tilapia roja, que se encontraban en el
laboratorio del centro de investigación
santa lucía. En la primera muestra se
observó la presencia de cocos y en la
muestra 2 la presencia de bacilos. Por otro
lado la muestra 3 correspondía a un frotis
de la boca en el cual no se observó
claramente la presencia de bacterias. No se
pudo determinar si estas bacterias eran Imagen 2. Presencia de bacilos,
Gram positivas o Gram negativas puesto Diplobacilos y Estreptobacilos en la
que la cámara no daba el color original de muestra 2.
las muestras.

Imagen 3. No hay presencia definida de

Imagen 1. Presencia mayoritaria de cocos bacterias en la muestra 3 (frotis de la
y Diplococos en la muestra 1. boca).
Imagen 4. Bacterias cultivadas a partir de
unos cultivos existentes.

4. BIBLIOGRAFÍA
Aquiahuatl, M. d., Volke, T., Prado, L. A.,
Shirai, K., Ramírez, F., & Salazar,
M. (2012). Manual de
microbiologa general. Obtenido de
Manual de practicas de laboratorio
microbiologia general Univerisdad
Autonoma Metropolitana Unidad
Iztapalapa:
http://www.izt.uam.mx/ceu/public
aciones/MMBG/files/manual_mic
robiologia_general.pdf
López Tévez, L., & Torres, C. (2006 ).
Trabajo Práctico Nº 4 Medios de
cultivo. Argentina : Universidad
Nacional del Nordeste. Faculta de
agroindustria. Microbiología
General- Carrera Farmacia.
Yuly, S. U. (2017). Preparacion y
esterilizacion de medios de cultivo.
Barrancabermeja.