Extracción de

ADN
 Genética molecular
Los diferentes pasos de la técnica de extracción de ADN se basan en las
propiedades fisicoquímicas de este ácido nucleico.

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS

NUCLEICOS

 El ADN es un ácido capaz de formar sales con iones cargados

positivamente (cationes).

 Es soluble en soluciones concentradas de sales.

 Es insoluble en alcoholes (tipo etanol o isopropanol).

 El ADN es destruido (depurinado) a pH ácido (menor de 4,0), es

insoluble a pH 5.6, pero es soluble a pH 8,0.

 Genética molecular
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS
NUCLEICOS

Concentración Salina

• La mayor concentración de iones positivos en el medio (Na+,

K+) neutraliza la carga negativa de los fosfatos del esqueleto
fosfodiéster, disminuyendo las fuerzas de repulsión y
estabilizando la estructura de la doble hélice.
 Genética molecular
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS
NUCLEICOS

Hidrolisis Quimica

• La hidrólisis ácida remueve todas las bases púricas

(hidrólisis de uniones N-glicosídicas entre pentosa y las
bases púricas) sin afectar las uniones fosfodiéster del
esqueleto nucleotídico.
• A pH alcalino, el ADN es resistente, mientras que el ARN se
hidroliza completamente (la diferencia se debe a la presencia
de –OH en el C2 de la pentosa).
Extracción y Purificación
de ADN
Extracción y Purificación de ADN

La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la

primera etapa de la mayoría de los estudios de biología molecular
y ADN recombinante.

Existen diversos métodos de extracción de ADN, en función del

tipo de muestra y del grado de pureza que se pretende obtener.

Se debe tener claros los objetivos analíticos para seleccionar

correctamente el método más adecuado de extracción. La calidad
y la pureza de los ácidos nucleicos son dos de los elementos más
importantes en este tipo de análisis.
 Aislamiento de Ácidos Nucleicos
La elección de la técnica más adecuada suele efectuarse conforme a
los siguientes criterios :

 Ácido nucleico diana (ADN o ARN)

 Localización del ácido nucleico (genómico, plasmídico,
mitocondrial, etc)
 Organismo fuente
 Material inicial (tejido, células en suspensión, hoja, semilla,
etc.)
 Resultados deseados (rendimiento, pureza, calidad, tiempo
que requiere la purificación)
 Uso posterior (PCR, clonación, RFLP, transferencia, RT-PCR,
síntesis de ADNc, etc.)
 Pasos generales en la Extracción de
Ácidos Nucleicos
1- Homogeneización o lisis:
Permite la disgregación de la estructura tisular y celular facilitando
la salida de los ácidos nucleicos.

2- Separación y purificación:
Permite la eliminación progresiva de proteínas y otros
contaminantes celulares, y la obtención de un material genético
cada vez más limpio.

3- Precipitación:
Permite la obtención de un ácido nucleico purificado, listo para ser
almacenado o diluido en la concentración deseada para su
análisis
 1- Lisis de Células o Tejidos
 Tiene que ser suficientemente fuerte para romper el material
inicial complejo (Ej: un tejido), pero suficientemente suave para
preservar el ácido nucleico diana.

 rotura mecánica (trituración, lisis

hipotónica, etc.)
 tratamiento químico (detergentes,
agentes caotrópicos, reducción con
tioles, etc.)
 digestión enzimática (Proteinasa K,
etc.)

 Una misma solución puede contener detergentes que

solubilicen las membranas celulares y sales caotrópicas fuertes
que inactiven las enzimas intracelulares.
2- Eliminación de proteínas y restos celulares
Tras la lisis celular y la inactivación de las nucleasas, los restos de
células se eliminan fácilmente por precipitación.

DNA debe ser disociado de :

 Proteinas

 Ciertas enzimas (ej

nucleasas) deben ser
inactivadas por
desnaturalización
Técnica de extracción que utiliza solventes
orgánicos como el fenol y el cloroformo

 Detergentes ej: Dodecil sulfato sódico (SDS)

 Enzimas ej: Proteinasa K
 Solventes ej: Cloroformo, Fenol
 Sales ej: acetato de amonio, NaCl
3- Precipitación del ADN
La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y
concentración

ALCOHOL

ADN
precipitado

Se basa en la deshidratación de la molécula mediada por el agregado de

alcoholes, típicamente etanol o isopropanol, lo cual lleva a su
precipitación.

La precipitación es un fenómeno reversible, mediante la disolución del

Acido Nucleico en soluciones acuosas.
Extracción de ADN de
tejido vegetal

https://www.youtube.com/watch?v=nXeB1Ib13P8

Universitat Politècnica de València UPV

Autora: Pérez De Castro Ana María

Electroforesis
 Electroforesis
La electroforesis en gel es un método utilizado para separar macromoléculas
en función del tamaño y la carga eléctrica.

El término electroforesis describe la migración de las partículas cargadas

bajo la influencia de un campo eléctrico, que genera la fuerza de
desplazamiento de las moléculas a través de la matriz del gel.

La corriente pasa a través del gel con la ayuda de un medio líquido (buffer).
 Electroforesis
Geles de Agarosa
El gel actúa como “tamiz molecular”, separando las moléculas en
función de su tamaño.
 Electroforesis
Preparación de Geles de Agarosa

Pozos o fosas donde

se siembran las
muestras

3
Gel de
agarosa
 Electroforesis
Geles de Agarosa
Cada muestra se siembra en una fosa diferente

Vista
superior

Vista
lateral
 Electroforesis
Geles de Agarosa
Durante la electroforesis las muestras migran a través de la matriz
del gel de agarosa.

Fragmentos de ADN
migrando a través
de la matriz del gel.

Los fragmentos de ADN que migran a través del gel no pueden

observarse a simple vista, necesitan ser teñidos con un colorante.
 Electroforesis
Una vez separados en COLORANTE
el gel, los fragmentos
de ADN de las
muestras
INTERCALANTE DE BASES

se detectan mediante tinción con

agentes intercalantes como el
bromuro de etidio.
 Electroforesis
Cuando un gel se tiñe con un colorante que se une al ADN, los fragmentos
de ADN pueden verse como bandas, las cuales representan un grupo de
fragmentos de ADN del mismo tamaño.

Los fragmentos , una vez teñidos, pueden ser visualizados utilizando

un Transiluminador de Luz Ultravioleta
Electroforesis en gel
de agarosa
https://www.youtube.com/watch?v=U1g2qt3juZw

Universitat Politècnica de València UPV

Autora: Pérez De Castro Ana María