ADN Recombinane-David P. Clark

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CAPÍTULO
3
ADN recombinante
Tecnología
Aislamiento y purificación de ADN
La electroforesis separa fragmentos de ADN por tamaño
Las enzimas de restricción cortan el ADN; La ligasa se une al ADN
Métodos de detección de ácidos nucleicos
Marcado radiactivo de ácidos nucleicos y autorradiografía.
Detección de fluorescencia de ácidos nucleicos
Marcado químico con biotina o digoxigenina
Las hebras complementarias se derriten y se vuelven a recocer
Hibridación de ADN o ARN en transferencias Southern y Northern
63
Fluorescencia En situación Hibridación (PESCADO)
Propiedades generales de los vectores de clonación
Rasgos útiles para la clonación de vectores
Tipos específicos de vectores de clonación
Introducción de genes clonados en bacterias mediante transformación
Construyendo una biblioteca de genes
Detección de la biblioteca de genes mediante hibridación
Bibliotecas de expresión eucariótica
Características de los vectores de expresión
La recombinación aumenta la velocidad de la clonación de genes
Vectores de clonación Gateway®
Biotecnología
Copyright © 2016 Elsevier Inc. Todos los derechos
reservados. http://dx.doi.org/10.1016/B9780123850157.00003X
Tecnologia de ADN recombinante
AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE ADN
Lo básico de toda investigación biotecnológica es la capacidad de manipular el ADN. En primer lugar, para el
trabajo con ADN recombinante, los investigadores necesitan un método para aislar el ADN de diferentes organismos.
Aislar el ADN de las bacterias es el procedimiento más sencillo porque las células bacterianas tienen poca
estructura más allá de la pared celular y la membrana celular. Las bacterias como E. coli son los organismos
preferidos para manipular cualquier tipo de gen debido a la facilidad con la que se puede aislar el ADN. E. coli
mantiene el ADN genómico y el plásmido dentro de la célula. El ADN genómico es mucho más grande que el
ADN plasmídico, lo que permite separar las dos formas diferentes.
Para liberar el ADN de una célula, se debe destruir la membrana celular. En el caso de las bacterias, una
enzima llamada lisozima digiere el peptidoglicano, que es el componente principal de la pared celular. A
continuación, un detergente como el dodecilsulfato de sodio (SDS) rompe las membranas celulares al alterar la
bicapa lipídica. Para otros organismos, la alteración de la célula depende de su arquitectura. Es necesario
triturar muestras de tejido de animales y plantas para liberar los componentes intracelulares. Las células vegetales
se cortan mecánicamente en una licuadora para romper las duras paredes celulares y luego el tejido de la pared
se digiere con enzimas que rompen los largos polímeros de lignina y celulosa en monómeros.
El ADN de la punta de la cola de un ratón se aísla después de que la proteinasa K degrada el tejido y el detergente
disuelve las membranas celulares. Las células cultivadas en placas son probablemente las más fáciles, ya que
no tienen paredes celulares ni otras estructuras fuera de su membrana celular. El detergente por sí solo altera la
membrana celular para liberar los componentes intracelulares. Cada organismo o tejido necesita ligeras
variaciones en el procedimiento para liberar componentes intracelulares, incluido el ADN.
Una vez liberados, los componentes intracelulares se separan de los restos insolubles, como las membranas
celulares, los huesos, los cartílagos y/o la pared celular, ya sea mediante centrifugación o extracción
química. La centrifugación separa los componentes según su tamaño, porque las moléculas más pesadas o más
grandes se sedimentan a un ritmo más rápido que las moléculas más pequeñas. Además, los materiales
que son insolubles en la fase líquida forman agregados que sedimentan más rápidamente en el fondo del tubo
64 de centrífuga. Por ejemplo, una vez digerida la pared celular, sus fragmentos son más pequeños que las
grandes moléculas de ADN. La centrifugación hace que el ADN forme un sedimento, pero los fragmentos solubles
de la pared celular permanecen en solución. Otro método para separar componentes celulares, la extracción
química, utiliza las propiedades del fenol para eliminar proteínas no deseadas del ADN. El fenol es un ácido
que disuelve del 60% al 70% de toda la materia viva, especialmente las proteínas. El fenol no es muy soluble
en agua y cuando se mezcla con una muestra acuosa de ADN y proteína, las dos fases se separan, de forma
muy parecida al aceite y el agua. La proteína se disuelve en la capa de fenol y los ácidos nucleicos en la capa
acuosa. Las dos fases se separan mediante centrifugación y la capa acuosa de ADN se elimina del fenol.
Una vez que se eliminan las proteínas, la muestra todavía contiene ARN junto con el ADN. Como el ARN también
es un ácido nucleico, no es soluble en fenol. Afortunadamente, la enzima ribonucleasa (RNasa) digiere el
ARN y lo convierte en ribonucleótidos. El tratamiento con ribonucleasa deja una muestra de ADN en una solución
que contiene trozos cortos de ARN y ribonucleótidos. Cuando se añade un volumen igual de alcohol, el ADN
extremadamente grande cae de la fase acuosa y se aísla mediante centrifugación. Los ribonucleótidos más
pequeños permanecen solubles. Entonces el ADN está listo para su uso en diversos experimentos.
El ADN se puede aislar eliminando primero los componentes de la pared celular y la membrana celular. A continuación,
las proteínas se eliminan con fenol y, finalmente, el ARN se elimina con la ribonucleasa.
LA ELECTROFORESIS SEPARA FRAGMENTOS DE ADN POR TAMAÑO
La electroforesis en gel se utiliza para separar fragmentos de ADN por tamaño (fig. 3.1). El gel está formado por
agarosa, un polisacárido extraído de algas que se comporta como gelatina. La agarosa es un polvo que se disuelve
en agua sólo cuando se calienta. Una vez que la solución se enfría, la agarosa se endurece.
Capítulo 3
FIGURA 3.1
Electroforesis de ADN
(A) Foto de suministros de
electroforesis. La cámara de
electroforesis contiene un gel
de agarosa en la parte central
y el resto del tanque se llena
con una solución tampón.
Luego, los cables rojo y negro se
conectan a una fuente eléctrica.
Sistemas de electroforesis
horizontal FisherBiotech,
sistema Midigel; Estándar;
tamaño de gel de 13 × 16 cm;
volumen de tampón de 800 ml;
Modelo No. FBSB1316.
(B) Separación del ADN en gel
de agarosa. El tamaño de
A B los fragmentos se puede calcular
comparándolos con el marcador
de ADN estándar en el carril 1. Las
bandas más brillantes en el
marcador son de 1000 pares de
Para visualizar el ADN, la agarosa se solidifica en una losa rectangular de aproximadamente 1/4 de pulgada de espesor al bases y 500 pares de bases,
verter el líquido fundido en una bandeja especial. Al insertar un peine en un extremo de la bandeja antes de que se con el marcador de 1000 pares
endurezca, se forman pequeños pozos o agujeros. Una vez que el gel se solidifica, se retira el peine dejando pequeños de bases más cerca de los
pocillos en un extremo. pocillos (marcados con
números). 1–8). Usado con
La electroforesis en gel utiliza corriente eléctrica para separar las moléculas de ADN por tamaño. La placa de agarosa se permiso de Gha daksaz, et al.
sumerge en un tanque lleno de tampón que tiene un electrodo positivo en un extremo y un electrodo negativo en el (2014). La prevalencia de sesenta y cinco
otro. Se cargan muestras de ADN en los pocillos y, cuando se aplica un campo eléctrico, el ADN migra a través del gel. algunos genes de virulencia
de Pseu domonas relacionados
La columna vertebral de fosfato del ADN está cargada negativamente, por lo que se aleja del electrodo negativo y se
con la formación de
acerca al electrodo positivo.
biopelículas y la producción de alginato entre aislados clín
La agarosa polimerizada actúa como un tamiz con pequeños agujeros entre las cadenas enredadas de agarosa.
J Appl Biomed 13(1), 61–
El ADN debe migrar a través de estos espacios. La agarosa separa el ADN por tamaño porque la agarosa ralentiza más
68. DOI: 10.1016/j.
los trozos más grandes de ADN. jab.2014.05.002.
Para visualizar el ADN, se retira el gel de agarosa del tanque y se sumerge en una solución de bromuro de etidio.
Este tinte se intercala entre las bases del ADN o del ARN, aunque se une menos tinte al ARN porque es monocatenario.
Cuando el gel se expone a la luz ultravioleta, adquiere una fluorescencia de color naranja brillante. Dado que el
bromuro de etidio es un mutágeno y carcinógeno, actualmente en la mayoría de los laboratorios se utilizan
colorantes de ADN menos peligrosos, como SYBR Safe®.
Este tinte de ADN también se excita con la luz ultravioleta, emitiendo una fluorescencia de color naranja brillante. En
la Figura 3.1, los fragmentos de ADN se visualizan mediante un tinte cargado positivamente de la familia de las
tiazinas. El tinte interactúa con la columna vertebral cargada negativamente del ADN y es una alternativa no tóxica que
no requiere fuentes de luz ultravioleta.
El tamaño del ADN que se examina afecta el tipo de gel que se utiliza. Las moléculas de ADN del mismo tamaño
suelen formar una banda apretada, y el tamaño se puede determinar comparándolo con un conjunto de estándares de
peso molecular ejecutados en un pocillo diferente. Como los estándares son de tamaño conocido, el fragmento de ADN
experimental se puede comparar directamente. Cuando las muestras de ADN se separan por tamaño mediante un gel
de agarosa, se pueden separar fragmentos de ADN desde aproximadamente 200 pares de bases hasta 10.000 pares
de bases. Para fragmentos de ADN de 50 a 1000 pares de bases, se utilizan en su lugar geles de poliacrilamida. Estos
geles son capaces de resolver fragmentos de ADN que varían en un solo par de bases y son esenciales para
secuenciar el ADN con el método de Sanger (consulte el Capítulo 4). Para fragmentos de ADN muy grandes (de 10
kilobases a 10 megabases) se utiliza agarosa, pero la corriente se alterna en dos ángulos diferentes. Electroforesis
en gel de campo pulsado (PFGE), ya que esta es
llamado, permite que fragmentos muy grandes de ADN migren más lejos que si la corriente fluyera en una sola
dirección. Cada cambio de dirección afloja grandes trozos de ADN que están atrapados dentro de la matriz del gel, lo
que les permite migrar más. Finalmente, la electroforesis en gel de gradiente se puede utilizar para resolver
fragmentos que tienen un tamaño muy similar. Un gradiente de concentración de acrilamida, tampón o electrolito
puede reducir la compresión (es decir, el amontonamiento de fragmentos de tamaño similar) debido a la estructura
secundaria y/o ralentizar los fragmentos más pequeños en el extremo inferior del gel.
Los fragmentos de ADN se separan por tamaño mediante electroforesis en gel. Una corriente hace que los fragmentos de
ADN se alejen del electrodo negativo y se acerquen al positivo. A medida que el ADN viaja a través de la agarosa, los
fragmentos más grandes se quedan atrapados en los poros del gel más que los fragmentos de ADN más pequeños.
La electroforesis en gel de campo pulsado separa grandes trozos de ADN alternando la corriente eléctrica en
ángulos rectos.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN CORTAN EL ADN; LA LIGASE SE UNE AL ADN
La capacidad de aislar, separar y visualizar fragmentos de ADN sería inútil a menos que estuviera disponible algún
método para cortar el ADN en fragmentos de diferentes tamaños. Afortunadamente, las enzimas de restricción o
endonucleasas de restricción naturales son la clave para producir fragmentos de ADN. Estas enzimas bacterianas se
unen a sitios de reconocimiento específicos en el ADN y cortan la columna vertebral de ambas cadenas.
Evolucionaron para proteger a las bacterias del ADN extraño, como los virus. Las enzimas no cortan el ADN
de sus propias células porque son sensibles a la metilación; es decir, si una de las bases de nucleótidos en la
secuencia de reconocimiento está metilada, entonces la enzima de restricción no puede unirse y por lo tanto no
puede cortar el ADN metilado. Las bacterias producen enzimas de modificación que reconocen la misma secuencia
que la enzima de restricción correspondiente. Estos metilan cada sitio de
reconocimiento en el genoma bacteriano.
66 5 GTTAAC 3 5 GAATTC 3
3 CAATTG 5 3 CTTAAG 5
Por tanto, las bacterias pueden producir la enzima de restricción sin
poner en peligro su propio ADN.
CORTADO POR Hpa1 CORTADO POR EcoR1
Se han aprovechado las enzimas de restricción para cortar el ADN
en sitios específicos, ya que cada enzima de restricción tiene una
secuencia de reconocimiento particular. Las diferencias en el sitio de
5 GTT CAA 3 AATTC 3
escisión determinan el tipo de enzima de restricción. Las enzimas de
3 CAA TTG5 5G G5
restricción de tipo I cortan la cadena de ADN en 1000 o más pares de
3 CTTAA
bases de la secuencia de reconocimiento. Las enzimas de restricción de
EXTREMOS ROMOS EXTREMOS PEGAJOSOS
tipo II se cortan en el medio de la secuencia de reconocimiento y son las
más útiles para la ingeniería genética. Las enzimas de restricción de tipo
FIGURA 3.2 II pueden cortar ambas hebras de la doble hélice en el mismo punto, dejando extremos romos, o pueden cortar en
Enzimas de restricción tipo II: diferentes sitios de cada hebra dejando extremos monocatenarios, a veces llamados extremos pegajosos (fig. 3.2).
extremos romos versus pegajosos
Las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción de tipo II suelen ser repeticiones invertidas, de modo
que la enzima corta entre las mismas bases en ambas cadenas. Algunas enzimas de restricción comúnmente
Hpal es una enzima de
utilizadas para aplicaciones biotecnológicas se enumeran en la Tabla 3.1. Dado que las enzimas de restricción reconocen
restricción de extremo romo; es
decir, corta ambas hebras una secuencia nucleica específica, también se pueden utilizar para comparar la secuencia de nucleótidos de
diferentes organismos o individuos (ver Cuadro 3.1).
de ADN exactamente en la misma posición.
EcoRI es una enzima de restricción
El número de pares de bases en la secuencia de reconocimiento determina la probabilidad de corte.
de extremos pegajosos. La
enzima corta entre G y A en Encontrar una secuencia particular de cuatro nucleótidos es mucho más probable que encontrar una secuencia de
ambas hebras, lo que genera reconocimiento de seis pares de bases. Por eso, para generar menos fragmentos y más largos, se utilizan enzimas
cuatro pares de bases salientes de restricción con seis o más secuencias de reconocimiento de pares de bases. Por el contrario, las enzimas de
en los extremos del ADN. Dado cuatro pares de bases producen más fragmentos más cortos del mismo segmento original de ADN.
que estos extremos pueden
formar pares de bases con Cuando se cortan dos muestras de ADN diferentes con la misma enzima de restricción de extremo pegajoso, todos
secuencias complementarias, se los fragmentos tendrán salientes idénticos. Esto permite unir fragmentos de ADN de dos fuentes (p. ej., dos organismos
consideran “pegajosos”. diferentes) (fig. 3.3). Los fragmentos se unen o ligan utilizando ADN ligasa, la misma enzima que liga los fragmentos
de Okazaki durante la replicación (consulte el Capítulo 4).
Capítulo 3
Tabla 3.1 Tabla de enzimas de restricción comunes
Enzima Organismo fuente Secuencia de reconocimiento
HpaII Haemophilus parainfluenzae C/CGG

GGC/C
MboI Moraxella bovis /GATC

GATC/
NdeII Neisseria denitrificante /GATC

GATC/
EcoRI Escherichia coli RY13 G/AATTC

CTTAA/G
EcoRII Escherichia coli RY13 /CCWGG

GGWCC/
EcoRV Escherichia coliJ62 /pGL74 GAT/ATC

CTA/ETIQUETA
BamHI Bacilo amyloliquefaciens G/GATCC

CCTAG/G
SauI Estafilococo aureus CC/TNAGG

GGANT/CC
BglI bacilo globigii GCCNNNN/NGGC

CGGN/NNNNCCG
No yo Nocardia otitidiscaviarum GC/GGCCGC

CGCCGG/CG
DraII Deinococcus radiophilus RG/GNCCY

67
YCCNG/GR
/, posición donde corta la enzima.
N, cualquier base; R, cualquier purina; Y, cualquier pirimidina; W, A o T.
La ligasa más común utilizada es en realidad la del bacteriófago T4. La ligasa cataliza el enlace entre
el 3′OH de una cadena y el 5′PO4 de la otra cadena de ADN. La ligasa es mucho más eficiente con
extremos pegajosos que sobresalen, pero también puede unir extremos romos mucho más lentamente.
Las enzimas de restricción son enzimas naturales que reconocen una secuencia particular de ADN y cortan la cadena principal de fosfato.
Cuando dos fragmentos de ADN son cortados por la misma enzima de restricción, los dos extremos tienen superficies compatibles.
cuelga que puede volver a conectarse mediante ligasa.
Cuadro 3.1 Los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción identifican a los individuos
Las enzimas de restricción son útiles para muchas aplicaciones diferentes. Esta técnica se puede aplicar al ADN de dos individuos de la misma especie. Aunque las
Debido a que la secuencia de ADN es diferente en cada organismo, el patrón de los sitios diferencias en la secuencia de ADN serán pequeñas, se pueden utilizar enzimas de
de restricción también será diferente. La fuente de aislamiento restricción para identificar estas diferencias. Si la diferencia de secuencia cae en un sitio de
El ADN se puede identificar mediante este patrón. Si se aísla el ADN genómico de un reconocimiento de enzimas de restricción, se produce un polimorfismo de longitud de
organismo y se corta con una enzima de restricción particular, se puede separar e identificar fragmentos de restricción (RFLP) (Fig. A).
mediante electroforesis un conjunto específico de fragmentos. Si la misma enzima de Cuando se comparan los patrones de enzimas de restricción, el número y tamaño de uno o
restricción corta el ADN de un organismo diferente, se generará un conjunto diferente de dos fragmentos se verán afectados por cada diferencia de bases que afecte a un sitio de
fragmentos. corte.
(Continuado)
Cuadro 3.1 Los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción identifican a los individuos—cont.
sitio de corte sitio de corte sitio de corte sitio de corte sitio de corte
I a i b ii C III d IV mi v F
CORTAR CON ENZIMA
a d
Dos
relacionado
b mi
ADN
moléculas
C F
Sitio de corte mutado
II a i b ii C III d IV mi v F
CORTAR CON ENZIMA
a
68 mi
b F
c+d
CORRER GELES
I II
cd
d falta d
a a
F F
b b
mi mi
C falta c
FIGURA A Análisis RFLP
El ADN de organismos relacionados muestra pequeñas diferencias en la secuencia que provocan cambios en los sitios de restricción. En el ejemplo que se muestra, al cortar un
segmento de ADN del primer organismo se obtienen seis fragmentos de diferentes tamaños (etiquetados de la a a la f en el gel). Si la región equivalente del ADN de un organismo
relacionado fuera digerida con la misma enzima, se esperaría un patrón similar. Aquí existe una diferencia de un solo nucleótido que elimina uno de los sitios de restricción. En
consecuencia, la digestión de este ADN produce sólo cinco fragmentos. Los fragmentos cyd ya no se ven pero forman una nueva banda etiquetada cd.
Capítulo 3
5 GGATCC 3 5 AGATCT 3
3 CCTAGG 5 3 TCTAGA 5
Bam hola DIGERIR Bgl II
PAG
OH
5 GRAMO
3 5 GATCT 3
3 CCTAG 5 3 A 5
PAG OH
RECOCER
OH PAG
5 GATCT
GRAMO
3
3 CCTAG A 5
PAG
OH
LIGASA
OH PAG
5 GATCT
GRAMO
3
3 CCTAG A 5
PAG
OH
atp 69
ADP + Pi
5 GATCT
GRAMO
3
3 CCTAG A 5
PAG
OH
ADP + Pi
atp
5 GATCT
GRAMO
3
3 CCTAG A 5
UNA PIEZA
FIGURA 3.3 Los salientes compatibles se unen mediante ADN ligasa BamHI y Bgl Il generan
los mismos extremos salientes o pegajosos: un saliente 3′CTAG5′ más un saliente 5′GATC3′. Estos son pares de bases
complementarios y por enlaces de hidrógeno. Las roturas en la columna vertebral del ADN están selladas por la ADN ligasa T4,
que hidroliza el ATP para energizar la reacción.
MÉTODOS DE DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Las metodologías de ADN recombinante requieren la capacidad de detectar ADN. Una de las formas
más sencillas de detectar la cantidad de ADN o ARN en solución es medir la absorbancia de la luz
ultravioleta a 260 nm (fig. 3.4). El ADN absorbe la luz ultravioleta debido a las estructuras anulares de
las bases. El ARN monocatenario y los nucleótidos libres también absorben la luz ultravioleta. De hecho, ellos
FIGURA 3.4 Bases libres repartidas absorben más luz porque sus estructuras son

y absorber más más sueltas. Dado que la absorbancia de la
Determinación de la concentración
de ADN Nucleico luz ultravioleta depende de la cantidad de ADN
Todos los ácidos nucleicos absorben los rayos UV. ácido
y de la estructura molecular, la relación entre
luz a través de los anillos aromáticos polímero
ultravioleta
la absorbancia de la luz ultravioleta y la
de las bases. Las mareas de
fuente
concentración es
nucleós apiladas (a la izquierda)
absorben menos rayos UV que las Concentración de ADN bicatenario (μg/ml) =
bases dispersas (a la derecha)
(OD260) × (50 μg ADN/ml)/
debido a la estructura ordenada.
(1 unidad OD260 )
Concentración de ARN (μg/ml) = (OD260) × (40
μg de ARN/ml)/(1 unidad de DO260 )
Además de la cantidad de ADN, normalmente se utiliza una segunda lectura de absorbancia a 280 nm para
determinar la pureza de la muestra. La relación del valor de absorbancia de 260 nm dividida por el valor de
absorbancia de 280 nm indicará si la muestra es pura. Si la muestra es ADN puro, entonces la proporción
260/280 es 1,8; mientras que una proporción de 260/280 para el ARN puro es 2,0. Cuando las proporciones se
desvían del valor esperado, podría haber fenol residual de la purificación o una concentración muy baja de ADN
o ARN.
La concentración de ADN o ARN en un líquido se puede determinar midiendo la absorbancia de la luz ultravioleta.
a 260 nm.
Marcado radiactivo de ácidos nucleicos y autorradiografía.
La absorción de luz ultravioleta es un método general para detectar ADN, pero no distingue entre diferentes
70
moléculas de ADN. El ADN también se puede detectar con isótopos radiactivos (fig. 3.5). Durante la replicación
se pueden incorporar precursores radiactivos como el 32P en forma de grupo fosfato y el 35S en forma de
fosforotioato .
Debido a que el ADN nativo no contiene átomos de azufre, uno de los átomos de oxígeno de un grupo fosfato
se reemplaza con azufre para producir fosforotioato. La mayoría de las moléculas radiactivas utilizadas en los
laboratorios tienen una vida corta. El 32P tiene una vida media de 14 días y el 35S tiene una vida media de 68
días, por lo que los isótopos se degradan bastante rápido. Aunque el ADN radiactivo es invisible, la película
fotográfica se volverá negra cuando se exponga al ADN radiactivo. El ADN marcado radiactivamente se considera
"caliente", mientras que el ADN no marcado se considera "frío".
La autorradiografía identifica la ubicación del ADN marcado radiactivamente en el gel (fig. 3.6).
Si el gel es fino, como la mayoría de los geles de poliacrilamida, se seca con calor y vacío. Si el gel es espeso,
como los geles de agarosa, el ADN se transfiere a una membrana de nailon mediante acción capilar (consulte
la figura 3.9, más adelante). El gel seco o la membrana de nailon se colocan junto a una película fotográfica. A
medida que el fosfato radiactivo se desintegra, la radiación vuelve negra la película fotográfica. Sólo las áreas al
lado del ADN radiactivo tendrán puntos o bandas negras. El uso de una película detecta dónde está el ADN caliente
en un gel, y el uso de bromuro de etidio muestra dónde está todo el ADN, caliente o frío. Estos dos métodos
permiten distinguir un fragmento de ADN de otro.
Los isótopos radiactivos se incorporan a la estructura del ADN durante la replicación. La autorradiografía identifica el ADN “caliente”
marcado radiactivamente.
Detección de fluorescencia de ácidos nucleicos
La autorradiografía tiene sus ventajas, pero trabajar con desechos radiactivos y eliminarlos es costoso, tanto desde
el punto de vista monetario como ambiental. El uso de nucleótidos marcados con fluorescencia fue
Capítulo 3
5O oh 5 oh 35S
32P PAG
Base Base
−O oh oh −O OOO
OH OH
oh 35S
32P PAG
Base Base
−O OOO −O OOO
OH OH
3 3
ADN ETIQUETADO CON 32P ADN ETIQUETADO 35S
FIGURA 3.5 ADN marcado radiactivamente
El ADN se puede sintetizar con nucleótidos precursores radiactivos. Estos nucleótidos tienen 32P (en lugar de fósforo 31P no
radiactivo ) o 35S (que reemplaza al oxígeno) en la columna vertebral de fosfato.
GEL AUTORADIOGRAFÍA
Gel Película
71
Película
Gel
Gel con radioactivo Coloque la película sobre gel y manténgala Posición de espectáculos de película

pero bandas invisibles oscuro, luego revelar la película de bandas
de ADN
FIGURA 3.6 Autorradiografía
Se seca un gel que contiene ADN (o ARN) radiactivo y se coloca encima un trozo de película fotográfica. Los dos se cargan en una caja de casete que impide la entrada de luz.
Después de un tiempo (de horas a días), la película se revela y aparecen líneas oscuras donde estaba presente el ADN radiactivo.
desarrollado como un mejor método de detección de ADN (Fig. 3.7). Las etiquetas fluorescentes absorben
luz de una longitud de onda, lo que excita los átomos, aumentando el estado energético de la etiqueta.
Este estado excitado libera un fotón de luz en una longitud de onda diferente (más larga) y regresa al
estado fundamental. El fotón emitido se detecta con un fotodetector. Hay muchas etiquetas fluorescentes
diferentes y cada una emite una longitud de onda de luz diferente. Algunos sistemas de fotodetección
son lo suficientemente sensibles como para distinguir entre estas diferentes etiquetas; por lo tanto, si
diferentes bases tienen diferentes etiquetas fluorescentes, el fotodetector puede determinar qué base está
presente. Ésta es la base de la mayoría de las máquinas modernas de secuenciación de ADN (consulte el
Capítulo 4).
Se pueden utilizar nucleótidos marcados con fluorescencia para incorporar una etiqueta fluorescente en el ADN durante la replicación o
amplificación por PCR.
NIVELES DE ENERGÍA EN FLUORESCENCIA
MARCADO FLUORESCENTE DEL ADN
T1 estado emocionado
2 estado emocionado
T1
etiqueta fluorescente Relajación
Emocionante
Fluorescencia
Haz de luz
1 Excitación Fluorescencia
AÍGRENE
3
(longitud (longitud
de onda más corta de onda más larga
fotón) fotón)
A ADN B S0 Estado fundamental
FIGURA 3.7 Marcado fluorescente del ADN
(A) Etiquetado fluorescente del ADN. Durante la síntesis, se incorpora un nucleótido unido a una etiqueta fluorescente en el extremo 3' del ADN. Un haz de luz excita la
etiqueta fluorescente, que a su vez libera luz de una longitud de onda más larga. (B) Niveles de energía en fluorescencia. La molécula fluorescente adherida al ADN
tiene tres niveles de energía diferentes: S0, S1′ y S1. El S0, o estado fundamental, es el estado anterior a la exposición a la luz. Cuando la molécula fluorescente se
expone a un fotón de luz, la etiqueta fluorescente absorbe la energía y entra en el primer estado excitado, S1'. Entre S1′ y S1, la etiqueta fluorescente se relaja
ligeramente pero no emite luz. Finalmente, el estado de alta energía libera su exceso de energía emitiendo un fotón de longitud de onda más larga. Esta liberación de
fluorescencia devuelve la molécula al estado fundamental.
72
Marcado químico con biotina o digoxigenina
La biotina es una vitamina y la digoxigenina es un esteroide de la planta de la dedalera. El uso de
estas dos moléculas permite a los científicos etiquetar el ADN sin radiactividad ni fotodetectores
costosos. Para incorporar la etiqueta al ADN, se une químicamente una molécula de biotina o
digoxigenina al uracilo; por lo tanto, el ADN se sintetiza con el uracilo marcado reemplazando a la timina usando in vitro
Replicación del ADN como se describe en el Capítulo 4. Se mezclan en un tubo un molde de ADN
monocatenario, ADN polimerasa, un cebador de ADN corto y nucleótidos (dATP, dGTP, dCTP, más
dUTP unido a biotina o digoxigenina) y se incuban. La ADN polimerasa sintetiza la cadena complementaria
de la plantilla, incorporando uracilo unido a biotina o digoxigenina frente a todas las adeninas.
El ADN marcado se visualiza en un proceso de dos pasos (fig. 3.8). Para visualizar la biotina, se
añade a la muestra de ADN una molécula de avidina o estreptavidina, ambas con una alta afinidad por
la biotina. La avidina, identificada originalmente en la clara de huevo, tiene una mayor tendencia a la
agregación y está glicosilada; por lo tanto, la estreptavidina se utiliza con más frecuencia. La
estreptavidina se aísla de Streptomyces avidinii y no está glicosilada. Por el contrario, se utiliza un
anticuerpo específico para visualizar la digoxigenina. Tanto la avidina como el anticuerpo digoxigenina
están conjugados con un fluoróforo o una enzima indicadora, lo que permite una detección visible. Un
ejemplo de enzima indicadora es la fosfatasa alcalina, una enzima que elimina los fosfatos de una variedad
de sustratos. Varias moléculas cromogénicas diferentes actúan como sustratos para la fosfatasa
alcalina, pero la más utilizada es XPhos. Una vez que la fosfatasa alcalina elimina el grupo fosfato de X
Phos, la molécula intermedia reacciona con el oxígeno y forma un precipitado azul. Este color azul revela
la ubicación del ADN marcado. Otro sustrato de la fosfatasa alcalina es LumiPhos, que es
quimioluminiscente y emite luz visible cuando se elimina el fosfato. Al igual que la autorradiografía,
cuando se coloca una película fotográfica sobre
Capítulo 3
FIGURA 3.8 Etiquetado
ADN ADN
y detección de ADN
con biotina o
Biotina digoxigenina digoxigenina
estreptavidina El ADN se puede sintetizar in
Anticuerpo contra vitro con un nucleótido de
fluoróforo digoxigenina uracilo unido a biotina o
digoxigenina. La estreptavidina se
Luz
Luz une firmemente a la avidina
(paneles de la izquierda) y
el anticuerpo contra la
digoxigenina se une a la digoxigenina (paneles de la derecha).
La estreptavidina y el anticuerpo
contra la digoxigenina se
Biotina digoxigenina pueden conjugar con un fluoróforo
estreptavidina que emite luz de longitudes de
Anticuerpo contra
onda específicas (paneles superiores)
digoxigenina
enzima reportera o con enzimas informadoras como la
enzima reportera peroxidasa de rábano picante o la
fosfatasa alcalina (paneles inferiores).
sustrato Luz o color Las enzimas informadoras actúan

sustrato Luz o color o precipitado sobre diferentes sustratos, algunos
de los cuales liberan luz y
otros forman un precipitado coloreado.
ADN marcado tratado con LumiPhos, la luz emitida hace que la película se oscurezca. Otra posible enzima
informadora es la peroxidasa de rábano picante o HRP, una enzima que reacciona con el luminol para liberar luz.
Como antes, la luz se puede detectar con una película fotográfica.
El ADN marcado con biotina y digoxigenina se detecta utilizando estreptavidina o anticuerpos contra digoxigenina.
Cualquiera de las etiquetas se puede conjugar con fosfatasa alcalina, que reacciona con XPhos para dejar un precipitado 73
azul o LumiPhos para emitir luz visible. Otra enzima indicadora comúnmente utilizada es la peroxidasa de rábano
picante. Estas enzimas informadoras se utilizan para identificar, cuantificar o localizar el ADN marcado.
LOS HILOS COMPLEMENTARIOS SE DERRITEN Y SE REANNEAN
Las hebras antiparalelas complementarias de ADN forman una molécula elegante que es capaz de descomprimirse o
fundirse y volver a unirse o reasociarse (fig. 3.9). Los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las dos mitades
son relativamente débiles. Calentar una muestra de ADN disolverá los enlaces de hidrógeno, dando como resultado
dos hebras simples complementarias.
C C C C
Si la misma muestra de ADN se enfría lentamente, las dos
GRAMO GRAMO GRAMO GRAMO
A t A t A t
hebras se volverán a hibridar de modo que G coincida con C A A
t A t t t A t A
FRESCO
y A coincida con T, como antes. A t CALOR A A CALOR A t A t
t t DESPACIO
t A t A t A
La proporción de pares de bases G/C afecta la cantidad GRAMO C GRAMO C GRAMO C GRAMO C
C C C C
de calor que se requiere para fundir una doble hélice de
GRAMO GRAMO GRAMO GRAMO
GRAMO C GRAMO C GRAMO C GRAMO C

ADN. Los pares de bases G/C tienen tres enlaces de
hidrógeno para fundirse, mientras que los pares de bases A/ FIGURA 3.9 Calor
Derrite el ADN; Enfriamiento
T solo tienen dos. En consecuencia, el ADN con un mayor porcentaje de GC requerirá más energía para fundirse
Reanneals ADN
que el ADN con menos pares de bases de GC. La relación GC se define de la siguiente manera:
Los enlaces de hidrógeno
se disuelven fácilmente cuando
G+C
× 100% se calientan, dejando las dos
A+G+C+T hebras intactas pero separadas.
Cuando la temperatura vuelve a la
La capacidad de comprimir y descomprimir el ADN es crucial para la función celular y también se ha explotado en
normalidad, se vuelven a formar los
biotecnología. La replicación (consulte el Capítulo 4) y la transcripción (consulte el Capítulo 2) dependen de la enlaces de hidrógeno.
separación de las cadenas para generar nuevas cadenas de ADN o ARN, respectivamente. En la investigación
en biología molecular, muchas técnicas, desde la PCR hasta la secuenciación del ADN, aprovechan la naturaleza
complementaria de las cadenas de ADN.
Las hebras complementarias de ADN se separan fácilmente mediante calor y se vuelven a hibridar espontáneamente a medida que el ADN
la mezcla se enfría.
HIBRIDACIÓN DE ADN O ARN EN EL SUR Y NORTE
BOTES
Si se funden dos dobles hélices diferentes de ADN, las hebras individuales se pueden mezclar antes de
enfriarlas y volver a hibridarlas. Si las dos moléculas de ADN originales tienen secuencias similares, una sola
hebra de una puede emparejarse con la hebra opuesta de la otra molécula de ADN. Esto se conoce como
hibridación y puede usarse para determinar si las secuencias de dos muestras separadas de ADN o ARN
están relacionadas. En experimentos de hibridación, el término molécula sonda
se refiere a una secuencia de ADN o gen conocido que se utiliza para detectar secuencias similares en la
muestra experimental o el ADN objetivo .
Las transferencias Southern se utilizan para determinar qué tan estrechamente está relacionado el ADN
de una fuente con una secuencia de ADN de otra fuente. La técnica consiste en formar moléculas de ADN
FIGURA 3.10 La híbridas mezclando ADN de dos fuentes. Una transferencia Southern tiene dos componentes: la secuencia
acción capilar transfiere de la sonda (p. ej., un gen de interés conocido de un organismo) y el ADN objetivo (a menudo de un
ADN del gel a la organismo diferente). Una transferencia Southern típica comienza aislando el ADN objetivo de un
membrana
organismo, digiriéndolo con una enzima de restricción que produce fragmentos de aproximadamente
El ADN monocatenario de un
500 a 10 000 pares de bases de longitud y separando estos fragmentos mediante electroforesis.
gel se transferirá a la
Los fragmentos separados serán de doble hebra, pero si el gel se incuba en un ácido fuerte, el ADN se
membrana. El papel de filtro
absorbe el tampón desde el
separa en hebras simples. Mediante la acción capilar, las hebras individuales se pueden transferir a una
tanque, a través del gel y la membrana como se muestra en la figura 3.10. El ADN permanece monocatenario una vez unido a la
membrana, hasta las toallas membrana.
de papel. A medida que el
74 A continuación, se prepara la sonda. Primero, la secuencia o gen conocido debe aislarse y marcarse
líquido tampón se mueve, el
ADN monocatenario de alguna manera (ver discusión anterior). Identificar genes se ha vuelto más fácil ahora que muchos
también viaja desde el gel y se genomas han sido secuenciados por completo. Por ejemplo, un científico puede obtener fácilmente
adhiere a la membrana. El una copia de un gen humano para utilizarla como sonda para encontrar genes similares en otros organismos.
peso encima de la Alternativamente, utilizando datos de secuencia, se puede diseñar una sonda oligonucleotídica única que
configuración mantiene la
reconozca sólo el gen de interés (consulte el Capítulo 4). Si un oligonucleótido tiene una secuencia común,
membrana y el gel en contacto y ayuda a absorber el líquido del tanque.
se unirá a muchas otras secuencias.
Peso para presionar Por lo tanto, las sondas de
en gel
oligonucleótidos deben ser lo
Pila de toallas de papel
suficientemente largas para tener
secuencias que se unan sólo a uno
Membrana (o muy pocos) sitios específicos
en el genoma objetivo. Para preparar
Gel sondas de ADN para una
transferencia Southern, se marcan
con radiactividad, bioestaño o
digoxigenina (consulte la discusión
anterior). Finalmente, el ADN marcado
se desnaturaliza a alta temperatura para convertirlo en
Papel de filtro
(Los oligonucleótidos sintéticos no
requieren tratamiento, ya que ya son
monocatenarios).
Para realizar una transferencia Southern, la sonda monocatenaria se incuba con la membrana que
transporta el ADN objetivo monocatenario (fig. 3.11). Estos se incuban a una temperatura que permite que
se formen cadenas de ADN híbridas con sólo una pequeña cantidad de desajustes. La temperatura, y
por tanto el nivel de desajuste tolerado, se puede variar dependiendo de qué tan idénticas se espera que
sean la sonda y la secuencia diana. A alta temperatura, la sonda sólo
Capítulo 3
CARGAR Y NYLON DEL SUR FOTOGRÁFICO FIGURA 3.11 Moléculas

GEL PARA CORRER HOJA MANCHA PELÍCULA
de ADN híbridas
Cargando Puede detectar relacionados
tragamonedas
Secuencias en
Transferencias del sur
TRANSFERIR SUMERGIRSE EN LUGAR
La transferencia Southern requiere
INVESTIGACION PELÍCULA
que el ADN objetivo se corte en
SOLUCIÓN ENCIMA
Invisible
MANCHA fragmentos más pequeños y se ejecute
bandas
en un gel de agarosa. Los fragmentos
se desnaturalizan químicamente
para formar hebras individuales y
permanecer conectado en lugares con secuencias casi idénticas; mientras que a baja temperatura, la sonda se luego se transfieren a una
unirá a ubicaciones con múltiples nucleótidos no coincidentes. Si la sonda es radiactiva, entonces la membrana membrana de nailon. Un radiactivo
se expone a una película fotográfica. Si la sonda está marcada con biotina o digoxigenina, la membrana puede sonda (también monocatenaria) se
tratarse con un sustrato quimioluminiscente para detectar la sonda marcada y el híbrido de ADN objetivo y incuba con la mem
luego exponerse a una película fotográfica. Las bandas oscuras de la película revelan las posiciones de brana a una temperatura que permite
que se formen híbridos (con
fragmentos con una secuencia similar a la de la sonda. Alternativamente, las marcas de biotina o digoxigenina
algunos desajustes). Cuando se
pueden visualizarse mediante tratamiento con un sustrato cromogénico. En este caso, se formarán bandas
coloca una película fotográfica sobre
azules directamente sobre la membrana en la posición de las secuencias relacionadas.
la parte superior de la membrana, la
ubicación de la radiación radiactiva
Se revelan moléculas híbridas.
Las transferencias Northern también se basan en la hibridación de ácidos nucleicos. La diferencia es que el ARN
es el objetivo de una transferencia Northern. La sonda para una transferencia Northern es un fragmento de un
gen o un oligonucleótido único, como en una transferencia Southern. El ARN diana suele ser el ARN mensajero.
En eucariotas, la detección del ARNm es más eficaz porque el ADN genómico tiene muchos intrones, que
pueden interferir con la unión de las sondas a la secuencia correcta. Además, el ARNm ya es monocatenario, por
lo que no es necesario tratar el gel de agarosa con un ácido fuerte. Al igual que una transferencia Southern, la
transferencia Northern comienza separando el ARNm por tamaño mediante electroforesis.
El ARNm se transfiere a una membrana de
nailon y se incuba con una sonda marcada ADNss o ARNm DOT 75
PUNTO FOTOGRÁFICO
monocatenaria. Como antes, la sonda se
MANCHA PELÍCULA
puede marcar con biotina, digoxigenina o
1 1
radiactividad. La membrana se procesa
2 2
y se expone a una película o sustrato
muestras
3 EXPONER 3
cromogénico.
SUMERGIRSE EN
en cada
INVESTIGACION A
fila 4 4
SOLUCIÓN PELÍCULA
Una variación de estas técnicas de
{ Diferente 5 5
hibridación es el dot blot.
(Figura 3.12). Aquí, la muestra objetivo no
está separada por tamaño. El objetivo de ADN Punto diferente
concentraciones de muestra
o ARNm simplemente se une a la membrana
de nailon como un pequeño punto. FIGURA 3.12 Punto
Mancha
Al igual que en las transferencias Southern, la muestra de ADN debe convertirse en monocatenaria
Las transferencias de puntos
antes de unirla a la membrana. Como antes, se permite que la membrana de transferencia puntual se hibride
comienzan colocando muestras de
con una sonda marcada. Las membranas se procesan y se exponen a una película. Si el punto de ADN o
ADN o ARN en una membrana de
ARNm contiene una secuencia similar a la sonda, la película se volverá negra en esa zona. Las nailon. A menudo, diferentes concentraciones de
transferencias de puntos son una forma rápida y sencilla de determinar si la muestra objetivo tiene una la muestra están punteadas una al
secuencia relacionada, antes de un análisis más detallado mediante transferencia Southern o Northern. lado de la otra. La membrana se
Otra ventaja de la transferencia de puntos es que se pueden procesar varias muestras en una cantidad menor incuba con un radiactivo.
de espacio. sonda y luego se exponen a una
película fotográfica. Muestras que
contienen ADN o ARN.
complementario a la sonda dejará una
Las transferencias Southern forman moléculas de ADN híbridas para determinar si una muestra de ADN tiene una secuencia homóloga a otra
mancha negra en la película.
sonda de ADN.
Las transferencias Northern determinan si una muestra de ARNm tiene una secuencia homóloga a una sonda de ADN. En grande
genomas, el uso de ARNm es más eficiente porque se eliminan todos los intrones.
FLUORESCENCIA EN SITUACIÓN HIBRIDACIÓN (PESCADO)

Las técnicas de hibridación discutidas anteriormente se basan en ADN o ARN purificado en un gel de
agarosa. En la hibridación fluorescente in situ (FISH), la sonda se hibrida directamente con el ADN o el
ARN dentro de la célula (fig. 3.13). Como se describió anteriormente, la sonda es un pequeño
segmento de ADN que ha sido marcado con etiquetas fluorescentes para poder visualizarse. El ADN o
ARN objetivo se encuentra dentro de la célula y requiere algún procesamiento especial. Las células diana
pueden ser secciones extremadamente delgadas de tejido de un organismo en particular. Por ejemplo,
cuando a una persona se le realiza una biopsia, se extrae un pequeño trozo de tejido para su análisis.
Este tejido se conserva y luego se corta en secciones extremadamente delgadas para analizarlas bajo
un microscopio. Estos se pueden utilizar para determinar la presencia de un gen con FISH. Otra fuente de
células diana para FISH son las células cultivadas de mamíferos o insectos (ver Capítulo 1). Además, la
sangre se puede aislar y procesar para aislar los glóbulos blancos. (Nota: los glóbulos rojos no contienen
núcleo y, por lo tanto, no contienen ADN). Los cromosomas de los glóbulos blancos se pueden aislar.
Sonda de ADN fluorescente
Padre Madre Niño (17p13.1 Del)

DESNATURALIZAR
Y
HIBRIDIZAR
Niño (17p13.1 Del)
76
A
sonda de ADN
etiqueta fluorescente
DESNATURALIZAR, VISTA POR
NÚCLEO NÚCLEO
MEZCLA, FLUORESCENCIA CR17: 7.515.000 7.520.000 7.525.000 7.530.000
Y MICROSCOPIO
Eliminaciones asociadas con retraso en el desarrollo.
CELÚLA RECOCER CELÚLA
B
TP53
Exón: 11 9 7 6 3 1
Eliminaciones asociadas con el cáncer de aparición temprana
C 5 kilos
FIGURA 3.13 Ubicación de genes en los cromosomas mediante FISH
(A) FISH puede localizar un gen en un lugar específico de un cromosoma. Primero, los cromosomas en metafase se aíslan y se fijan a un portaobjetos de microscopio. El ADN en
metafase se desnaturaliza en trozos monocatenarios que permanecen adheridos al portaobjetos. La sonda de ADN marcada fluorescentemente se hibrida con el gen
correspondiente. Cuando se ilumina el portaobjetos, las moléculas híbridas emiten fluorescencia y revelan la ubicación del gen de interés. (B) Una célula con ADN intacto en su
núcleo se trata para desnaturalizar el ADN en hebras individuales. La sonda de ADN marcada fluorescentemente se agrega y se hibrida con la secuencia correspondiente dentro
del núcleo. La molécula híbrida emitirá fluorescencia cuando la etiqueta fluorescente se excite con la longitud de onda de luz correcta e identifique la ubicación del gen en el
núcleo. (C) Un análisis de la estructura cromosómica utilizando sondas TP53 (roja) y 17ptel (verde). El ADN humano normal tiene dos copias de la región de ADN complementaria
de las sondas TP53 y 17ptel. (Nota: los cromosomas en metafase tienen cuatro copias porque el ADN se ha replicado). Los padres tienen una estructura de ADN normal para
estas dos secuencias de sonda. En comparación, el niño tiene sólo dos puntos rojos TP53 en un cromosoma y el otro cromosoma no tiene puntos rojos, lo que sugiere que esta
región de uno de los cromosomas del niño está eliminada. La eliminación es visible tanto en los cromosomas en metafase (arriba) como en los núcleos en interfase (abajo). De Shlien et al. (2010).
Un mecanismo molecular común subyace a dos síndromes de microdeleciones 17p13.1 fenotípicamente distintos. Soy J Hum Gen 87, 631–642.
Capítulo 3
y se dejó caer sobre un portaobjetos de vidrio. FISH se puede realizar en la interfase o en la metafase cro.
Mosomas.
Ya sea que el ADN objetivo provenga de sangre, de células cultivadas en placas o de secciones de tejido reales, las células
deben calentarse para que el ADN sea monocatenario. No es necesario calentar las muestras cuyo objetivo es el ARN. La
sonda marcada con fluorescencia se hibrida con secuencias complementarias del ADN o del ARN y, cuando las células se
iluminan con la longitud de onda adecuada, la ubicación de la sonda en el cromosoma se puede identificar mediante
fluorescencia.
FISH es una técnica en la que se incuba una sonda marcada con células cuyo ADN ha sido
desnaturalizado por calor. La sonda se hibrida con su secuencia homóloga en el cromosoma.
PROPIEDADES GENERALES DE LOS VECTORES DE CLONACIÓN
Los vectores de clonación son plásmidos especializados (u otros elementos genéticos) que contendrán cualquier fragmento
de ADN extraño para su posterior estudio o manipulación. El número y los tipos de plásmidos disponibles para la clonación han
aumentado. Además, ahora se utilizan otros elementos del ADN, incluidos virus y cromosomas artificiales. Una vez que un
fragmento de ADN se ha clonado e insertado en un vector adecuado, se pueden fabricar grandes cantidades de ADN, se puede
determinar la secuencia y cualquier gen del fragmento se puede expresar en otros organismos. Estudiar genes humanos en
humanos es prácticamente imposible debido a las ramificaciones éticas. Por el contrario, estudiar un gen humano
expresado en bacterias proporciona información útil que a menudo puede aplicarse a los humanos. La biotecnología moderna
depende de la capacidad de expresar genes extraños en organismos modelo. Antes de discutir cómo se clona un gen, se
consideran las propiedades de los vectores.
Rasgos útiles para la clonación de vectores 77
Aunque ahora existen muchos vectores especializados, las siguientes propiedades son convenientes y se encuentran en la
mayoría de los plásmidos de clonación generalizados modernos:
n Tamaño pequeño, lo que los hace fáciles de manipular una vez aislados
n Fácil de transferir de una célula a otra (normalmente mediante transformación)
n Fácil de aislar del organismo huésped
n Fácil de detectar y seleccionar
n Múltiples copias, lo que ayuda a obtener grandes cantidades de ADN.
n Sitios de restricción agrupados (polienlazador) para permitir la inserción de ADN clonado
n Método para detectar la presencia de ADN insertado (p. ej., complementación alfa)
La mayoría de los plásmidos bacterianos satisfacen los tres primeros requisitos. La siguiente característica clave de los vectores
de clonación es una forma sencilla de detectar su presencia en el organismo huésped. Los plásmidos de clonación bacteriana a
menudo tienen genes de resistencia a los antibióticos que hacen que las bacterias sean resistentes a determinados antibióticos.
Cuando se tratan con el antibiótico, sólo sobrevivirán las bacterias con el gen de resistencia codificado por el plásmido. Otras
bacterias morirán. Se han aprovechado otros rasgos para detectar plásmidos.
Los vectores derivados del plásmido 2μ de levadura a menudo portan genes para sintetizar aminoácidos esenciales, como la
leucina, que permiten que la levadura con mutaciones en la biosíntesis de leucina crezca en medios que carecen de leucina.
Los plásmidos varían en su número de copias. Algunos plásmidos existen en una o unas pocas copias en sus células huésped,
mientras que otros existen en múltiples copias. Estos plásmidos multicopia son en general más útiles ya que la cantidad de
ADN plasmídico es mayor, lo que los hace más fáciles de aislar y purificar. El tipo de origen de replicación controla el número
de copias, ya que esta región del plásmido determina con qué frecuencia la ADN polimerasa se une e induce la replicación.
La mayoría de los vectores de clonación tienen varios sitios de enzimas de restricción únicos. Por lo general, estos sitios se agrupan
en una ubicación llamada sitio de clonación múltiple (MCS) o polienlazador (fig. 3.14). Esto permite
FIGURA 3.14 Polienlazador Reconocimiento Reconocimiento Reconocimiento Reconocimiento investigadores abrir el vector de clonación

sitio para sitio para sitio para sitio para
típico o sitio de clonación en un sitio sin alterar ninguno de los genes
restricción restricción restricción restricción
múltiple de replicación del vector. Los fragmentos
enzima 1 enzima 3 enzima 5 enzima 7
Los sitios de las enzimas de
de ADN extraño se digieren con enzimas que
restricción dentro de la región del
coinciden con las del polienlazador. La
polienlazador son únicos. Esto
asegura que el plásmido sea
ligasa conecta el vector y el inserto. Se pueden
Reconocimiento Reconocimiento Reconocimiento
cortado solo una vez por cada enzima de restricción. sitio para sitio para sitio para agregar sitios de enzimas de restricción
restricción restricción restricción específicos utilizando cebadores de PCR u
enzima 2 enzima 4 enzima 6 oligómeros de ADN sintéticos (consulte el
Capítulo 4).
Algunos vectores tienen formas de detectar
si contienen o no un inserto. La forma
más sencilla de hacerlo es la inactivación
por inserción de un gen antibiótico (fig. 3.15A).
En este caso, el vector tiene dos genes
diferentes de resistencia a los antibióticos. El
ADN extraño se inserta en uno de los genes
resistentes a los antibióticos. Por tanto, la
bacteria huésped será resistente a un
antibiótico y sensible al otro.
plásmido
Alternativamente, se puede utilizar la
complementación alfa (ver figura 3.15B).
El vector tiene una porción corta de la
gen de la βgalactosidasa (el fragmento alfa) y el cromosoma bacteriano tiene el resto del gen.
Si ambos fragmentos de genes se transcriben y luego se traducen en proteínas, las proteínas parciales se combinan
78
para formar βgalactosidasa funcional. Si se inserta ADN en el segmento del gen transmitido por el plásmido, no se
produce la subunidad codificada y no se produce βgalactosidasa. Cuando se expresa la βgalactosidasa, las bacterias
pueden degradar Xgal, lo que hace que la colonia bacteriana se vuelva azul. Si se inserta un fragmento de ADN en el
gen del fragmento alfa, las bacterias no pueden dividir Xgal y permanecen blancas.
Una vez que se ha elegido un vector apropiado para el gen de interés u otro inserto, las dos piezas se ligan en una
construcción. El término construcción se refiere a cualquier molécula de ADN recombinante que haya sido
ensamblada mediante ingeniería genética. Si tanto el vector como el inserto se cortan con la misma enzima de
restricción, las dos piezas tienen extremos complementarios y sólo requieren ligasa para unirlos. Se utilizan trucos para
hacer compatibles dos fragmentos de ADN con extremos no relacionados. A veces, se sintetizan oligonucleótidos
cortos y se añaden a los extremos del inserto para hacerlos compatibles con el vector. Estos oligonucleótidos cortos se
denominan conectores y añaden uno o varios sitios nuevos de enzimas de restricción a los extremos de un
segmento de ADN. Además de añadir conectores, los extremos de los fragmentos de ADN pueden hacerse
compatibles con un sitio de multiclonación de vector mediante amplificación por PCR. Los cebadores pueden tener
extensiones de secuencia de ADN que contienen el sitio de reconocimiento para una enzima de restricción. Después
de la amplificación por PCR, el ADN se puede cortar con la enzima de restricción y ligar al vector (consulte el Capítulo 4
para mayor información).
Los vectores de clonación tienen múltiples sitios de clonación con muchos sitios únicos de enzimas de restricción, tienen genes de resistencia
a los antibióticos que hacen que la célula bacteriana pueda crecer con el antibiótico presente y tienen una manera de detectar cuando un
fragmento extraño de ADN está presente, como el alfa. complementación.
TIPOS ESPECÍFICOS DE VECTORES DE CLONACIÓN
Debido a que E. coli es el principal organismo huésped utilizado para manipular el ADN, la mayoría de los vectores
se basan en plásmidos o virus que pueden sobrevivir en E. coli o bacterias similares. La mayoría de los vectores tienen
Capítulo 3
INACTIVACIÓN INSERCIONAL FIGURA 3.15
Detección de insertos en
Antibiótico
plásmidos
gen de resistencia #1
(A) Inactivación por inserción.
Las células con un inserto se
LIGAR
vuelven sensibles al segundo
INSERTAR EN Vector
antibiótico. Las células sin
Vector ANTIBIÓTICO
más
RESISTENCIA inserto siguen siendo resistentes al
insertar
GEN #2 antibiótico. (B) Complementación
alfa. La complementación alfa
sitio de corte se refiere a la capacidad de
Antibiótico Insertar la βgalactosidasa de expresarse
gen de resistencia #2
como dos fragmentos de proteínas,
que se ensamblan para formar
CÉLULAS QUE LLEVAN EL VECTOR CÉLULAS QUE LLEVAN EL VECTOR
una proteína funcional.
SON RESISTENTES A CON INSERTAR SON
En las células sin un inserto en
AMBOS ANTIBIÓTICOS RESISTENTE A LA PRIMERA
A SÓLO ANTIBIÓTICO el plásmido, la βgalactosidasa está
activa y divide Xgal para
formar un tinte azul. En las
COMPLEMENTACIÓN ALFA células con un inserto, el
fragmento alfa no se produce y
la βgalactosidasa está inactiva.
Estas células permanecen blancas
plásmido Cromosoma plásmido Cromosoma en medios con Xgal.
aCz
yo minortemi
gramo
aCz
yo minortemi
gramo
lacZα es
lacZα
dividir
MCS
TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN 79
El fragmento α se combina con No hay fragmento α, por lo que βgal
resto de la proteína LacZ para esta inactivo
formar βgalactósido activo
La βgal se metaboliza La βgal no puede metabolizarse.
B Xgal para formar tinte azul Xgal y las bacterias permanecen blancas
Orígenes bacterianos de replicación y genes de resistencia a antibióticos. El polienlazador o sitio de
clonación múltiple suele colocarse entre las secuencias promotora y terminadora procariótica (fig.
3.16A). Algunos vectores también pueden proporcionar el sitio de unión al ribosoma, por lo que cualquier
secuencia codificante insertada se expresará como una proteína. Muchas otras características están
presentes en los vectores de clonación especializados. La siguiente discusión presentará algunas de las
diferentes categorías de vectores con sus características esenciales.
Muchos vectores de levadura se basan en el círculo de levadura de 2 μ. La versión nativa del círculo de 2μ se ha
modificado de diversas formas para utilizarlo como vector de clonación. Un vector lanzadera contiene orígenes de
replicación para dos organismos más cualquier otra secuencia necesaria para sobrevivir en cualquiera de los
organismos (consulte la figura 3.16B). Los vectores lanzadera que se basan en el plásmido de 2 μ tienen los
componentes necesarios para la supervivencia en levaduras y bacterias, además de resistencia a los antibióticos y un
polienlazador. La secuencia Cen es una secuencia de centrómero eucariótico (Cen) que mantiene el plásmido en la
ubicación correcta durante la mitosis y la meiosis en levaduras. Porque las células de levadura son eucariotas y también tienen una célula tan gruesa.
VECTOR BACTERIANO TÍPICO VECTOR DE LANZAMIENTO DE LEVADURA
MCS Bacteriano Origen y origen de la levadura

Bacteriano terminador de replicación
genes de replicación
promotor para bacterias
Antibiótico leucina
LacZα
resistencia biosíntesis
gene
gene gen para
CLONACIÓN LANZADERA selección en
PLASMIDO VECTOR levadura
Origen de la replicación centrómero de levadura
gen para (bacteriano) Clonación múltiple
A Resistencia antibiótica B sitio
secuencia
VECTOR DE REEMPLAZO DE LAMBDA
{
Integración y
recombinación
porque
att porque
0 10 20 30 40 48
kb kb
Cabeza y cola Región no esencial Regulación y
proteínas (puede ser reemplazado por ADN clonado) síntesis de ADN
C
COSMIDO CROMOSOMA ARTIFICIAL
inserto de ADN
AmpR
porque o yo porque
CS
METRO
Cmi
norte
50kb
SR
ENVASADO IN VITRO A
Plásmido circular
A forma voluntad
porque final metro
replicar en Levadura
80
pag
bacterias
oh seleccionable
Cola ri marcador
t miyo t mi
yo
Cabeza
forma lineal BamHI BamHI
INFECCIÓN DIGERIR CON BamHI
PARA LINEALIZAR
Bacteriano
De forma autónoma
cromosoma Bacteriano Múltiple
Circular replicando
origen de clonación
forma secuencia
porque replicación sitio
(origen de levadura)
Tel ori Amp ARS cen MCS Teléfono
Célula de E. coli
Telómero centrómero Seleccionable
secuencia marcador
Seleccionable
para levadura
marcador
YAC lineal
para bacterias
forma voluntad
D mi
replicar en levadura
FIGURA 3.16 Varios vectores de clonación
(A) Vector de clonación bacteriana típico. Este vector tiene secuencias bacterianas para iniciar la replicación y la transcripción. Además, tiene un sitio de clonación múltiple incrustado dentro del gen
lacZ α para que el inserto pueda identificarse mediante complementación alfa. El gen de resistencia a los antibióticos permite al investigador identificar cualquier célula de E. coli que tenga el plásmido.
(B) Vector lanzadera de levadura. Este vector puede sobrevivir en bacterias o levaduras porque tiene un origen de replicación tanto bacteriano como de levadura, un centrómero de levadura y marcadores
seleccionables para levaduras y bacterias. Como ocurre con la mayoría de los vectores de clonación, hay un polienlazador. (C) Vectores de reemplazo lambda. Debido a que el fago lambda es fácil de
cultivar y manipular, su genoma ha sido modificado para aceptar inserciones de ADN extraño. La región del genoma que se muestra en verde no es esencial para el crecimiento y empaquetado de lambda.
Esta región puede reemplazarse con grandes insertos de ADN extraño (hasta aproximadamente 23 kb). (D) Cósmidos. Los cósmidos son pequeños plásmidos multicopia que llevan sitios cos. Se linealizan
y se cortan de manera que cada mitad tenga un sitio cos (no se muestra). A continuación, se inserta ADN extraño para volver a unir las dos mitades del ADN cósmido. Esta construcción se empaqueta
en cabezas de virus lambda y se usa para infectar E. coli. (E) Cromosomas artificiales. Los cromosomas artificiales de levadura tienen dos formas: una forma circular para crecer en bacterias y una forma
lineal para crecer en levaduras. La forma circular se mantiene como cualquier otro plásmido en bacterias, pero la forma lineal debe tener secuencias de telómeros para mantenerse en levadura. La forma
lineal puede contener hasta 2000 kb de ADN clonado y es muy útil para la investigación genómica.
Capítulo 3
pared, la mayoría de los antibióticos no matan la levadura. Por tanto, se
λE (ámbar) λD (ámbar)
utiliza una estrategia diferente para detectar la presencia de plásmidos en
lisógeno lisógeno
levadura. Un gen para la síntesis de un aminoácido, como la leucina,
permite que crezcan cepas de levadura que requieren leucina. INDUCIR
λ LISIS
Los vectores bacteriófagos son genomas virales que han sido
modificados para que grandes trozos de ADN no viral puedan
Cruz Cruz
empaquetarse en la partícula viral. Los bacteriófagos lambda tienen genomas Proteínas de ensamblaje Proteínas de ensamblaje
lineales con dos extremos cohesivos: secuencias cos (extremos cohesivos Proteína D Proteína E
lambda). Estos son extremos adhesivos superpuestos de 12 bases.
Sin precabezas Sin precabezas
Cuando están dentro de la capa del virus, los extremos cohesivos (por falta de E) (por falta de D)
están recubiertos con proteína para evitar que se hibriden. Después de
que lambda se une a E. coli, inserta solo el ADN lineal. Las proteínas que ADN lambda
protegen los extremos cohesivos se pierden y el genoma circula con la con inserto
ayuda de la ADN ligasa. La forma circular es la forma replicativa (RF) y MEZCLA
se replica mediante el mecanismo del círculo rodante (ver Capítulo 4). La
expresión de varios genes lambda produce proteínas que se ensamblan
formando cubiertas proteicas. ENVASADO EXITOSO
Cada capa está empaquetada con un genoma y, después de que muchos
de ellos se ensamblan, el huésped de E. coli explota y libera el nuevo
bacteriófago para infectar otras células.
El bacteriófago lambda es un vector de clonación ampliamente utilizado Cabeza
(v . fig. 3.16C). Se eliminó el segmento medio del genoma lambda y se
agregó un polienlazador. Se puede ligar un inserto de 37 a 52 kb en
el polienlazador y empaquetarlo en partículas virales. Trabajar con el
ADN del bacteriófago sin matar toda la E. coli
Cola 81
En un cultivo, el investigador elimina uno o más genes necesarios para el
empaquetado. Cuando el investigador quiere formar bacteriófagos
completamente empaquetados, cubrir las proteínas del virus auxiliar.
se puede agregar (Fig. 3.17). Los virus auxiliares no contienen ADN FIGURA 3.17 In vitro
extraño, sino que aportan los genes faltantes para las proteínas de la cubierta. Debido a que las proteínas de cubierta embalaje
Un vector de clonación
se autoensamblan in vitro, los lisados auxiliares se mezclan con ADN lambda recombinante y se producen partículas
lambda que contiene ADN clonado
virales completas que contienen ADN. Esto se conoce como envasado in vitro .
debe empaquetarse en una
cabeza de fago antes de que
Los vectores cósmidos pueden contener fragmentos de ADN de hasta 45 kb de longitud (consulte la figura 3.16D).
pueda infectar a E. coli. Primero,
Estos son vectores lambda altamente modificados con todas las secuencias entre los sitios cos eliminadas y
un cultivo de células de E. coli se
reemplazadas con el inserto. El ADN de interés se liga entre los dos sitios cos utilizando enzimas de restricción y ligasa.
infecta con un mutante lambda
Esta construcción se empaqueta en una partícula lambda producida por un fago auxiliar (ver Fig. 3.17) y luego se
que carece del gen para una de
usa para infectar E. coli. las proteínas de la cabeza llamada
E. Un cultivo diferente de E. coli
Los cromosomas artificiales contienen los fragmentos más grandes de ADN (consulte la figura 3.16E). Estos incluyen
se infecta con un mutante
cromosomas artificiales de levadura (YAC), cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas artificiales de
diferente, que carece de la
bacteriófagos P1 (PAC). Se utilizan para contener longitudes de ADN de 150 kb a 2000 kb. Los YAC contienen la mayor proteína de la cabeza del fago
cantidad de ADN, hasta aproximadamente 2000 kb. Los YAC tienen centrómeros y telómeros de levadura para el D. Se induce la lisis de los dos
mantenimiento en la levadura. Los BAC pueden circularizarse y cultivarse en bacterias; por tanto, tienen un origen cultivos, lo que libera las colas,
bacteriano de replicación y genes de resistencia a antibióticos. las proteínas de ensamblaje y las
proteínas de la cabeza,
pero no las cabezas completas
debido a la falta de proteínas.
La investigación biotecnológica dispone de muchos vectores de clonación diferentes. Los genes más pequeños se estudian utilizando
Cuando estos se mezclan con
plásmidos bacterianos o vectores lanzadera, mientras que los genes más grandes se estudian en vectores de bacteriófagos, cósmidos y un vector de reemplazo lambda,
cromosomas artificiales. los tres forman
Los vectores lanzadera tienen secuencias que les permiten sobrevivir en dos organismos diferentes, como la levadura. espontáneamente partículas virales completas que contie
y bacterias. Luego se utilizan para infectar
E. coli.
OBTENER GENES CLONADOS EN BACTERIAS MEDIANTE TRANSFORMACIÓN
Una vez que el gen de interés se clona en un vector, la construcción se puede volver a colocar en una célula bacteriana
mediante un proceso llamado transformación (Fig. 3.18) (ver Cuadro 3.2). En este caso, la construcción de ADN
se mezcla con células competentes de E. coli . Para que las células sean competentes, es decir, capaces de absorber
ADN, la pared celular debe abrirse temporalmente. Las células de E. coli se mezclan con iones de calcio en hielo y
luego se someten a una temperatura más alta, como 42 °C, durante unos minutos, lo que desestabiliza la
membrana y la pared celular. La mayoría de las células mueren durante el tratamiento, pero algunas sobreviven y
absorben el ADN. Otro método para hacer que las células de E. coli sean competentes es exponerlas a una descarga de alto voltaje.
La electroporación abre la pared celular, permitiendo la entrada del ADN. Este método es mucho más rápido y versátil.
La electroporación se utiliza para otros tipos de bacterias además de levaduras.
Las bacterias pueden tener diferentes plásmidos, pero deben tener diferentes orígenes de replicación. Si existen dos
plásmidos diferentes con el mismo origen de replicación, uno de los dos se perderá durante la replicación bacteriana.
Por ejemplo, si los genes A y B se clonan en el mismo tipo de vector y ambos genes clonados entran en la misma
célula bacteriana, la bacteria perderá un plásmido y conservará el otro. Esto se debe a la incompatibilidad de plásmidos,
que impide que una célula bacteriana albergue dos plásmidos del mismo tipo. La incompatibilidad surge de conflictos
entre dos plásmidos con orígenes de replicación idénticos o relacionados. Sólo uno puede replicarse en una celda
determinada. Si un investigador quiere que una célula tenga dos genes clonados, entonces se podrían utilizar dos tipos
diferentes de plásmidos, o se podrían poner ambos genes en el mismo plásmido.
Cuadro 3.2 Descubrimiento del ADN recombinante
En 1972, dos investigadores se reunieron en una conferencia en Hawaii para discutir los se fragmenta en un pequeño plásmido de E. coli. Este fue el primer ADN recombinante
plásmidos, los pequeños anillos de ADN extracromosómico que se encuentran en las bacterias. creado. Finalmente, transformaron el plásmido modificado nuevamente en E. coli. Las
Herbert W. Boyer, PhD, era miembro de la facultad de la Universidad de California, San células expresaban tanto los genes plasmídicos normales como los insertados artificialmente
Diego, y estaba estudiando enzimas de restricción y modificación. Acababa de presentar su en el plásmido. Esto desató la revolución en la ingeniería genética y, desde entonces, todos
82
investigación sobre EcoRI. Stanley N. los laboratorios de biotecnología han utilizado alguna variación de su técnica. Boyer y
Cohen, MD, era miembro de la facultad de Stanford y estaba interesado en cómo los Cohen solicitaron una patente sobre tecnología de ADN recombinante. De hecho, Boyer
plásmidos podían conferir resistencia a diferentes antibióticos. Su laboratorio perfeccionó la cofundó Genentech con Robert Swanson, un capitalista de riesgo.
transformación de laboratorio de Escherichia coli utilizando cloruro de calcio para
permeabilizar las células. Después de que terminaron las conversaciones, los dos se reunieron. Genentech es una de las primeras empresas de biotecnología de Estados Unidos y, bajo la
sobre sándwiches de carne en conserva y combinaron sus dos ideas. dirección de Boyer y Swanson, la empresa produjo
Aislaron diferentes fragmentos de ADN de animales, otras bacterias y virus y, utilizando somatostatina humana en E. coli.
enzimas de restricción, ligaron los
DESTRUIR CELDA AÑADIR ADN A
CELDA RECEPTORA RECOMBINACIÓN
Y PURIFICAR EL ADN
Cromosoma
ORIGINAL FRAGMENTOS TRANSFORMADO RECOMBINANTE

CÉLULA BACTERIANA DE ADN CELÚLA CELÚLA
FIGURA 3.18 Transformación
Las células bacterianas pueden absorber ADN, como plásmidos recombinantes, mediante incubación con iones metálicos como Ca++ en hielo. Esto desestabiliza la pared celular bacteriana
y, después de un breve choque térmico, algunas de las bacterias absorben el ADN o el plásmido. Si el ADN se integra en el cromosoma, la célula recombinante expresará cualquier gen que se
encuentre en el ADN. Una célula bacteriana también puede absorber plásmidos completos, que existen como elementos extracromosómicos con su propio origen de replicación.
Capítulo 3
sitio de corte FIGURA 3.19 Creación de
una biblioteca de ADN
El ADN genómico del organismo
elegido primero se digiere
DIGESTIÓN PARCIAL parcialmente con una enzima
CON 4 BASE ESPECÍFICAS
de restricción que reconoce
ENZIMA RESTRICTIVA
una secuencia de cuatro pares de bases.
Se prefieren las digestiones
Mezcla de fragmentos, parciales porque algunos de los
algunos
sitios de las enzimas de
todavía con sitios cortados
restricción no se cortan y se
generan fragmentos más
grandes. Si cada sitio de
reconocimiento fuera cortado por
la enzima de restricción, entonces
FRAGMENTOS DE CLON
el ADN genómico no contendría muchos genes completos
EN VECTOR plásmido
Los fragmentos genómicos se
vector
clonan en un vector apropiado
y se transforman y mantienen en
bacterias.
TRANSFORMAR PLASMIDOS
EN BACTERIAS
83
Colonias bacterianas
cada uno lleva
diferente
fragmento clonado
de ADN
CONSTRUYENDO UNA BIBLIOTECA DE GENES
Las bibliotecas de genes se utilizan para encontrar nuevos genes, secuenciar genomas completos y comparar genes de
diferentes organismos (fig. 3.19). Las bibliotecas de genes se crean cuando todo el ADN de un organismo en particular se
digiere en fragmentos usando enzimas de restricción, y luego cada uno de los fragmentos se clona en un vector y se
transforma en un huésped apropiado.
Los pasos básicos utilizados para construir una biblioteca son los siguientes:
1. Aislar el ADN cromosómico de un organismo, como E. coli, levadura o humanos.
2. Digerir el ADN con una o dos enzimas de restricción diferentes.
3. Linealizar un vector de clonación adecuado con sitios de enzima(s) de restricción compatibles.
4. Mezclar los fragmentos de cromosomas cortados con el vector linealizado y ligar.
5. Transforme esta mezcla en E. coli.
6. Aislar una gran cantidad de transformantes de E. coli .
El tipo de enzima de restricción afecta el tipo de biblioteca. Debido a que los sitios de restricción no están espaciados
uniformemente en el genoma, algunas inserciones serán grandes y otras pequeñas. El uso de una enzima de restricción que
reconoce sólo cuatro pares de bases dará como resultado una mezcla de fragmentos en su mayoría pequeños, mientras
que una enzima de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento de seis u ocho pares de bases generará
fragmentos más grandes. (Tenga en cuenta que es más probable encontrar una secuencia particular de cuatro pares de bases en un genoma
que encontrar una secuencia de seis pares de bases.) Incluso si se usa una enzima que reconoce una
secuencia de reconocimiento de cuatro pares de bases para digerir el genoma completo, estos sitios no están
igualmente espaciados en todo el genoma de un organismo. El genoma digerido contendrá algunos segmentos
demasiado grandes para ser clonados y otros demasiado pequeños. Para evitar cortar trozos demasiado pequeños,
se suele utilizar la digestión parcial. A la enzima se le permite cortar el ADN sólo durante un breve periodo de
tiempo y muchos de los sitios de las enzimas de restricción no se cortan, dejando trozos más grandes para la
biblioteca. Además, es habitual construir otra biblioteca usando una enzima de restricción diferente.
Las bibliotecas de genes se utilizan para muchos propósitos porque contienen casi el genoma completo de un organismo en
particular.
CRIBADO DE LA BIBLIOTECA DE GENES POR HIBRIDACIÓN
Una vez reunida la biblioteca, los investigadores suelen querer identificar un gen o segmento de ADN en particular
dentro de la biblioteca. A veces, el gen de interés es similar a uno de otro organismo. A veces, el gen de
interés contiene una secuencia particular. Por ejemplo, muchas enzimas utilizan ATP para proporcionar energía.
Las enzimas que se unen al ATP comparten una secuencia característica común, ya sea que provengan
de bacterias o de humanos. Esta secuencia se puede utilizar para encontrar otras enzimas que se unan al
ATP. Estos motivos de secuencia comunes también pueden sugerir que una proteína se unirá a varios cofactores,
otras proteínas y ADN, por nombrar algunos ejemplos.
La detección de bibliotecas de ADN mediante hibridación requiere preparar el ADN de la biblioteca y preparar la
sonda marcada. Una biblioteca de genes se almacena como un cultivo bacteriano de células de E. coli , cada
una de las cuales tiene un plásmido con un inserto diferente. El cultivo se cultiva, se diluye y se siembra en
muchas placas de agar diferentes para que las colonias queden espaciadas entre sí. Las colonias se transfieren
a un filtro de nailon y el ADN de cada colonia se libera de las células lisis con detergente. Los componentes
84 celulares se enjuagan de los filtros.
FIGURA 3.20
Detección de una biblioteca con
Colonias bacterianas El ADN se adhiere a la membrana de nailon y luego
sonda de ADN
en agar cada uno lleva se desnaturaliza para formar hebras individuales (fig.
En primer lugar, las colonias un fragmento clonado
bacterianas que contienen los insertos de ADN 3.20).
de la biblioteca se cultivan y se
Si un científico busca un gen particular en el organismo
colocan en placas grandes y
objetivo, la sonda de la biblioteca puede ser el gen
poco profundas llenas de
agar. Se siembran en placas
correspondiente de un organismo relacionado. La sonda
TRANSFERIR A
muchas colonias diferentes para suele ser sólo un segmento del gen porque una pieza
MEMBRANA O FILTRO
que cada fragmento de ADN más pequeña es más fácil de manipular. A
clonado esté presente. Estas continuación, el ADN sonda se sintetiza y se marca
colonias se transfieren a filtros de
con radiactividad o con quimioluminiscencia. El ADN de
nailon y se abren mediante lisis. Se lavan los restos celulares.
la sonda monocatenaria se mezcla con el ADN de la
lejos, mientras que el ADN
biblioteca en los filtros de nailon. La sonda se hibrida
genómico y plasmídico se adhiere
al nailon. Las secuencias se
con secuencias coincidentes en la biblioteca. El nivel
obtienen como monocatenarias de coincidencia necesario para la unión se puede ajustar
incubando los filtros en una base incubando a varias temperaturas. Cuanto mayor sea la
fuerte. Cuando estos se incuban con LISIS DE CÉLULAS BACTERIANAS temperatura, más estrictas deben ser las secuencias, es
un radiactivo Y DESNATURACIÓN DEL ADN
decir, más parecidas deben ser.
sonda monocatenaria a la temperatura
adecuada, la sonda se hibrida
AÑADIR SONDA DE ADN ETIQUETADA Cuanto más baja es la temperatura, menos estricta. Si la
con cualquier secuencia coincidente.
sonda está marcada con radiactividad, la película
fotográfica se volverá negra donde la sonda y el ADN
La sonda se une al ADN
de la biblioteca se hibridaron. La mancha negra está
de colonias con
secuencias coincidentes alineada con la colonia bacteriana original. Por lo general,
la colonia más probable y sus vecinas se seleccionan,
cultivan, siembran y vuelven a examinar con
Capítulo 3
la misma sonda para asegurar que se aísle un único transformante. Luego, el ADN de este aislado se puede
analizar mediante secuenciación (consulte el Capítulo 4).
La selección de una biblioteca consta de dos partes. Primero, los clones de la biblioteca que crecen en E. coli se unen a filtros de
nailon y los componentes celulares se lavan y luego se desnaturalizan para formar fragmentos de ADN monocatenario.
En segundo lugar, se marca una sonda con radiactividad, se calienta para fundir la hélice en hebras individuales y finalmente se
añade a las membranas de nailon donde se hibrida con su secuencia correspondiente.
BIBLIOTECAS DE EXPRESIÓN EUCARIÓTICA
En las bibliotecas de expresión, el vector
tiene secuencias necesarias para la FIGURA 3.21
transcripción y traducción del inserto. CÉLULAS LISADAS AAAAA Creación de una biblioteca
Esto significa que el ADN insertado se AAAAA
de ADNc a partir de
EXTRACTO & ARNm eucariota
expresa como ARN y luego se traduce en PURIFICAR ARNm AAAAA
En primer lugar, se lisan las
una proteína. En esencia, una biblioteca de eucariota mezcla de ARNm
células eucariotas y se
células
expresión genera una proteína a partir de purifica el ARNm. A continuación,
LA TRANSCRIPTASA INVERSA
cada inserto clonado, ya sea un gen real o se añaden la transcriptasa inversa
USO DEL PRIMER OLIGO(dT)
no. más cebadores que contienen
Cuando se estudia el ADN eucariótico, se tramos oligo(dT). El oligo(dT)
se hibrida con la adenina en la cola
construyen bibliotecas de expresión utilizando
5 AAAAAA 3 ARNm/ADNc poli(A) del ARNm y actúa como
ADN complementario (ADNc) para
3 5
TTTTTT Heterodúplex cebador para la transcriptasa
ayudar a garantizar que el inserto sea
inversa. Esta enzima produce la
realmente un gen. El ADN eucariótico, RIBONUCLEASA H cadena de ADN complementaria,
especialmente en plantas y animales formando un heterodúplex de
superiores, es en gran medida no ARNm/ADNc.
Monocatenario
3 TTTTTT 5
codificante, con regiones codificantes muy ADNc La cadena de ARNm se digiere con
85
ribonucleasa H y se agrega
espaciadas. Incluso los genes están
interrumpidos por intrones no codificantes. 1) ADN POLIMERASA I ADN polimerasa I para sintetizar
la cadena de ADN opuesta,
El ADNc es una copia de ADN bicatenario del 2) NUCLEASA S1 creando así ADNc de doble
ARNm. El ADNc se produce mediante la cadena. A continuación, se añade la
transcriptasa inversa, una enzima nucleasa S1 para recortar los
5 AAAAAA 3 Doble cadena
identificada por primera vez en los retrovirus 3 TTTTTT 5 ADNc extremos monocatenarios y se
(consulte el Capítulo 1). Se utiliza en la añaden conectores a los extremos
del ADNbc.
investigación de eucariotas para eliminar ENLACEADORES DE LIGADAS sitio de corte
Los conectores tienen sitios de
los intrones y generar una versión de CON SITIO DE CORTE
enzimas de restricción convenientes
un gen que consta únicamente de una secuencia codificante ininterrumpida.
para la clonación en un vector de
Enlazador
expresión.
Por el contrario, las bacterias tienen muy
poco ADN no codificante y sus genes no son
AAAAAA
interrumpidos por intrones; por lo tanto, el TTTTTT
ADN genómico se puede utilizar
directamente en bibliotecas de expresión. DIGERIR CON
sitio de corte
ENZIMA RESTRICTIVA
El ADN eucariótico primero se transforma
en ADNc para construir una biblioteca
de expresión (fig. 3.21). Para producir
AAAAAA
ADNc, el ARN mensajero se aísla del TTTTTT
organismo de interés uniéndolo a una
extremo pegajoso
columna que contiene poli(T) (es decir,
una cadena de ADN que consta de LIGAR EN VECTOR
minas repetidas). Esto aísla solo el ARNm
porque el poli(T) se hibrida con la cola
poli(A) del ARNm eucariota.
FIGURA 3.22 Inmu El ARNm se convierte en ADNc mediante la
Detección nológica de una transcriptasa inversa, que sintetiza un ADN
metro
METRO Proteína
expresión mi
atado
complementario al ARNm. Luego, una enzima elimina
Biblioteca
la parte de ARNm del heterodúplex de ARNm/
ar b
a la membrana
minorte
Bacterias que expresan extraños.
ADNc y la ADN polimerasa produce la segunda
Los genes se cultivan en
una placa de agar, se
hebra de ADN (consulte la figura 3.21). El producto
transfieren a una membrana y se lisan. final es una copia de ADN bicatenario de la secuencia
Las proteínas liberadas están de ARNm.
AÑADIR ANTICUERPO
unidas a la membrana. Esta figura
ESPECÍFICO PARA LA PROTEÍNA OBJETIVO
muestra sólo una proteína
unida, aunque en realidad están
metro Luego, el ADNc se liga a un vector de expresión con
presentes muchas proteínas METRO secuencias que inician la transcripción y traducción del
mi
diferentes. Estos incluyen tanto inserto. En algunos casos, el inserto tendrá su
ar b
minorte
clones de biblioteca propio sitio de inicio de traducción (por ejemplo, un
expresados como proteínas
ADNc completo). Si el encarte no contiene un
bacterianas. La membrana se incuba Anticuerpo proteico 1
inicio de traducción, entonces el marco de lectura
con un anticuerpo primario
que se une sólo a la proteína
se convierte en un problema.
de interés. Para detectar esto Debido a que el código genético es triplete, cada inserto
complejo proteína:anticuerpo, AGREGUE EL SEGUNDO ANTICUERPO QUE se puede traducir en tres marcos de lectura
se añade un segundo SE UNE EL PRIMER ANTICUERPO diferentes. Se puede producir una proteína para los
anticuerpo con un sistema de tres marcos de lectura, pero sólo un marco
detección como la fosfatasa
Detección producirá realmente la proteína correcta.
alcalina. La colonia bacteriana
metro
METRO sistema Para garantizar la obtención de inserciones con el

que expresa la proteína de
marco de lectura correcto, cada ADNc se clona en
mi
interés se volverá azul cuando
opreucitnA
ar b
los tres marcos de lectura mediante el uso de
minorte
Se añade XPhos. Esto permite
el vector con la correcta enlazadores con varios sitios de restricción diferentes.
Proteína Anticuerpo 1
inserto para aislar. Por lo tanto, aumenta el número de transformantes
86
Anticuerpo
2 para detectar una proteína de interés.
Detección
Los genes clonados se transforman en bacterias
sistema
que expresan el ADN extraño.
Las bacterias se cultivan en agar y luego las
colonias se transfieren a una membrana de nailon
y se lisan. Las proteínas liberadas se unen a las membranas de nailon y se filtran de diversas formas. Con mayor
frecuencia se utiliza un anticuerpo contra la proteína de interés (consulte el Capítulo 6). Este reconoce la proteína
y puede identificarse mediante un anticuerpo secundario que se conjuga con un sistema de detección. Normalmente,
la fosfatasa alcalina se conjuga con el anticuerpo secundario. Se puede identificar todo el complejo porque la fosfatasa
alcalina escinde XPhos, dejando un color azul donde la colonia bacteriana expresa la proteína correcta (fig. 3.22).
E. coli no puede realizar la mayoría de las modificaciones postraduccionales que suelen sufrir las proteínas
eucariotas. Por tanto, las proteínas no siempre se encuentran en su forma nativa. No obstante, los anticuerpos
apropiados pueden detectar la mayoría de las proteínas de interés.
El ADN complementario o ADNc se construye aislando el ARNm y haciendo una copia del ADN con transcriptasa inversa.
Las bibliotecas de expresión expresan el inserto de ADN extraño como una proteína porque los vectores de expresión contienen
secuencias tanto para la transcripción como para la traducción. La proteína de interés se identifica incubando la biblioteca con un anticuerpo
contra la proteína de interés.
CARACTERÍSTICAS DE LOS VECTORES DE EXPRESIÓN
Debido a que la proteína extraña puede ser tóxica para E. coli, especialmente si se produce en grandes cantidades,
el promotor utilizado para expresar el gen extraño es fundamental. Si se produce demasiada proteína extraña, la
célula huésped puede morir. Para controlar la producción de proteínas, los vectores de expresión tienen promotores con
Capítulo 3
interruptores de encendido/apagado; por FIGURA 3.23
lo tanto, se permite que la célula huésped Los vectores de expresión
Transcripción
crezca y luego, después de que se Sitios de clonación tienen promotores
mi d mi norte mi terminadores
C oh estrictamente regulados
gramo
yo norte
produzcan cantidades suficientes de Laca UV
promotor Un vector de expresión
bacterias, se activa el gen interesado.
contiene secuencias cadena
Un promotor comúnmente utilizado es una arriba del gen clonado que
versión mutante del promotor lac , controlan la transcripción
lacUV, que provoca un nivel muy alto y traducción del gen clonado.
EXPRESIÓN
de transcripción, pero sólo en condiciones VECTOR El vector de expresión
que se muestra utiliza el
inducidas (fig. 3.23). Tiene los siguientes
elementos: un sitio de unión para la ARN
polimerasa, un sitio de unión para la metro
A
r pag
I Ca
promotor lacUV, que es
muy fuerte, pero
inducible. Para estimular
proteína represora LacI y un sitio de l la transcripción se añade el
inicio de la transcripción. El vector tiene inductor artificial IPTG. IPTG
fuertes sitios de parada de la transcripción se une a la proteína represora
aguas abajo de la región del LacI, que luego se
polienlazador. El vector también tiene el desprende del ADN. Esto
permite que la ARN polimerasa
gen LacI, de modo que se producen altos niveles de proteína represora, manteniendo así reprimidos los
transcriba el gen. Antes de
genes clonados. Como todos los vectores, existe un origen de replicación y un gen de resistencia a los
agregar IPTG, el represor
antibióticos para la selección en las bacterias. Cuando se clona una biblioteca de genes detrás de este LacI previene la expresión del gen clonado.
promotor, los genes no se expresan debido a los altos niveles del represor LacI. Cuando se agrega un inductor,
como IPTG, se libera LacI del ADN y la ARN polimerasa transcribe el gen clonado.
Otro promotor común en los vectores de expresión es el promotor izquierdo lambda o PL. Tiene un sitio
de unión para el represor lambda. El gen de interés o fragmento de biblioteca no se expresa a menos que
se elimine el represor. En lugar de utilizar su inductor natural, se ha aislado una versión mutante del represor
que libera su sitio de unión a altas temperaturas.
Entonces, cuando el cultivo se cambia a 42°C, el represor se desprende del ADN y la ARN polimerasa transcribe 87
los genes clonados.
Otro sistema de expresión utiliza un promotor cuyo sitio de unión a la ARN polimerasa reconoce únicamente
la ARN polimerasa del bacteriófago T7. La ARN polimerasa bacteriana no transcribirá el gen de interés.
Este sistema está diseñado para funcionar sólo en bacterias que tienen el gen de la ARN polimerasa T7
integrado en el cromosoma y bajo el control de un promotor inducible.
Algunos vectores de expresión contienen un pequeño segmento de ADN que codifica una etiqueta proteica. Se
utilizan principalmente cuando el gen de interés ya está clonado, en lugar de para la detección de bibliotecas.
El gen de interés debe clonarse en marco con el ADN de la etiqueta proteica. La etiqueta puede ser de muchas
variedades, pero las etiquetas 6HIS, Myc y FLAG® son tres formas populares (Fig. 3.24).
6HIS es un tramo de seis residuos de histidina colocados al principio o al final de la proteína de interés. Las
histidinas se unen fuertemente al níquel. Esto permite aislar la proteína marcada uniéndola a una columna
con níquel adherido. Myc y FLAG® son epítopos que permiten purificar la proteína expresada uniéndose al
anticuerpo correspondiente. Los anticuerpos pueden unirse a una columna, usarse para una transferencia
Western o verse in vivo tiñendo las células con versiones marcadas con fluorescencia de los anticuerpos
Myc o FLAG®. (La etiqueta de histidina también se puede reconocer con un anticuerpo específico, si se
desea).
La característica más importante de los vectores de expresión es una región promotora estrechamente controlada. Las proteínas
de la biblioteca de expresión se expresan sólo bajo ciertas condiciones, como la presencia de un inductor, la eliminación de un
represor o un cambio de temperatura.
Se pueden fusionar pequeñas etiquetas en la proteína de interés utilizando vectores de expresión. Estas etiquetas permiten
proteína de interés para ser aislada y purificada.
FIGURA 3.24 Uso de 6SU ETIQUETA
etiquetas para aislar C oh
yo norte mi d gramo
mi mi
norte
proteínas 6 his t mir

i
metro
atohr
rublos
t mi norte
Algunos vectores de expresión oh
metro
r oh
tienen secuencias de ADN que
PAG
SuSuSuSuSuSuSuSu
codifican etiquetas proteicas cortas.
La etiqueta 6HIS (A) codifica seis
residuos de histidina. Cuando se TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN
fusiona en marco con la
secuencia codificante del gen
clonado, la etiqueta se fusiona con
la proteína. La etiqueta 6HIS se 6su
une específicamente a los iones
de níquel; por lo tanto, la unión a
una columna de iones de níquel
aísla las proteínas marcadas con 6HIS.
Además, también se pueden utilizar
anticuerpos contra la etiqueta 6HIS
para aislar las proteínas marcadas.
Otras etiquetas, como Myc o Se une al anticuerpo 6His
FLAG® (B), son epítopos de
A o se une a una columna de níquel
anticuerpos específicos que
funcionan de manera similar. Las
ETIQUETA MYC O BANDERA
proteínas marcadas con Myc o
FLAG® se pueden aislar o
C oh yo norte mi d gramo
mi mi
norte
C oh
yo norte mi d gramo
mi mi
norte
identificar uniéndose a anticuerpos yC t mir Fl A t mir

GRAMO
METRO
mir mir
metro
i i
metro
contra Myc o FLAG®, respectivamente. oh t atohr
norte
oh t atohr
norte
rmetro r metro
oh
PAG oh
PAG
TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN
88
Mi c BANDERA
Anticuerpo contra Myc utilizado para detectar Anticuerpo contra FLAG utilizado para detectar
B
proteína expresada proteína expresada
LA RECOMBINACIÓN AUMENTA LA VELOCIDAD DE CLONACIÓN DE GENES
Ensamblar nuevos vectores de ADN con diferentes genes de interés puede resultar difícil cuando el gen es
largo, ya que puede resultar difícil identificar enzimas de restricción únicas compatibles con un polienlazador
que no se corten dentro del gen. Se pueden crear grandes vectores de ADN recombinante mediante recombinación
homóloga, un proceso llamado recombinación (fig. 3.25).
Para facilitar la recombinación, las enzimas del fago lambda llamado RED están diseñadas para ser expresadas
por una cepa de bacteria huésped específica. Reconocen secuencias homólogas y las recombinan para formar
una sola molécula. Estas proteínas son tan eficientes que tan sólo una región de homología de 45 pares
de bases es suficiente para iniciar la recombinación. En la práctica, E. coli tiene los genes de las proteínas
RED bajo el control de un promotor inducible por calor. El gen de interés se electropora en bacterias que tienen
las proteínas lambda RED activas en el citoplasma. Reconocen los extremos del gen de interés y encuentran
sus secuencias homólogas. En esta figura, las secuencias homólogas se encuentran en el BAC, o cromosoma
artificial bacteriano. Las enzimas rompen el BAC en el momento apropiado.
Capítulo 3
GEN DE INTERÉS
Secuencia Gene Secuencia

de 30 a 50 de 30 a 50
pb homóloga a pb homóloga a
BAC BAC
ELECTROPORAR PARA OBTENER GEN
FRAGMENTO EN BACTERIAS
Cromosoma de E. coli
Gen de la recombinasa
λ RED λ ROJO
Promotor sensible
a la temperatura
Cromosoma artificial
bacteriano (BAC)
Gen de interés
Secuencia homóloga a los
extremos del gen
de interés.
λ ROJO
89
bachillerato
λ PROTEÍNAS ROJAS
INTEGRAR FRAGMENTO
Crecer a 32°C
BAC recombinado
para detener la
producción de proteína ROJA
FIGURA 3.25 Recombinación Un gen de
interés está flanqueado por secuencias homólogas al BAC. Una vez dentro de la bacteria, las proteínas RED reconocen los
extremos del gen de interés y facilitan la recombinación homóloga entre el BAC y el gen de interés. Las proteínas RED se
producen sólo cuando las bacterias se exponen a altas temperaturas, ya que sus genes están controlados por un promotor inducible por calor.
ubicación y agregue el gen de interés. El BAC diseñado se elimina de esta cepa de E. coli para evitar que
las proteínas RED residuales inicien una mayor recombinación.
Identificar qué E. coli tiene el gen de interés es diferente para la recombinación porque las bacterias
tienen el vector independientemente de si el inserto se recombina o no. En lugar de utilizar un esquema
de selección positiva, como la resistencia a los antibióticos, se utiliza un esquema de selección/
contraselección para identificar el vector recombinado que contiene el gen de interés (fig. 3.26). Primero,
el vector contiene un gen para galK, o galactosa quinasa, un gen esencial para el crecimiento en galactosa.
Las bacterias producen galactosa quinasa y pueden crecer en medios mínimos que contengan solo
galactosa como fuente de carbono. La proteína GalK también convierte la 2desoxigalactosa (2DOG)
en una sustancia tóxica, por lo que las bacterias que expresan GalK mueren cuando se cultivan en 2DOG.
Después de que ocurre la reacción de recombinación, las bacterias se colocan en placas en medios
mínimos que contienen solo 2desoxigalactosa. Si alguna bacteria todavía tiene galK, la galactosa quinasa
crea una toxina a partir de 2desoxigalactosa y la bacteria muere. Cuando galK se reemplaza con el gen
de interés, no se produce toxina y las bacterias crecen.
FIGURA 3.26 Selección REGIONES DE HOMOLOGÍA
y contraselección CON INTERÉS GENÉTICO 2DESOXIGALACTOSA
en
recombinación
GRAMO
a k yo
minorte
gramo
mi
Los vectores recombinantes
utilizan un método de
VECTOR
selección y contraselección SIN GEN no crezcas
para identificar qué bacteria DE INTERÉS
alberga el vector que BACTERIAS CON
contiene el gen de interés. GALK MEDIOS MÍNIMOS DE GALACTOSA
90 En la parte A, el gen de galK Antibiótico
codifica una galactosa resistencia
Crecer
quinasa. Cuando las bacterias gene
que expresan GalK se cultivan
en 2desoxigalactosa (2DOG),
se produce una toxina que
mata las bacterias (placa A
superior). GalK también Gen de interés
permite que las bacterias
crezcan en medios mínimos
RECOMBINACIÓN
de galactosa (placa inferior). En
la parte B, la recombinación
reemplaza el gen galK con el
mi ohF i tmi 2DESOXIGALACTOSA
gen de interés y, por lo tanto, mi
norte
rmi
norte
GRAMO
st
las bacterias ya no pueden
crecer en medios mínimos
VECTOR
de galactosa (placa inferior).
CON GEN
La falta de GalK permite que las bacterias crezcan en 2DOG
(placa
DE superior).
INTERÉS Crecer
Antibiótico BACTERIAS CON
resistencia GEN DE INTERÉS
MEDIOS MÍNIMOS DE GALACTOSA
gene Hacer
no crecer
B
Capítulo 3
VECTORES DE CLONACIÓN GATEWAY® FAGO FIGURA 3.27

ADN
Integración del ADN
Un sistema de clonación más nuevo utiliza los Lambda
sitios de integración y escisión del fago lambda El ADN del fago tiene una
para clonar genes de un vector a otro (fig. 3.27). secuencia de unión
El fago lambda existe como fago pero también se llamada attP. El ADN bacteriano
integra en el cromosoma de E. coli en el sitio attB para tiene una secuencia de unión
att PAG
llamada attB. El ADN
formar un profago. La reacción de integración PAG
oh PAG'
bacteriano y el ADN del fago λ
ocurre cuando la integrasa hace cortes escalonados
BACTERIANO se alinean en la región "O" de las
en el centro del fago attP. ADN attb secuencias de unión. Durante
sitio y en el centro del sitio bacteriano attB. B B
oh'
la integración, la proteína int
Luego, los extremos se conectan para que el ADN induce dos roturas de doble
del fago se integre, pero observe que las secuencias cadena que se resuelven, dando
son diferentes a las originales. Estos se denominan como resultado la integración del
ADN del fago en el ADN
attL y attR después de la integración. Esta reacción EXCISIÓN
bacteriano. El proceso es
se puede revertir, pero como los dos sitios son INTEGRACIÓN REQUIERE
INT y XIS reversible y requiere proteína int
diferentes después de la integración, otra enzima REQUIERE
EN T y proteína xis para escindir el
llamada Xis, o escisionasa, elimina el ADN ADN del fago del ADN bacteriano.
insertado y relega el ADN roto. Observe que el sitio “O” del
ADN del fago integrado
Los vectores de clonación Gateway explotan el está flanqueado por un lado del
sistema de integración/escisión del fago lambda para fago y un lado de la bacteria.
estudiar un gen de interés. Los vectores incluyen Estos se denominan sitios attL y
PAG
secuencias para expresar el gen de interés en una attR.
PAG'
B'B oh
proteína, agregar una etiqueta proteica, trasladar el
gen entre diferentes organismos modelo o secuenciar
el gen. El primer paso del sistema es colocar el
gen de interés entre dos sitios attL (fig. 3.28). Esto
91
se puede hacer clonando el gen en un sitio de
multiclonación que se encuentra en el clon de
entrada. El clon de entrada tiene un gen llamado
attL attR
ccdB en el medio del sitio de clonación múltiple, que BP'oh PB'oh
codifica una toxina que mata al huésped cuando se PROFAGO
expresa. Cuando este gen se expresa en E. coli, la
bacteria muere, lo que asegura que cualquier
SITIO DE CLONACIÓN MÚLTIPLE FIGURA 3.28 Puerta
bacteria que albergue el vector original muera.
clon de entrada way®
Cuando el gen de interés reemplaza al gen ccdB , las bacterias pueden El clon de entrada para el
ccdB
IRocEI
IRocEI
VRocE
ays
psN
V
cny
ooY
n
HmaoBy
oyx
ohoXy
oo
lo
nm
crecer. (Una cepa especial de E. coli con una antitoxina contra el producto El sistema Gateway® tiene un
del gen ccdB permite a los investigadores mantener el clon de entrada antes att l 1 att origen de replicación para
t t2 l2
de que el gen de interés se clone en el vector). 1 crecer en bacterias, un gen
de resistencia a los antibióticos
PUERTA DE ENTRADA®
Una vez que el gen está en el vector de entrada, dos reacciones diferentes
lo mueven entre los diferentes clones de destino (fig. 3.29). La
reacción LR elimina el gen de interés cortándolo en los sitios attL y lo
i r
Coh
CLONACIÓN
VECTOR DE ENTRADA
i
anorte
ametro
k
para seleccionar bacterias con
el vector, un sitio de
multiclonación que contiene el gen ccdB
Cy
mueve a los sitios attR1 y attR2 en el vector de destino. Esto da como entre dos sitios attL
Ud.
pag norte
(attL1 y attL2). El gen de interés
resultado un clon de expresión que tiene el gen de interés flanqueado
reemplaza al ccdB
por attB1 y attB2. El vector de entrada ya no tiene el gen de interés,
gen durante la clonación
que se reemplaza con el gen de la toxina, ccdB. Cualquier bacteria que reciba este vector muere. Las únicas
estándar utilizando sitios de
bacterias supervivientes son aquellas que tienen el gen de interés en el vector de destino. enzimas de restricción únicos. El
Al igual que ocurre con el fago lambda, la reacción es reversible. La reacción BP elimina el gen de interés del gen ccdB produce una toxina
vector de destino y puede volver a colocarlo en cualquier vector con sitios attL . La facilidad con la que el gen que mata a la bacteria huésped a menos que la
clonado puede moverse entre vectores hace que este sistema sea muy adaptable a diferentes investigaciones. La bacteria tiene un gen
correspondiente para una antitoxina.
Existen vectores de clonación Gateway® para la expresión de proteínas en bacterias, añadiendo diferentes
etiquetas como HIS6; expresar el gen de interés en células de insecto, humanas o de ratón; o secuenciar el
gen de interés.
Gen de interés ccdB Gen de interés ccdB
attL1 attL2 attR1 attR2 attB1 attB2 attP1 attP2
clonasa LR
ENTRADA
VECTOR
+ DESTINO
VECTOR
DESTINO
VECTOR
+ ENTRADA
VECTOR
clonasa BP
KanR AmpR AmpR KanR
FIGURA 3.29 Reacciones de Gateway® BP y LR
El traslado de un gen de interés desde el clon de entrada al vector de destino se realiza en la reacción LR. Las enzimas exisionasa e integrasa actúan para eliminar el gen
de interés en el clon de entrada cortando en los sitios attL y attR del clon de entrada y el vector de destino. El gen de interés y ccdB intercambian posiciones, cambiando
así el sitio att para convertirse en attB y attP. La reacción de BP funciona a la inversa, moviendo el gen de interés nuevamente al clon de entrada.
Resumen
La tecnología del ADN recombinante es la base de casi todas las investigaciones biotecnológicas. Comprender
estas técnicas equivale a comprender el resto del libro de texto. En primer lugar, se debe aislar el ADN del
organismo para identificar genes nuevos, recuperar nuevos vectores recombinantes o purificar un gen nuevo.
El ADN se aísla de los componentes celulares usando enzimas seguido de centrifugación, digestión del ARN con
RNasa y precipitación con etanol. Cada organismo requiere adaptaciones especiales de este proceso básico
para eliminar los componentes celulares y extracelulares.
El ADN purificado se puede manipular de muchas formas diferentes. Las enzimas de restricción cortan la columna
vertebral de fosfato del ADN en fragmentos más pequeños, que pueden visualizarse mediante electroforesis en gel.
92 Se visualizan fragmentos de ADN específicos utilizando nucleótidos marcados radiactivamente, seguido de una
autorradiografía. Para evitar el uso de radiactividad, los investigadores pueden sintetizar ADN con digoxigenina o
nucleótidos unidos a biotina, que luego se unen a un anticuerpo contra digoxigenina o estreptavidina, respectivamente.
Para visualizar el anticuerpo o la estreptavidina, los investigadores vinculan cualquiera de ellos a un fluoróforo o
enzima indicadora que convierte un sustrato en luz o un precipitado coloreado. La hibridación de secuencias
relacionadas es una técnica clave para FISH, transferencias Southern, transferencias Northern y transferencias
puntuales, así como la detección de una biblioteca genómica para una secuencia particular.
El capítulo también describe las características clave de los vectores, incluidos los plásmidos, los vectores
bacteriófagos, los cósmidos y los cromosomas artificiales. Estos elementos genéticos extracromosómicos varían en
sus usos, pero son muy importantes para lograr que un gen extraño se exprese en un organismo huésped.
Los vectores requieren una región que sea conveniente para agregar una pieza extraña de ADN, como un sitio de
clonación múltiple, necesitan un gen para la selección y necesitan alguna forma sencilla de identificar si el vector
contiene la pieza extraña de ADN.
Una biblioteca genómica simplemente contiene todo el ADN del organismo de interés, cortado en fragmentos más
pequeños y clonado en un vector. Luego, los vectores recombinantes de la biblioteca se devuelven a una célula
bacteriana huésped de modo que solo haya un fragmento del ADN original dentro de cada bacteria.
Las bibliotecas de expresión comienzan con ARNm en lugar de ADN genómico. El ARNm se convierte en ADNc con
la transcriptasa inversa. Las bibliotecas se analizan en busca de secuencias de ADN particulares de interés mediante
hibridación de secuencias de ADN relacionadas. En el caso de las bibliotecas de expresión, las bacterias
convierten cada uno de los fragmentos de ADN en proteína. Luego, estas proteínas se analizan utilizando
anticuerpos.
La clonación de genes utilizando los digestores tradicionales de enzimas de restricción puede resultar muy
difícil para genes grandes, ya que es probable que el gen tenga sitios de enzimas de restricción. Para superar
este obstáculo, la recombinación utiliza la recombinación entre secuencias de ADN homólogas para insertar el gen
de interés en un vector. La recombinación también se utiliza en el sistema de clonación Gateway®, pero en lugar
de utilizar regiones de homología, estos vectores utilizan el fago lambda attB, attP, attR y attL.
Capítulo 3
secuencias de reconocimiento y las enzimas integrasa y exisionasa. En ambos sistemas, el vector tiene un gen
que produce una toxina (ccdB) o convierte un sustrato específico en una toxina (galK). Si el gen de interés no
reemplaza a ccdB o galK, entonces la bacteria huésped muere. Si el gen de interés se recombina en el vector,
entonces la bacteria huésped vive y propaga el vector recombinante.
Preguntas de final de capítulo
1. ¿ Cuál de las siguientes afirmaciones sobre el aislamiento de ADN de E. coli no es correcta?
a. La extracción química con fenol elimina las proteínas del ADN.
b. El ARN se elimina de la muestra mediante tratamiento con ARNasa.
C. El detergente se utiliza para romper las células vegetales y extraer el ADN.
d. La lisozima digiere el peptidoglicano en la pared celular bacteriana.
mi. La centrifugación separa los componentes celulares según su tamaño.
2. ¿Cuál de los siguientes es importante para que funcione la electroforesis en gel?
a. Los ácidos nucleicos cargados negativamente migran a través del gel.
b. Bromuro de etidio para proporcionar un medio para visualizar el ADN en el gel.
C. Agarosa o poliacrilamida para separar el ADN según su tamaño.
d. Estándares de peso molecular conocidos.
mi. Todo lo anterior es importante para la electroforesis en gel.
3. ¿Cómo se utilizan las enzimas de restricción y la ligasa en biotecnología?
a. Las enzimas de restricción cortan el ADN en lugares específicos, produciendo extremos que
se puede volver a unir con ligasa.
b. Sólo las enzimas de restricción que producen extremos romos después de cortar el ADN pueden ser
ligado con ligasa. 93
C. Sólo las enzimas de restricción que producen extremos pegajosos en el ADN pueden ligarse
con ligasa.
d. Las enzimas de restricción pueden cortar el ADN en sitios específicos y unirlos nuevamente.
mi. Las enzimas de restricción cortan el ADN al azar y los fragmentos cortados se pueden unir
nuevamente con ligasa.
4. ¿Cuál de los siguientes es un método apropiado para detectar ácidos nucleicos?
a. Medición de absorbancia a 260 nm.
b. Autorradiografía de ácidos nucleicos radiomarcados.
C. Quimioluminiscencia del ADN marcado con biotina o digoxigenina.
d. Medición de la luz emitida después de la excitación por ácido nucleico marcado con fluorescencia.
ácidos en un fotodetector.
mi. Todos los anteriores son métodos apropiados para detectar ácidos nucleicos.
5. ¿ Por qué el contenido de GC de una molécula de ADN en particular afecta la fusión de las dos
hebras?
a. El enlace G y C sólo requiere dos enlaces de hidrógeno, por lo que requiere un
temperatura más baja para “fundir” el ADN.
b. Debido a que el emparejamiento de bases G y C requiere tres enlaces de hidrógeno y un
Se requiere una temperatura más alta para "fundir" el ADN.
C. El porcentaje de As y Ts en la molécula es más importante para la temperatura de fusión que el
porcentaje de Gs y Cs.
d. No es importante conocer el contenido de nucleótidos de una molécula de ADN.
Investigación en biotecnología y biología molecular.
mi. Ninguna de las anteriores.
(Continuado)
6. ¿Cuál es la diferencia entre las hibridaciones del Sur y del Norte?
a. Las transferencias Southern hibridan una sonda de ADN con una muestra de ADN digerida, pero
las transferencias Northern hibridan una sonda de ADN, generalmente, con ARNm.
b. Las transferencias Southern utilizan una sonda de ARN para hibridar con el ADN, pero las transferencias Northern
Utilice una sonda de ARN para hibridar con el ARN.
C. Las transferencias Southern determinan si se está expresando un gen en particular, pero las
transferencias Northern determinan la homología entre el ARNm y una sonda de ADN.
d. Las transferencias Southern determinan la homología entre el ARNm y una sonda de ADN, pero las
transferencias Northern determinan si se está expresando un gen en particular.
mi. Las transferencias Southern y Northern son esencialmente la misma técnica por
formados en diferentes hemisferios del mundo.
7. ¿ Cuál podría ser el uso de la hibridación fluorescente in situ (FISH)?
a. Para la identificación de un gen específico en una extracción de ADN mediante hibridación con
una sonda de ADN.
b. Para la identificación de un gen específico mediante hibridación con una sonda de ADN dentro
células vivas cuyo ADN ha sido desnaturalizado por el calor.
C. Para la identificación de un ARNm dentro de una extracción de ARN mediante hibridación con
una sonda de ADN.
d. Para la identificación de ARNm y ADN en extractos celulares utilizando un
Sonda de ARN.
mi. Ninguna de las anteriores.
8. ¿ Cuáles de los siguientes son rasgos útiles de los vectores de clonación?
a. Un gen de resistencia a antibióticos en el plásmido para la selección de células que contienen el
plásmido.
94 b. Un sitio que contiene secuencias únicas y agrupadas de enzimas de restricción para clonar ADN
extraño.
C. Un plásmido con un alto número de copias para que se puedan obtener grandes cantidades de ADN.
d. Complementación alfa para determinar si el ADN extraño se insertó en el sitio de clonación.
mi. Todos los anteriores son rasgos útiles.
9. ¿ Cuál de los siguientes vectores contiene los fragmentos más grandes de ADN?
a. plásmidos
b. bacteriófago
C. YAC
d. PAC
mi. cósmidos
10. Además de una descarga de alto voltaje, ¿cuál es otro método para hacer que E. coli sea competente
para absorber ADN “desnudo”?
a. Altas concentraciones de iones de calcio seguidas de alta temperatura.
b. Altas concentraciones de iones de calcio y varias horas en hielo.
C. grandes cantidades de ADN agregadas directamente a un cultivo bacteriano que crece a 37 °C
d. Altas concentraciones de minerales seguidas de altas temperaturas.
mi. Una descarga de alto voltaje es la única manera de hacer que E. coli sea competente.
11. ¿Por qué se construyen bibliotecas de genes?
a. Para encontrar nuevos genes.
b. Secuenciar genomas completos.
C. Comparar genes con otros organismos.
d. Crear un “banco” de todos los genes de un organismo.
mi. Todo lo anterior.
Capítulo 3
12. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre las bibliotecas de genes es correcta?
a. Los genes de una biblioteca se pueden comparar con genes de otros organismos mediante
hibridación con una sonda.
b. Una biblioteca de genes sólo es necesaria para mantener genes conocidos.
C. Cada gen de la biblioteca debe secuenciarse primero para poder comparar los genes de la
biblioteca con genes de otros organismos.
d. Las bibliotecas de genes sólo se crean para organismos eucariotas.
mi. Las bibliotecas de genes sólo se pueden crear en procariotas.
13. ¿Por qué se debe utilizar la transcriptasa inversa para crear una expresión eucariota?
¿biblioteca?
a. La transcriptasa inversa sólo se utiliza para crear bibliotecas de expresión procariotas.
b. La transcriptasa inversa crea ADNc a partir de ARNm en procariotas.
C. La transcriptasa inversa asegura que el gen esté en la orientación correcta dentro
el vector de expresión para crear proteínas.
d. La transcriptasa inversa crea ADNc a partir de ARNm porque los genes en eucariotas
tienen una gran cantidad de regiones no codificantes.
mi. No se utilizan otras enzimas para crear bibliotecas de expresión, excepto las de restricción.
enzimas.
14. ¿Cuáles de las siguientes son características comunes de los vectores de expresión?
a. Pequeños segmentos de ADN que codifican etiquetas para la purificación de proteínas.
b. Sitios de inicio y parada transcripcional.
C. Un promotor estrictamente controlado que sólo puede inducirse en determinadas
circunstancias.
d. Gen de resistencia a los antibióticos.
mi. Todo lo anterior son características comunes de los vectores de expresión. 95
15. ¿ Qué método se utiliza para construir vectores recombinantes grandes cuando las enzimas de
restricción polienlazantes no son útiles?
a. recombinación
b. PEZ
C. bibliotecas de genes
d. YAC
mi. hibridación
16. ¿Qué afirmación sobre la clonación de Gateway® no es cierta?
a. Los vectores de clonación Gateway® explotan un sistema de recombinación de bacteriófagos.
b. La integrasa corta dentro de los sitios attB y attP .
C. El gen ccdB produce una toxina dentro de las células huésped que portan el gen de
interés.
d. La escisionasa regoniza los sitios attL y attR para eliminar el fragmento de ADN recombinado.
mi. La clonación en el vector de entrada es necesaria para generar sitios attL en los extremos del
gen de interés.
Otras lecturas
Clark, DP (2013). Biología molecular (2ª ed.). San Diego, CA: Elsevier Academic Press.
Shlien, et al. (2010). Un mecanismo molecular común subyace a dos síndromes de microdeleciones 17p13.1 fenotípicamente
distintos. Revista Estadounidense de Genética Humana, 87, 631–642.

ADN Recombinane-David P. Clark

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Enzima Organismo fuente Secuencia de reconocimiento

HpaII Haemophilus parainfluenzae C/CGG

MboI Moraxella bovis /GATC

NdeII Neisseria denitrificante /GATC

EcoRI Escherichia coli RY13 G/AATTC

EcoRII Escherichia coli RY13 /CCWGG

EcoRV Escherichia coliJ62 /pGL74 GAT/ATC

BamHI Bacilo amyloliquefaciens G/GATCC

SauI Estafilococo aureus CC/TNAGG

BglI bacilo globigii GCCNNNN/NGGC

No yo Nocardia otitidis­caviarum GC/GGCCGC

DraII Deinococcus radiophilus RG/GNCCY

sitio de corte sitio de corte sitio de corte sitio de corte sitio de corte

Bam hola DIGERIR Bgl II

FIGURA 3.4 Bases libres repartidas absorben más luz porque sus estructuras son

Gel con radioactivo Coloque la película sobre gel y manténgala Posición de espectáculos de película

sustrato Luz o color Las enzimas informadoras actúan

GRAMO C GRAMO C GRAMO C GRAMO C

CARGAR Y NYLON DEL SUR FOTOGRÁFICO FIGURA 3.11 Moléculas

FLUORESCENCIA EN SITUACIÓN HIBRIDACIÓN (PESCADO)

Padre Madre Niño (17p13.1 Del)

FIGURA 3.14 Polienlazador Reconocimiento Reconocimiento Reconocimiento Reconocimiento investigadores abrir el vector de clonación

plásmido Cromosoma plásmido Cromosoma en medios con X­gal.

MCS Bacteriano Origen y origen de la levadura

ORIGINAL FRAGMENTOS TRANSFORMADO RECOMBINANTE

METRO sistema Para garantizar la obtención de inserciones con el

proteínas 6 his t mir

identificar uniéndose a anticuerpos yC t mir Fl A t mir

Secuencia Gene Secuencia

VECTORES DE CLONACIÓN GATEWAY® FAGO FIGURA 3.27

Gen de interés ccdB Gen de interés ccdB

attL1 attL2 attR1 attR2 attB1 attB2 attP1 attP2

KanR AmpR AmpR KanR

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No yo Nocardia otitidiscaviarum GC/GGCCGC

plásmido Cromosoma plásmido Cromosoma en medios con Xgal.