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ELECTROFORESIS DE ADN EN GEL DE AGAROSA

LABORATORIO DE INGENIERÍA GENÉTICA

MARIANA ÁLVAREZ RESTREPO


LORENA DAVID PEREIRA
LUIS FELIPE GIRALDO GUZMÁN

DOCENTE:
LAURA INES PINILLA MENDOZA

FACULTAD DE INGENIERÍA
INGENIERÍA BIOQUÍMICA
BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

CAREPA, ANTIOQUIA
20 DE AGOSTO 2021
INTRODUCCIÓN
El ADN es una macromolécula que almacena y transmite toda la información necesaria para el
desarrollo de todas las funciones biológicas de un organismo. Está formado por la combinación
paralela de dos hebras, y cada hebra está compuesta por 4 nucleótidos diferentes. Esto hace que
el ADN sea tan diverso, por ejemplo, de peces, plantas, insectos, humanos, etc. La expresión
génica es la base del metabolismo celular, se puede entender que el ADN se transcribe en ARN
y el ARN se traduce en proteína. Esta secuencia de ADN-ARN-proteína constituye la ley
central de la biología molecular. Las dos cadenas de nucleótidos que forman la molécula de
ADN se mantienen juntas porque las bases que contienen nitrógeno de las dos cadenas forman
un enlace. El ADN guía la síntesis de todas las proteínas a escala mundial. Se puede decir
simplemente que el ADN es la acumulación de genes (fragmentos de ADN), y cada gen es la
clave para la producción de proteínas. En la extracción de ácidos nucleicos existen diferentes
métodos para obtenerlos de diferentes fuentes, como plantas plasmidas, gotas de sangre,
cabello, células bacterianas o eucariotas.
La electroforesis en gel de agarosa se usa comúnmente para separar moléculas en función de
su carga, tamaño y forma. Es un medio particularmente eficaz para separar biomoléculas
cargadas como ADN, ARN y proteínas. Aunque la electroforesis en gel de agarosa es una
técnica simple y fácil, tiene una capacidad de separación efectiva La naturaleza del gel
determina la velocidad de migración de las moléculas: las moléculas pequeñas migran más
rápido que las moléculas grandes. Además, las moléculas de la misma masa y carga pueden
tener diferentes formas: aquellas con formas más compactas (las formas circulares son más
compactas que las alargadas) migran más rápido. Factores como la carga, el tamaño y la forma
de la molécula, las características del tampón de electroforesis, la concentración del gel y la
energía eléctrica afectarán la movilidad de las moléculas en el gel. Entre las moléculas con
masa y forma molecular similares, las más cargadas migrarán más rápido. Por otro lado,
diferentes moléculas interactúan con la agarosa en diferentes grados. Cuanto menos simple sea
la interacción, más lenta será la migración de moléculas.
En primer lugar, se presentará la metodología para realizar una extracción y una electroforesis.
Después se indicarán los resultados de la extracción y electroforesis para a continuación,
continuar con los análisis de dichos resultados y finalmente concluir el laboratorio.
METODOLOGÍA
La extracción o aislamiento del ADN es un proceso que se realiza para recoger material
genético (ADN) para posteriores análisis moleculares, es el primer paso para la mayoría de los
estudios en biología molecular y para las técnicas del ADN recombinante. También es uno de
los primeros pasos en muchos procesos diagnósticos utilizados para detectar la presencia de
bacterias o virus en el ambiente, así como para el diagnóstico de enfermedades y anomalías
genéticas. Dicho procedimiento a emplear varía en función de la especie y del tipo de tejido de
partida, pero existe un paso a paso general para completar la extracción de ADN a partir de un
tejido de planta. Como primer paso es necesario romper las paredes celulares de modo que se
produzca la liberación del contenido celular, este paso suele realizarse por trituración del
material en nitrógeno líquido o hielo seco. Seguidamente se lleva a cabo la ruptura de las
membranas celulares generalmente mediante el empleo de algún detergente (Bromuro de
cetiltrimetilamonio) y de calor, una vez liberado el contenido celular se realiza la
desnaturalización y separación de proteínas mediante el empleo de disolventes orgánicos
(Cloroformo isoamílico) una vez eliminadas las proteínas la precipitación del ADN se lleva a
cabo empleando algún alcohol en frío (isopropanol).
Agregando a lo anterior también se estudiará el método de electroforesis en gel, este funciona
algo parecido a la extracción de ADN; consiste en la separación de los fragmentos del ADN (u
otras macromoléculas como ARN y proteínas) teniendo en cuenta su tamaño y carga. Ambas
técnicas tienen el mismo fin; purificar el ADN y así poder estudiarlo, analizarlo o manipularlo.
Esta técnica se basa en el hecho de que el ADN se encuentra cargado negativamente debido a
los grupos fosfato, como consecuencia al aplicar una corriente el ADN se desplaza desde el
polo negativo hacia el polo positivo; esta separación se lleva a cabo en una matriz sólida
llamada “Gel de agarosa’’.
Con base en su tamaño y carga, las moléculas se desplazan por el gel en diferentes direcciones
o distintas velocidades, con lo que se separan unas de otras.
Existen distintos factores que afectan a la velocidad con que el ADN migra en el gel; entre
estos factores están el tamaño de la molécula, la concentración de agarosa o la conformación
del ADN.
Todas las moléculas de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa. Debido a esto, la
electroforesis en gel separa los fragmentos de ADN únicamente por su tamaño.
La electroforesis nos permite ver cuántos fragmentos diferentes de ADN están presentes en una
muestra y cuán grandes son unos con respecto a otros. También podemos determinar el tamaño
absoluto de un fragmento de ADN examinándolo junto a una "escala" estándar de fragmentos
de tamaño conocido.
Ahora bien, como su nombre lo indica, en la electroforesis en gel participa un gel; un bloque
de material similar a la gelatina. El gel a utilizar en este caso es un polisacárido llamado
agarosa, que se consigue como hojuelas secas pulverizadas. Cuando la agarosa se calienta en
una solución amortiguadora (agua mezclada con algunas sales) y deja enfriar, se forma un gel
sólido ligeramente blando. A nivel molecular, el gel es una matriz de moléculas de agarosa que
se mantienen unidas por puentes de hidrógeno y que forman pequeños poros.

RESULTADOS
La extracción de DNA permite comprender cómo es posible separar la expresión génica
esencial para la síntesis de proteínas a través de un engranaje de pasos que van facilitando las
rupturas necesarias hasta terminar el proceso, se utilizó una hoja joven de tomate como
materia viva para el experimento, además se tienen a disposición todos los materiales y equipos
requeridos y previamente calibrados para lograr una mayor efectividad, se trata al máximo de
minimizar el error humano para al final del proceso se almacenarla a una baja temperatura
con el fin de preservar la muestra de DNA extraída.
es necesario iluminar el gel con luz ultravioleta para que el bromuro de tibio emita
fluorescencia y sea posible detectar los fragmentos de ADN separados si la fuente de luz
ultravioleta lleva acoplado a una cámara fotográfica es posible ver la imagen en un monitor y
grabarla en algún soporte informático lo que facilita el análisis posterior de los resultados
Se determina el tamaño de los fragmentos separados en el gel por comparación con un patrón
de tamaños conocidos. Además, podremos conocer el tamaño de los fragmentos de nuestra
muestra ya que fragmentos de un mismo tamaño migrarán a una misma distancia en el gel.

ANÁLISIS DE RESULTADOS
Esta técnica se basa en el hecho de que el ADN se encuentra cargado negativamente debido al
grupo fosfato como consecuencia cuando se aplica un campo eléctrico el ADN se desplaza
desde el polo negativo hacia el polo positivo esta separación se lleva a cabo en una matriz
sólida el gel de agarosa. Los factores que afectan la velocidad con que el ADN migra dependen
principalmente del tamaño de la partícula, la concentración de agarosa y la conformación de
ADN.
El voltaje que se aplica en los geles de agarosa depende de la resolución requerida y del tamaño
de los fragmentos a separar. Entre 1-10V/cm (los cm se refieren a la distancia entre los
electrodos), la movilidad electroforética de los fragmentos lineales de DNA es proporcional al
voltaje aplicado; sin embargo, si se incrementa el voltaje, los fragmentos grandes cambian su
movilidad electroforética, sin que ésta guarde relación con su tamaño.
En general, la separación de fragmentos grandes de DNA es mejor a bajos voltajes (aunque
esto incrementa el tiempo de electroforesis). Sin embargo, elevados voltajes producen bandas
estrechas y bastante bien resueltas cuando se trata de fragmentos pequeños.
Un DNA lineal se mueve en un gel de agarosa a una velocidad que es dependiente del tamaño
del poro del gel. A mayor concentración de agarosa, menor diámetro de poro y menor
movilidad. La movilidad electroforética de los fragmentos de DNA es inversamente
proporcional al logaritmo de su tamaño, expresado en pares de bases.
Cuanto mayor es el fragmento de DNA, más se retarda a lo largo del recorrido por el gel. Así,
los fragmentos se van orientando hacia el ánodo en relación con su tamaño. Por encima de 50
kb, son tan largos que avanzan prácticamente con la misma velocidad y no se separan.
Los extremos del fragmento de DNA tienen más facilidad para moverse y cambiar de dirección
que la parte central, de modo que la estructura lineal puede combarse, adoptando forma de
horquilla, por lo que puede “engancharse” en las fibras del gel, dificultando su migración. Este
fenómeno es muy acusado en fragmentos de tamaño intermedio, y es la causa del fenómeno
conocido como inversión de banda, por la cual estructuras de tamaño intermedio migran más
lentamente que otras mayores. Este fenómeno es más acusado a elevadas concentraciones de
agarosa y bajos voltajes.
Si se incrementa el voltaje para intentar acelerar la separación, las estructuras pueden perder
flexibilidad, deformarse y estirarse en la dirección del campo eléctrico adoptando forma de
varilla rígida, por lo que no se apreciaron diferencias de tamaño y no habría separación.
Una vez que los fragmentos se han separado, podemos examinar el gel y saber el tamaño de
las bandas que se encuentran en él. Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN
y se coloca bajo luz UV, los fragmentos de ADN brillarán, lo cual nos permite ver el ADN
presente en distintos lugares a lo largo del gel.

PREGUNTAS
● Numerosas técnicas pueden separar proteínas según sus diferencias de masa. Dos
de estas técnicas son la centrifugación y la electroforesis en gel describa el
fundamento de cada una de ellas.
Centrifugación: Es una técnica de separación que se utiliza para aislar o concentrar
partículas suspendidas en un líquido aprovechando la diferente velocidad de
desplazamiento según su forma, tamaño o peso por medio de una fuerza giratoria. La
fuerza centrífuga es provista por una máquina llamada centrifugadora, la cual imprime
a la mezcla un movimiento rotatorio que origina una fuerza que produce la
sedimentación de los sólidos o de las partículas de mayor densidad. Cuando se
centrifuga una solución, se rompe la homogeneidad y se produce la separación del
soluto y del solvente. Las primeras partículas a sedimentar son las de mayor masa. Los
componentes más densos de la mezcla se desplazan fuera del eje de rotación de la
centrífuga, mientras que los componentes menos densos de la mezcla se desplazan hacia
el eje de rotación.
El objetivo de esta técnica es separar sólidos insolubles (de partículas muy pequeñas
difíciles de sedimentar) de un líquido. Para ello, se aplica un fuerte campo centrífugo,
con lo cual las partículas tenderán a desplazarse a través del medio en el que se
encuentren con la aceleración.
Es recomendable usar dicha técnica cuando se utilizan partículas pequeñas difíciles de
filtrar.
Electroforesis: La electroforesis es una técnica para separar moléculas en función de
su carga, tamaño y forma (generalmente ácidos nucleicos o proteínas) en un campo
eléctrico sobre una matriz porosa, cuya composición depende de la molécula a analizar.
Para la separación de ADN se usan matrices de agarosa y para la separación de proteínas
matrices de poliacrilamida. Los poros del gel actúan como un colador, permitiendo que
las moléculas más pequeñas se mueven más rápido que las grandes.
Estos geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un tampón de pH
alrededor de 8. De esta forma, las moléculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis
se desplazarán al polo positivo ya que a pH superiores a 5 poseen carga negativa. Los
geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en
función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño, van a
emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis.

● Las proteínas de la sangre: Transferrina (PM 76 kDa) y las lisozimas (PM 14 kDa)
se pueden separar centrifugación por zonas de velocidad o por electroforesis en
gel de poliacrilamida SDS. ¿Cuál de las dos proteínas sedimentará más
rápidamente durante la centrifugación?
Las centrífugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas
que producen la sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una densidad
mayor que la del medio que las rodea.

La velocidad de sedimentación se determina por la densidad de las partículas y


recordemos que la densidad es una relación entre la masa y el volumen, entonces, la
densidad es directamente proporcional a la masa, por tanto, si el peso molecular de una
partícula aumenta (aumenta la masa) la densidad también va a aumentar. De acuerdo
con esta información se deduce que de las dos proteínas la que sedimentará más rápido
será la transferrina ya que tiene un peso molecular mayor en comparación con la
lisozima.

¿Cuál de las dos migrará más rápidamente durante la electroforesis?

La velocidad de migración es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína


y su masa. Teniendo en cuenta que todas las proteínas tienen la misma carga por unidad
de masa; la migración va a depender únicamente de la fuerza de fricción, y, por tanto,
del tamaño de la partícula, su peso molecular y la viscosidad (o porcentaje de
poliacrilamida) del gel. Es decir que a mayor peso molecular o mayor viscosidad del
gel, menor migración.

Con base a lo anterior, se concluye que la lisozima migrará más rápido ya que tiene un
peso molecular menor que el de la transferrina.

● ¿Qué papel desempeñan cada uno de los reactivos usados en la extracción de ADN
que se observó en el video?
-Tampón de extracción que contenía CTAB, EDTA y TRIS HCl: El CTAB se usó
como detergente que actúa como agente solubilizante de proteínas y de componentes
de tejidos y membranas, el EDTA para quelar los iones positivos de magnesio,
manganeso y calcio dentro de la célula y el TRIS HCl se encargó de mantener el pH en
la solución. Este en específico es una substancia básica. Con esto, se evita que se
degrade el DNA y el RNA en las células.
-Cloroformo Isoamílico: Se usó como disolvente orgánico para separar las proteínas.
-Isopropanol: Se usó como alcohol para realizar la precipitación, tras la lisis celular y
la eliminación de las proteínas de la muestra, se precipitan los ácidos nucleicos
añadiendo isopropanol. Este método permite la obtención de ADN de gran pureza.
-Etanol al 70%: En presencia de ciertas sales los ácidos nucleicos quedan retenidos
por adsorción en columnas de sílice. Posteriormente las columnas se lavan con
soluciones salinas que eliminan las partículas que no se han unido.
-Tampón TE (TRIS y EDTA): TRIS fue la molécula responsable del taponamiento
(regulación del pH) y EDTA se usó para quelar los iones positivos de magnesio,
manganeso y calcio dentro de la célula. Así, la nucleasa se ata al EDTA en vez de atarse
al grupo fosfato entre los ácidos nucleicos y se previene que quiebre los mismos, así
estabilizando el ADN.

● Mencione y explique otros métodos para la extracción de ADN.


Incubación del lisado para su uso: Un posible método para aislar el ADN genómico
es incubar el lisado crudo a una temperatura de 90-100 ° C y usarlo directamente.
Evidentemente, la pureza del ADN obtenido por este método es muy baja y su
aplicación muy limitada. Otra desventaja de este método es que debido a la acción de
las nucleasas y otros componentes de los orgánulos que entran en contacto con el ADN
y pueden dañar el ADN, el ADN se perderá, por lo que no se puede utilizar para
almacenar ADN porque los contaminantes degradarán las moléculas de ADN.
Lisis por ruptura mecánica y extracción con disolventes orgánicos: Si elige lisar la
célula a través de un proceso mecánico, debe considerar la posibilidad de que la
molécula de ADN que está tratando de separar se descomponga, por lo que esto debería
ser suficiente para lisar la célula, pero no para proteger de manera muy agresiva el
ADN. Este método se puede utilizar para extraer ADN de materias primas, materiales
liofilizados o congelados, que pueden romperse con un mortero, congelar-descongelar
o ultrasónico. El lisado celular se puede extraer con cloroformo, alcohol isoamílico o
fenol, y las proteínas y otros componentes de las células se pueden disolver en
disolventes orgánicos para realizar la separación de ácidos nucleicos. Este método se
puede utilizar con moléculas de ADN de alto peso molecular para obtener un buen
rendimiento de moléculas relativamente puras, siempre hay que tener en cuenta que se
debe controlar el valor del pH y la concentración de sal de la fase acuosa, que son
factores para asegurar una buena separación. La desventaja de este método es el uso de
disolventes orgánicos nocivos para la salud humana. Estos disolventes quedarán como
trazas en las muestras de ADN y luego actuarán como interferencias en técnicas como
la PCR. Esta técnica es muy larga y en ocasiones produce malos resultados.
Reproducible rendimiento y requiere múltiples transferencias, lo que aumenta la
posibilidad de contaminación de la muestra.

Lisado y purificación con un detergente iónico. Método del CTAB: Este es el


procedimiento básico para extraer ADN de plantas, en el que los detergentes aniónicos
pueden romper la pared celular, lisando así las células. El uso de detergentes aniónicos
no se limita a la extracción de ADN vegetal, sino que también se puede usar para el
ADN genómico de bacterias y otros tipos de organismos. Un ejemplo de este método,
quizás el más famoso, es el uso de CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio) como
detergente para lograr la lisis. Además, CTAB forma complejos insolubles con ADN
cuando se usa EDTA como agente quelante y TRIS-HCl como tampón. Luego se
extrajo el residuo orgánico con cloroformo y luego se separó el ADN mediante
precipitación con etanol. Si desea evitar el uso de disolventes orgánicos, puede realizar
el método CTAB separando directamente el complejo insoluble formado con ADN del
sobrenadante en el que se han disuelto los componentes celulares restantes. Estos
complejos se resuspenden en solución salina, seguido de la adición de alcohol y RNasa,
de modo que el precipitado de ADN tenga una pureza aceptable y sea adecuado para
muchas aplicaciones.
Método de salting-out: A partir de un lisado celular se pueden separar las moléculas
de proteínas y otros contaminantes del ADN mediante la adición de altas
concentraciones de sal que hacen que disminuya la solubilidad de las moléculas
orgánicas en la fase acuosa. En este método se utiliza frecuentemente la proteinasa K,
el TRIS-HCl para regular el pH y otros reactivos químicos que aseguren la total
inactivación de las enzimas que pueden actuar sobre las moléculas de ADN. Para la
extracción se utilizan sales inorgánicas como el perclorato de sodio y el cloruro de sodio
en concentraciones muy altas que hacen precipitar a las moléculas orgánicas. El
precipitado formado se separa por centrifugación y luego se puede extraer el ADN de
la disolución acuosa mediante la adición de alcohol, por precipitación. Este método es
sencillo, pero no siempre es eficaz, por lo que el ADN obtenido en muchas ocasiones
debe ser purificado antes de ser usado en posteriores aplicaciones. La ventaja es que se
elimina el uso de disolventes orgánicos.
Uso de la proteinasa K y el dodecilsulfato de sodio: El procedimiento conocido como
PK-SDS por sus siglas en inglés proteinase K - sodium dodecyl sulfate, es uno de los
más usados para la extracción de ADN ya que la digestión de la muestra se puede
realizar con proteinasa K que es activada por el dodecil sulfato de sodio. La proteinasa
K inactiva las DNAsas presentes en el lisado celular usando detergente aniónico el SDS.
La proteinasa K también es usada en otros de los métodos descritos en este artículo para
la digestión de las proteínas y otros contaminantes del lisado celular.
Método de extracción de ADN con yoduro de sodio como agente caotrópico en un
único tubo: La compañía Wako pone a disposición de los investigadores y empresas
varios kit de ADN que usan yoduro de sodio como agente caotrópico, que tienen la
ventaja de que la extracción se realiza en un único micro tubo de centrifugado. El
yoduro de sodio además de provocar la lisis celular rompe la capa de hidratación que
rodea el ADN y logra que las cargas negativas de los grupos fosfatos del ADN queden
más expuestas. En estos kits después del tratamiento de la muestra con yoduro de sodio
en el mismo tubo se adicionan detergentes aniónicos como es el caso del N-lauril
sarcosinato de sodio, proteinasa K y/o otros reactivos que permiten separar las proteínas
y lípidos contenidos en las muestras biológicas del ADN.
Extracción con gradientes de cloruro de cesio – bromuro de etidio: El ADN
genómico puede ser purificado por centrifugación selectiva a través de la generación de
gradientes de cloruro de cesio. Primeramente, se lleva a cabo el lisado celular por
métodos mecánicos o químicos y la mezcla es centrifugada durante varias horas en
presencia de bromuro de etidio. Como hay bromuro de etidio en el medio, se pueden
visualizar las diferentes capas en las que se agrupan los ácidos nucleicos según su
densidad con luz ultravioleta. Se obtienen varias capas que pueden separarse y
recuperar el ADN purificado. Este método a pesar de dar como resultado un ADN de
alta calidad tiene una serie de desventajas: es largo, imposible de automatizar, caro,
requiere una ultracentrífuga y usa compuestos químicos tóxicos.
Intercambio aniónico para la extracción de ADN del lisado celular: La
cromatografía en fase sólida de intercambio aniónico se basa en la interacción que se
establece entre los grupos fosfatos cargados negativamente del ADN y la matriz
molecular con que se compacta la columna. Esta interacción hace que las moléculas de
ADN queden retenidas en la fase estacionaria de la columna y puedan separarse de las
proteínas y demás metabolitos presentes. Luego añadiendo una alta concentración de
sales a la fase móvil se logra eludir el ADN, que si es necesario es precipitado con
alcohol para futuras aplicaciones, si no puede utilizarse directamente disuelto en el
buffer con sales en el que se elude. Este método tiene la ventaja de evitar el uso de
disolventes orgánicos tóxicos y es más simple que los que requieren precipitación de
otros componentes para su separación del ADN.

Uso de matrices celulósicas para la extracción del ADN de muestras biológicas: Un


método usado en investigaciones forenses consiste en impregnar una matriz de celulosa
con productos químicos que permitan la lisis celular y posterior conservación del ADN.
Para esto se unen tampones, agentes quelatantes, sales, detergentes y moléculas con
gran absorbancia en el UV para proteger las muestras de los radicales libres que pueden
formarse por exposición a la luz solar. Siguiendo este procedimiento las muestras
pueden ser conservadas por un largo período de tiempo, lo cual es muy útil para la
resolución de casos forenses y también tiene utilidad para la determinación de especies
en un fluido corporal como puede ser un virus o una bacteria.

Uso de resinas de intercambio iónico: Para la extracción del ADN también se han
diseñado resinas que son capaces de formar complejos con el ADN. El uso de resinas
hidrocarbonadas con estructuras rígidas en tres dimensiones permite que la superficie
se encuentre cargada con alguna sustancia como el dietilaminoetilo que puede
protonarse en medio ácido y quedar cargado positivamente por lo que interacciona con
los grupos fosfatos del ADN. Esto es un método directo, que puede realizarse en un
solo tubo y relativamente rápido, pero tiene como inconveniente que se aíslan cadenas
sencillas de ADN, y este no puede ser utilizado por ejemplo para el análisis de la
variación de polimorfismos en fragmentos de restricción (RFLP).

● ¿Qué técnicas o metodologías se conocen para medir la cantidad de ADN que posee
una célula?
Una vez extraído el ADN, una forma de estimar la cantidad presente en el extracto, es
mediante la cuantificación. Para la cuantificación del ADN, existen dos métodos
indirectos que permiten estimar la concentración del ADN en las muestras, estos son
por visualización y mediante espectrofotómetro.

● ¿En qué consisten las técnicas de “Southern blot” y “Northern blot”?


Southern blot:
Southern blot es una técnica de laboratorio utilizada para detectar una secuencia
específica de ADN en una muestra de sangre o tejido. Una enzima de restricción se
utiliza para cortar una muestra de ADN en fragmentos que se separan mediante
electroforesis en gel. Los fragmentos de ADN son transferidos del gel a la superficie de
una membrana. La membrana se expone a una sonda de ADN marcada con un marcador
radiactivo o químico. Si la sonda se une a la membrana, entonces la secuencia de la
sonda está presente en la muestra.
La transferencia Southern es un método de análisis de moléculas de ADN. El protocolo
fue desarrollado por Edward Southern. Al realizar la transferencia Southern, los
diferentes fragmentos de ADN se separan primero por tamaño a lo largo del campo
eléctrico del gel, los más grandes migran hacia la parte superior y los más pequeños se
encontrarán en la parte inferior. Cuando el gel corre, se transfiere a la membrana. Es
como hacer un sándwich: gel, una película en la parte superior y muchas toallas de
papel. Lo que se busca es permitir que la solución pase el ADN que se encuentra en el
gel a través de la membrana.
Northern blot:
Northern blot es una técnica de laboratorio que se utiliza para detectar una secuencia de
ARN específica en una muestra de sangre o de tejido. Las moléculas de ARN en una
muestra se separan por tamaño mediante electroforesis en gel. Los fragmentos de ARN
son transferidas del gel a la superficie de una membrana. La membrana se expone a una
sonda de ADN marcada con una etiqueta radiactiva o química. Si la sonda se une a la
membrana, entonces la secuencia complementaria de ARN está presente en la muestra.
La transferencia Northern se utiliza para analizar moléculas de ARN. Generalmente,
los grupos moleculares de ARN se separan de las muestras de células o tejidos y luego
se usa electroforesis para promover la migración de ARN en el gel. De esta manera, los
fragmentos más pequeños se colocan en la parte inferior y los fragmentos más grandes
se colocan en la parte superior. Una vez que hemos completado lo que llamamos el gel
en funcionamiento, se une una membrana al gel y las moléculas de ARN se transfieren
del gel a la membrana mediante un gradiente de solución salina o transferencia
electroforética, la membrana suele ser de nitrocelulosa. Este producto de transferencia
de nitrocelulosa parece una hoja de papel en blanco. Pero esto nos permitirá estudiar
las diferencias en las muestras de ARN a continuación. Podemos preguntar si hay una
molécula de ARN, marcar el ARN y buscar una similar en la membrana, o podemos
preguntar si su tamaño ha cambiado. Si cambia el procesamiento del ARN, puede
esperar un cambio de tamaño. El término Northern blot es en realidad un juego de
palabras sobre cómo las personas analizan el ADN en primer lugar. Una persona
llamada Edward Southern desarrolló el protocolo para realizar un análisis similar, pero
permitió que las moléculas de ADN migraran en el gel y luego se transfirieran a la
membrana. El acuerdo recibió su nombre de Southern, que significa provenir del Sur.
Por lo tanto, cuando las moléculas de ARN se analizan de manera similar, la técnica se
llama Northern o del norte, lo que parece un juego de palabras interesante. El término
"blotting" o mancha se refiere al protocolo en sí, donde tienes el gel, luego lo colocas a
modo de sándwich, le pones la membrana a transferir y finalmente le agregas un manojo
de material absorbente, -usamos toallas de papel -es igual que usted. El ADN se mancha
y se transfiere a la parte superior de la membrana para su posterior análisis.
CONCLUSIÓN
Es una técnica muy utilizada en la investigación básica, muy importante para la comprensión
de la función de genes y proteínas, pero ahora ha irrumpido en el área de diagnóstico clínico y
forense. La electroforesis de ADN en gel de agarosa es un método novedoso con una gran
cantidad de aplicaciones que se pueden utilizar en la industria de la medicina forense para
determinar la identidad de las personas que puedan haber participado en un delito, mediante la
vinculación de su patrón de ADN (su patrón de electroforesis) a uno que esté en una base de
datos. El proyecto genoma humano se llevó a cabo con algo que se llama electroforesis capilar,
mediante la separación de ADN en piezas más cortas y su separación en geles de electroforesis
que permite a los patrones de A, C, T y G ser caracterizados. También son muy importantes en
la investigación de proteínas, y en la investigación de mutaciones genéticas, porque cuando las
proteínas o el ADN están mutados, son con frecuencia más o menos largos, y, por lo tanto,
aparecen en un gel de electroforesis de manera diferente de lo normal. Las pruebas de
diagnóstico para muchos casos todavía se realizan mediante electroforesis.
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