Facultad de Ciencias Naturales

Laboratorio de Microbiología

Alumno: _____________________________________________ Código: _______

Alumno: _____________________________________________ Código: ________

Laboratorio 4: Bacterias

OBJETIVOS

El objetivo de esta práctica es que los estudiantes:

1. Reconozcan la utilidad de los perfiles bioquímicos como herramienta para

la identificación de bacterias.
2. Formulen y apliquen una metodología para la identificación de bacterias
basada en la tipificación de sus características macroscópicas,
microscópicas y metabólicas.
3. Identifiquen las diferentes pruebas bioquímicas empleadas en la
caracterización de bacterias.
4. Interpreten los resultados de las diferentes pruebas bioquímicas empleadas
en la caracterización de bacterias.
5. Dada una situación real o hipotética elijan o sugieran con argumentos la
metodología a seguir para la identificación de una bacteria.

Las siguientes preguntas buscan poner en contexto a los estudiantes respecto al tema a
abordar en la práctica y obtener la información necesaria para la construcción de la
INTRODUCCIÓN y el MARCO TEORICO de la guía. Realizar una revisión
bibliográfica y responder, con sus palabras:

• Defina metabolismo
• Defina ruta metabólica.
• Qué evalúa una prueba bioquímica?
• Qué son las pruebas bioquímicas?
• Cuáles son las principales pruebas bioquímicas, qué evalúa cada una?
• Cómo se pueden clasificar las pruebas bioquímicas?
• Cómo por medio de las pruebas bioquímicas se pueden identificar bacterias?
• Al momento de identificar una bacteria a partir de su perfil bioquímico, cuales
considera que son los pasos a seguir?
• Se utiliza siempre (para cualquier bacteria) el mismo conjunto de pruebas
bioquímicas, qué elementos determinan las pruebas bioquímicas a utilizar para una
bacteria dada?
• Defina sistema de identificación rápido (basado en pruebas bioquímicas.
• Cuáles son los más conocidos, cuáles son sus beneficios o ventajas.
• Qué permite identificar el Kit API 20E, por qué
• Qué características debe presentar la bacteria para ser analizada por medio de este
Kit de identificación?

MATERIALES Y REACTIVOS POR GRUPO DE DOS PERSONAS:

Equipos Cantidad
Microscopio 1 unidad
Incubadora 35 °C 1 unidad por salón de
clase

Reactivos Cantidad
Cristal Violeta para Gram 1,5 ml
Lugol para Gram 1,5 ml
Alcohol Acetona para Gram 3 ml
Safranina/ Fucsina para Gram 1,5 ml
Plantillas del sistema BBL Crystal 1 unidad
E/NF ID o API 20E
Aceite de inmersión 2 ml por salón de
clase
Hipoclorito al 5% 10 ml por salón de
clase

Insumos Cantidad
Portaobjetos 1unidad
Asa Bacteriológica en argolla 1 unidad
(Metálica)
Mechero de alcohol 2 unidades
Papel de arroz (libreta) 1 unidad por salón de
clase
Cubeta con Parilla de coloración 4 unidades por salón de
clase
Frasco lavador 1 unidad
Pinzas de madera 1 unidad
Timer 1 unidad
Recipiente para Desechar Colorantes 1 unidad por salón de
clases
Recipiente para Descartar Material 1 unidad
Contaminado
Cultivos frescos (18-24 horas) de 6 unidades por salón de
bacterias Gram Negativas, oxidasa clases
Negativas (Cepas congeladas)
Papel Filtro (no importa el tamaño del 1 unidad
poro o la forma), reactivo para medir
actividad oxidasa o tiras para medir
actividad oxidasa
Micropipetas de 100 µl 1 unidad
Puntas Amarillas para Micropipeta de 20 unidades
100 µl. Estériles
Tubos de 15 ml Estériles con 10 ml de 1 unidades
agua destilada esteril
Batería de reactivos para revelar pruebas 3 unidades
bioquímicas de API TDA, VP1, VP2,
NIT A, NIT B, JAMES.

ACTIVIDAD 1: Revisión de Cultivo y Coloración de Gram

1. Lavar bien sus manos con agua y jabón antibacterial. Limpiar y desinfectar el
área de trabajo y organizar el material que va a utilizar.
2. Teniendo en cuenta la revisión bibliográfica, cuál considera que es el paso a
seguir, por qué?

ACTIVIDAD 2: Caracterización bioquímica de microorganismos por medio del

Sistema de identificación rápida API 20E.

1. Realizar primero la prueba de oxidasa, por qué?. Tomar una colonia y con la ayuda
de un asa de plástico o palillo estéril y esparcirla sobre un área pequeña de papel
filtro. Agregar el reactivo de oxidasa y leer el resultado de la prueba: Negativa: no
hay presencia de color. Positiva: aparición de un color que puede variar del violeta
al púrpura. Anotar el resultado. En caso de utilizar tiras de oxidasa, tomar una
colonia y con la ayuda de un asa de plástico o palillo estéril y esparcirla en el
extremo de la tira donde se encuentra la el reactivo. Esta prueba reacciona igual que
el reactivo líquido.

2. Preparación de la suspensión bacteriana: con la ayuda de un asa bacteriología estéril

tomar una colonia bien aislada del microorganismo a analizar y depositarla en el
Medio de suspensión. Disolver hasta que no se observen grumos. (ver fig. 1 paso a)

3. Tomar 5 ml de agua destilada estéril y ponerlos en las celdas del empaque de

incubación corrugado de la prueba, para así obtener un ambiente saturado de
humedad y evitar la deshidratación durante la incubación.

4. Inocular la galería (tira de pruebas), que consta de tubo (parte inferior) y cúpula
(parte superior), de la siguiente manera: con la ayuda de una micropipeta con punta
estéril inocular los tubos con la suspensión bacteriana, incline la prueba
perpendicular a la mesa, suelte el líquido tocando con la punta de la pipeta la pared
del dispositivo para no formar burbujas. Para los compartimentos CIT, VP y GEL
llene tanto el tubo como la cúpula, situando la punta de la pipeta contra la pared de
 la cúpula y depositando cuidadosamente la suspensión bacteriana sin introducir
burbujas. (ver fig. 1 paso b)

5. Después de la inoculación de los tubos llenar completamente la cúpula de los

compartimentos ADH, LDC, ODC, H2S y URE con aceite mineral (estas pruebas se
encuentran subrayadas). (ver fig. 1 paso c)

6. Colocar la cubierta plástica sobre la galería de pruebas, rotular y llevar a incubar a

35±2°C por 24 horas. Si la prueba no puede ser leída una vez cumplido el tiempo de
incubación, retirar la prueba de la incubadora y refrigerarla. (ver fig. 1 paso d)

Una vez cumplido el tiempo de incubación:

7. Interpretar (ver tabla 2.) y registrar (ver tabla 1.) todas las reacciones. Leer primero
todos los otros compartimentos antes de hacerlo con las pruebas TDA, IND y VP, lo
cuales se hacen de la siguiente manera:

-TDA: adicionar una gota de cloruro férrico al 10%. La prueba se considera positiva
si hay la aparición de un color marrón-rojizo. Los organismos indol positivos
pueden producir un color naranja, lo que es considerado como un resultado negativo
para la prueba TDA.

-VP: adicionar una gota del reactivo VP A (KOH), y después una gota del reactivo
VP B (alfa naftol). Se considera una reacción positiva si se produce un color rojo
(no rosa tenue) dentro de los 10 minutos siguientes.

-IND: adicionar una gota del reactivo de Kovacs. La prueba se lee como positiva si
hay la formación de un anillo rojo dentro de los 2 minutos siguientes.

-Lectura de la prueba de reducción de nitratos: antes de adicionar cualquier reactivo,

observe la presencia de burbujas en el tubo de la prueba GLU. La presencia de
burbujas en este compartimiento indica la reducción de nitratos a N2. Adicionar 2
gotas del reactivo Nitrato 2 (Dimetil- alfa-naftilamina) y 2 gotas del reactivo Nitrato
1 (Ácido Sulfanilico). La prueba se lee como positiva si hay aparición de un color
rojo dentro de los 3 minutos siguientes. Un resultado negativo debe ser confirmado
con la adición de polvo de Zinc.

8. Registrar cada prueba positiva con un (+) en la casilla correspondiente en su tabla de

resultados (ver tabla 1.). Coloque los puntos correspondientes para cada reacción
positiva en la sección indicada. lea los siete (7) números como un código de siete
(dígitos) en el API 20E Analytical Profile Index. La reducción de nitratos se toma
como una prueba confirmativa y no como parte del código de siete dígitos.

9. Una vez interpretados y consignados los resultados, disponer todas las piezas que
hacen parte de la prueba en una bolsa para autoclavar.
 Sistema API 20E – Esquema de siembra

Figura 1.

Reacciones Bioquímicas API 20E

Prueba Descripción Resultado

Positivo Negativo
O-nitrofenil-B-D-galactosido es
ONPG hidrolizado por la enzima que Amarillo Incoloro
hidroliza lactosa.
ADH Argnina deshidrolasa transforma la Rojo Amarillo
arginina en ornitina.
LDC Liberación de cadaverina por Rojo Amarillo
descarboxilacion de la lisina.
ODC Producción de putrescina por Rojo Amarillo
descarboxilacion de la ornitina.
CIT Utilización de citrato como única Azul oscuro Verde claro
fuente de carbono.
No formación
H2S Reducción de tiosulfato a H2S. Precipitado de del precipitado
color negro de color negro
Hidrólisis de la urea por la acción de
URE la enzima ureasa, formación de NH3 y Rojo Amarillo
CO2
TDA Formación de indol y ácido piruvico Café Amarillo
por desaminacion del triptófano
IND Detección de indol por adición del Anillo rojo Anillo amarillo
reactivo de Kovacs
VP Detección de acetoina por la adición Rojo Incoloro
de los reactivos KOH y Alfa-naftol.
GEL Hidrólisis de la gelatina. Difusión del No difusión del
pigmento pigmento
GLU Fermentación de glucosa.
MAN Fermentación de manitol.
INO Fermentación de inositol. Amarillo o
SOR Fermentación de sorbitol. amarillo-verdoso Azul o verde
RHA Fermentación de ramnosa.
SAC Fermentación de sacarosa.
MEL Fermentación de melodiosa.
AMY Fermentación de Amigdalina.
ARA Fermentación de arabinosa

Amarillo,
NO2 Rojo, burbujas, ausencia de
N2 gas Reducción de nitratos amarillo después burbujas,
N2O de la adición de naranja después
Zinc de la adición de
Zinc
 Tabla de Resultados API 20E.

Tabla 1.
Bibliografía consultada.

Citar después de cada pregunta la bibliografía consultada.

REFERENCIAS:

Johnson TR, Case CL. Laboratory Experiments in Microbiology. Eighth Edition.

Pearson, 2007.
Morello J, Mizer H, Granato P. Laboratory Manual and workbook in Microbiology.
7th Edition. 2002.
Valencia HA. Manual de Prácticas de Microbiología Básica. Facultad de Ciencias,
Universidad Nacional de Colombia. 1ª Edición, 2004.
Manual de Laboratorio de Microbiología Ambiental. Escuela de los Recursos
Naturales y del Ambiente – EIDENAR, Universidad del Valle 2003.
Manual del usuario Sistema BBL Crystal E/NF ID

Imágenes

http://wonderworkerdistributors.com/catalogue.html
http://www.insulab.es/Paginas/pagina_difco_bd_bbl.htm
http://www.bd.com/

Fecha: Julio de 2011