IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE VITAMINA CPOR CROMATOGRAFÍA

LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

Rojas Ramos, María Camila 1, Ruiz Martínez, Samanta 2
camila.rr2411@gmail.com 1,samantarm99@gmail.com 2
1y2
Universidad Icesi, Facultad de Ciencias Naturales, Programa de Química Farmacéutica 1 y 2.
Santiago de Cali, Colombia
Fecha de entrega: abril 25 del 2019

RESUMEN
Este laboratorio tuvo como objetivo aplicar la cromatografía liquida de alto desempeño (HPLC)
para la cuantificación de vitamina C (Ácido Ascórbico) en un preparado farmacéutico,
empleando la preparación de una fase móvil para posteriormente colocarse en el cromatógrafo de
alta resolución y así, cuantificar el área del pico arrojado por el instrumento de los estándares de
vitamina C (ácido ascórbico) y la muestra problema. Se obtuvo que en cada comprimido
utilizado en la práctica hay una concentración aproximada de 551. 5 ppm de ácido ascórbico y un
porcentaje de error respecto al valor arrojado por el comprimido de 10.3%.

1. INTRODUCCIÓN vez este último se transforma

La vitamina C es la más popular de las
vitaminas hidrosolubles por los
innumerables beneficios que reporta. El
ácido ascórbico se considera un poderoso
enemigo de los agentes virales por lo que
sirve de apoyo al sistema inmunológico.
Además es un valioso agente antioxidante
que protege al organismo de diversas
enfermedades y mejora la salud en general a
dosis elevadas.1
La vitamina C se afecta con facilidad por
factores como: la humedad, la luz, el aire, el
calor, los iones metálicos como hierro y
cobre, el oxígeno y el medio alcalino. Tras
su descomposición bajo estas condiciones se
transforma fácilmente en diferentes
compuestos como son: el ácido oxálico,
ácido L-treónico, ácido L-xilónico, ácido L-
lixónico y ácido dehidroascórbico, y a su
irreversiblemente en ácido 2,3 diceto-L
glucónico, el cual constituye su principal
producto de degradación.2
Dentro de los métodos oficiales descritos
para el análisis de la vitamina C en tabletas,
uno de los más empleados es la valoración
directa con 2,6-diclorofenol indofenol por
resultar simple y rápido.3  El método es
válido si se conoce que en la composición de
la muestra no existen sustancias
interferentes y la concentración de ácido
dehidroascórbico es inapreciable, por tanto,
se puede aplicar a una muestra recién
preparada, pero no resulta de utilidad en
estudios de estabilidad de la vitamina C.
La determinación de Vitamina C ha sido
ampliamente estudiada por diferentes
técnicas analíticas, teniendo en cuenta las
propiedades fisicoquímicas de la molécula.
Sin embargo la Cromatografía Líquida de
Alta Resolución (HPLC), garantiza límites
de detección y cuantificación más bajos, que
facilita además la eliminación de los efectos
causados por la matriz (interferencias en
otros métodos de análisis); esta técnica es
utilizada frecuentemente en investigaciones
agroindustriales, bioquímica y química
analítica4.
En la cromatografía líquida de alta
resolución, o HPLC por sus siglas en inglés
(High Performance Liquid
Chromatography), se consigue una
separación más rápida y efectiva por la
inyección del líquido analizado y de la fase
móvil a presiones que alcanzan los 1000 bar,
además de que las fases y el líquido cuentan
con partículas de tamaños lo suficientemente
pequeños como para asegurar una alta
selectividad y precisión5.
La fase estacionaria se caracteriza por ser un
sólido particulado, y sus propiedades varían
de acuerdo con los compuestos analizados,
tal que esta retenga ciertos componentes con
mayor selectividad y fuerza que a otros5. En
este caso, la fase estacionaria dentro de la
columna cromatográfica fue de un derivado
C18 de sílica, es decir, con cadenas de 18
carbonos en la periferia de las partículas del
polímero que le otorgaban cierto carácter
apolar.
Por otro lado, la fase móvil es un líquido
capaz de arrastrar a los componentes y
retirarlos de las interacciones con la fase
estacionaria. La naturaleza de la fase móvil
también depende de las propiedades de los
componentes y del interés del análisis, tal
que la fase utilizada arrastre con mayor
facilidad cierto tipo de compuestos. Cuando
se utiliza únicamente un solvente como la
fase móvil, se habla de un análisis
isocrático. No obstante, existe la posibilidad
de variar la fase móvil de acuerdo con el
orden en que se quieran separar los
componentes, a esto se le conoce como un
análisis en gradiente, y permite variar el
tiempo de retención de las especies, así
como mejorar la resolución de los picos
cromatográficos5.
El hecho de que las restricciones para la
escogencia de las fases móvil y estacionaria
sean pocas, además de la gran disponibilidad
de detectores, ha permitido que la
cromatografía líquida de alta resolución sea
utilizada actualmente en varios ámbitos para
el análisis cualitativo y cuantitativo de una
gran cantidad de moléculas dentro de las
ciencias químicas, biológicas y médicas,
entre muchas otras.
En esta práctica se cuantificó y determinó la
cantidad de vitamina C (ácido ascórbico) en
un preparado farmacéutico por medio de la
técnica de cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC).
2. METODOLOGÍA
Para cuantificar el ácido ascórbico, primero
se realizó la preparación de 1000 mL de la
fase móvil agitando agua tipo 1 a la que se le
añadieron 10.0006 g de fosfato monobásico
de sodio, y se ajustó su pH en 2,7 con un
poco de ácido fosfórico. Se filtró y se llevó a
ultrasonido por 10 minutos.
Se procedió a preparar los estándares
utilizados en la curva de calibración, para lo
cual se prepararon 50 mL de una solución 5 ppm x10 mL= 104ppm x V2
stock con 0,052 g de ácido ascórbico
utilizando como solvente la fase móvil. 5 ppmx 10 mL
V2= = 0,48 mL
Luego se realizaron los estándares en 4 100 ppm
balones de 10 mL a los que se le añadieron
0,5, 1, 2, y 3 mL de la solución stock y se
Para las soluciones anteriores se obtuvieron
aforaron con la fase móvil.
las siguientes alturas de acuerdo con los
cromatogramas (tabla 1).
Posteriormente, para preparar la muestra se
maceraron 3 tabletas de vitamina C y se
Tabla 1. Concentración (ppm) y altura
tomaron 0,1g que se diluyeron utilizando (mAU) de los patrones externos.
como solvente la fase móvil, se filtró en un
balón de 100. Concentración
Solución Altura (mAU)
(ppm)
Finalmente, teniendo ya listos los estándares 1 5,00 28,3251
y la muestra, se filtraron con una membrana 2 10,00 46,3006
de 0,2 micras y se inyectaron en viales para 3 20,00 96,9499
4 30,00 144,7897
ser llevados al cromatógrafo y así obtener
sus respectivos cromatogramas.
A partir de estos resultados se realizó la
siguiente curva de calibración (figura 1)

3. CÁLCULOS Y RESULTADOS

Para la preparación de la solución stock de

ácido ascórbico, se pesaron 0.0052 g de este
ácido, por lo que se obtuvo una
concentración final de 104 ppm.

5,2mg HAsc
C HAsc = =104 ppm
0,05 L fase movil

La curva de calibración se realizó mediante

Fig. 1. Curva de calibración de ácido
soluciones de 10 mL añadiendo 0.48, 0.96,
ascórbico,
1.92 y 2.88 mL de solución patrón, el
volumen de cada solución utilizada en la
curva de calibración simple fue calculado a Altura=4,736C HAsc−2,132
partir de la ecuación 1.
C HAsc =concentracion de C 6 H 8 O 6
C1V1=C2V2 (1)
Tabla 2. Peso de cada tableta. Para la dilución de la muestra de vitamina C
se determinó una altura de 79,2362 mAU en
Tableta Peso (g) el cromatograma, con este dato se procedió a
1 1,6135 determinar su concentración experimental a
2 1,6045 partir de la curva de calibración por medio
3 1,5988 de la ecuación 5.
4 1,6026
Promedi 79,2362+ 2,132
1,60485 C HAsc diluido exp= =17,18 ppm
o 4,736
(5)
Se pesaron 0.1000 g de las tabletas
pulverizadas y se llevaron a 100 mL con la Aplicando el factor de dilución
fase móvil. Teniendo en cuenta que, cada correspondiente, se obtuvo una
tableta de vitamina C contiene 500 mg de concentración de ppm para la solución
ácido ascórbico se puede determinar la inicial de vitamina C (ecuación 6).
concentración verdadera de ácido ascórbico
en la solución de 100 mL de la muestra por ppm∗10 mL dilci ó n
medio de la ecuación 3 a partir de la C HAsc exp =17,18 = 343,6
0,5 mL al í cuota
proporción de su peso ecuación 2 ppm (6)

0.5 g HAsc Se procedió a determinar la cantidad

proporción= =0.3106 %
1,605 g /tableta experimental de ácido ascórbico contenida
(2) en cada tableta por medio de la ecuación 7.
100 mg∗0.3106 %
C HAsc = =310,6 ppm (3)
0,1 L ppm∗1.605 g/tableta
m HAsc / tableta =343,6 =
1,000 g muestra
Sin embargo, se realizó una dilución con 0,5 551,5 (7)
mL de la solución de la muestra hasta un
volumen de 10 mL, de modo que esta El porcentaje de error para el contenido de
estuviera dentro de la curva. La ácido ascórbico por tableta se obtuvo por
concentración final se halla por medio de la medio de la ecuación 8.
ecuación 4.
310,6 ppm∗0,5 mL |551,5−500 g|
C HAsc diluido = =15,53 ppm
10 mL error = =10,3 %
500 g
(4)

4. ANÁLISIS DE RESULTADOS

La cromatografía liquida de alta resolución o

HPLC, es una técnica que permite separar y
cuantificar un analito o varios debido a que
posee una columna cromatografía, donde se
realiza el separado, y un detector al final,
por lo que en este caso particular es ideal,
debido a que la tableta contiene otros
componentes como el Zinc 6. Para ello se
preparó una fase móvil de fosfato de Sodio
Monobásico con un pH de 2,71, esto último
se hace para mantener la estructura química
del ácido ascórbico, pues sus hidrógenos
ácidos se mantienen en pH de 2,1 a 2,7.
La preparación de la fase móvil tiene dos
momentos importantes, la filtración y la
desgasificación. La filtración es de suma
importancia porque la fase liquida puede
contener impurezas poco visibles que
podrían taponar los tubos de conexión por
donde se bombea la fase móvil, los cuales
pueden llegar a tener diámetros de 0,2 mm,
ocasionando daños al equipo que pueden
llegar a ser irreparables en caso de que se
ocasione filtrado de las sustancias y dañen la
parte eléctrica. En segundo lugar, se
encuentra la desgasificación, esta también
juega un papel fundamental a la hora de
preparar la fase móvil debido a que, si no se
realiza, esta puede evaporar parte del
analito, evitando que llegue hasta el detector
y los resultados se obtengan con varios
errores.
En esta práctica se utilizó un método
isocrático, es decir, que la fase móvil fue la
misma durante todo el análisis
cromatográfico. Esto se debe a que el ácido
ascórbico posee una mayor afinidad a este
que cualquier otro componente del
comprimido, esta afinidad se da por la
presencia de hidrógenos ácidos en la
estructura del ácido ascórbico.
Para determinar la concentración de ácido
ascórbico presente en el comprimido, se
realizó una curva de calibración graficando
la altura arrojada por el cromatograma vs la
concentración de ácido ascórbico de cada
estándar. En la figura 1 se puede evidenciar
que la gráfica presenta un comportamiento
lineal con un coeficiente de determinación
de 0.998.
La muestra analizada fue un comprimido de
vitamina C, importante agente antioxidante
hidrosoluble, que se sintetiza químicamente
mediante una serie de reacciones
enzimáticas, gracias a su estructura química
es muy sensible a la degradación, siendo
influenciada por factores como el pH, la
concentración de oxígeno, enzimas,
catalizadores metálicos y la concentración
inicial del ácido7.
En la práctica se obtuvo una concentración
de ácido ascórbico en el comprimido de
551.5 ppm y un error experimental de
10.3%. Este error se puede deberse a la fácil
degradación del ácido ascórbico y los
factores que influyen en ella como lo es el
pH trabajado, además de errores
instrumentales de los materiales y equipos
utilizados, igualmente pudo haber una
posible contaminación en las soluciones
preparadas y esto podría interferir en la
obtención de los cromatogramas, y
finalmente, la exactitud de los cálculos que
se hicieron para tomar las alícuotas y las
condiciones bajo las cuales se llevaron a
cabo las reacciones también influyen en el
error obtenido.
5. CONCLUSIONES
Se evidenció un error considerable puesto
que fue del 10.3%, se puede atribuir a
factores humanos a la hora de preparar las
soluciones o en el momento de realizar los
cálculos y las aproximaciones pertinentes
para los mismos.
El método de cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) es un buen método para
la cuantificación de ácido ascórbico en
comprimidos, ya que, aunque se obtuve un
error considerable, la concentración
experimental no está muy lejana a la
concentración reportada en el comprimido.
6. REFERENCIAS
1. Aristizábal CL; Aristizábal M, Montoya
SL. Las vitaminas. 1997, Lucas
Morea/Sinexi S.A. Monografía.com.
Disponible
en: http://www.monografias.com/trabajos11/
lasvitam/lasvitam.shtml
2. Yang JH, Lee SY, Han YS, Park KC,
Choy JH. Efficient Transdermal Penetration
and Improved Stability of L-Ascorbic Acid
Encapsulated in an Inorganic Nanocapsule.
Bull Korean Chem Soc. 2003; 24(4).
3. USP 28. United States Pharmacopoeia
XXVIII and National Formulary 25st:
United States Pharmacopeial Convention.
Versión Electrónica. 2005.
4. Castiñeira M. Métodos de análisis
aplicados a la vitamina C. Rev Cubana
Farm. 1989; 23(2).
5. Gilbert, M. (1987). High Performance
Liquid Chromatography. Bristol: IOP
Publishing Limited.
6. Instituto Nacional de Vigilancia de
Medicamentos y Alimentos – INVIMA,
resolución No. 2017024266 del 13 de Junio
de 2017. Tomado de:
http://web.sivicos.gov.co/registros/pdf/1543
0770_2017024266.pdf