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Servicio Nacional de Aprendizaje SENA

Centro de Gestión Industrial


Versión: 01
Práctica de Laboratorio para la Identificación Morfológica de
microorganismos

Código del Ensayo QAI-ATI-002


Identificación macroscópica y microscópica de levaduras aislados a partir de la fruta de interés
Nombre del ensayo
para el proyecto.
Programa Química Aplicada a la Industria, versión 4.0
Aplicar técnicas de procesos mediados por microorganismos de acuerdo con protocolos
Norma de Competencia
establecidos por la organización
Controlar las diferentes variables involucradas en un proceso biotecnológico teniendo en cuenta
Resultado de Aprendizaje
la ruta bioquímica para la obtención de los metabolitos.
Realizar ensayos y análisis físicos, químicos y microbiológicos a
Actividad de proyecto Fase Ejecución
materia prima, producto en proceso y producto terminado

1. Principios

Los microrganismos se pueden identificar de acuerdo con sus características morfológicas,


metabólicas y moleculares. Las características morfológicas permiten una identificación básica
a partir de la cual se pueden realizar otros análisis más especializados como por ejemplo la
caracterización bioquímica que permite la identificación del género y en algunas ocasiones la
especie a la cual pertenecen los microrganismos estudiados.

Aunque hoy en día la secuenciación del DNA de los microorganismos es ampliamente utilizada
para conocer su identidad aún sin tener que realizar cultivos de los microorganismos en el
laboratorio, la microscopia sigue siendo utilizada para conocer la morfología microscópica de
los microrganismos y para caracterizarlos. Así mismo, la tinción de Gram sigue siendo una
técnica sencilla y fundamental para clasificar las bacterias en Gram negativas y Gram positivas.

La identificación y clasificación de los hongos basada en la morfología macroscópica y


microscopia es mas compleja que la de las bacterias ya que no existe una técnica de
coloración que permita la clasificación de estos, así que se deben hacer múltiples
observaciones minuciosas de las colonias y de las estructuras micoscópicas como esporas,
hifas y cuerpos fructíferos para poder identificar el genero al cual pertenecen.

Para la observación de las levaduras al microscopio se pueden usar montajes en fresco con
colorantes de azul de lactofenol o azul de metileno. Así mismo , la morfologia de estos
hongos unicelulares también se puede visualizar al microscopio usando tinciones compuestas
como la de Gram, solo que es importante tener en cuenta que esta tinción no permitirá su
identificación como Gram positivas o Gram negativas, porque esta clasificación es exclusiva
para las bacterias ya que esta se basa en el tipo de composición de la pared bacteriana.

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QAI-ATI-007 Instructivo para determinar la acidez total en un vinagre comercial por volumetría ácido-base

2. Muestreo
• Para esta práctica no aplica.

3. Preinforme
El pre-informe debe contener los siguientes ítems:
1.Título de la práctica
2.Respuesta a preguntas: conteste las siguientes preguntas
• ¿Qué es una colonia bacteriana o de levaduras?
• ¿Qué características tienen las colonias de la levadura Saccharomyces cerevisiae ?
• Busque y pegue o adjunte al menos dos imágenes diferentes donde se puedan apreciar las
colonias de Saccharomyces cerevisiae
• ¿Cuáles son las características microscópicas de la levadura Sacharomyces cerevisia?
• Adjunte una imagen donde se puedan apreciar las células de Saccharomyces cerevisiae
bajo el microscopio óptico. Adjunte imágenes de frotis teñidos con coloración de Gram y
con azul de metileno.
• Realice el siguiente cuadro comparativo

Características Levaduras Bacterias


Tamaño (µm)
Tipo de celula
Características de
la colonia
Metodos de
Tinción
Imagen

• ¿Que es un frotis y como se realiza?


• ¿Cuál es el fundamento de la tinción de Gram?
3. Introducción: después de leer toda la práctica deberá hacer una introducción a la práctica,
explicando de manera general los procedimientos a realizar durante la práctica
4. Procedimiento: elabore un diagrama de flujo de la práctica a realizar.
4. Materiales
a. Para el desarrollo de la práctica

Los materiales relacionados en la tabla 1 corresponden a un grupo de trabajo.


Tabla 1. Material de vidrio y plástico
Material Imagen Cantidad

Asa recta 1

Asa redonda 1

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Frasco lavador 1

Lamina portaobjetos 1

b. Reactivos y medios de cultivo

Tabla 2. Medios de cultivo y reactivos


Reactivos Cantidad*
Cristal violeta
1 frasco gotero
Lugol de Gram 1 frasco gotero
Alcohol acetona 1 frasco gotero
Fucsina de Gram o Safranina 1 frasco gotero
Azul de metileno 1 frasco gotero
Aceite de inmersión 1 frasco gotero

c. Cultivos de microorganismos

Cultivo
Caja de Agar PDA con microorganismos recuperados a partir de la muestra de fruta

Caja de Agar nutritivo con microorganismos recuperados a partir de la muestra de


fruta

5. Instrumental

• Nevera
• Cabina de flujo laminar
• Microscopio óptico

5. Elementos de Protección Individual (EPI) y dispositivos de seguridad

• Bata larga de dril, color blanco, manga larga, de abotonar


• Gafas de seguridad o mono gafas
• Guantes de nitrilo
• Cofia

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• Tapabocas
• Fuente lava ojos
• Ducha de seguridad

6. Condiciones de seguridad

a. Manipulación de cultivos microbianos


• La manipulación de estos cultivos debe realizarse con guantes y tapabocas.
b. Manipulación del mechero.
• Indicaciones de peligro. Combustión, riesgo de quemaduras.
• Consejos de prudencia. No deje el mechero prendido sin supervisión. Mantenga una
distancia prudente para evitar el contacto directo con la llama del mechero.

c. Manipulación de Incubadoras.
• Indicaciones de peligro. Exposición a cultivos de microorganismos que pueden tener
algún nivel de patogenicidad
• Consejos de prudencia. Utilice guantes y tapabocas para ingresar y sacar cultivos de la
incubadora.

7. Procedimientos

a. Alistamiento del material


• Limpie y desinfecte con alcohol al 70% el mesón donde va a trabajar.
• Asegúrese que el material requerido para realizar la práctica esté en el área de trabajo.

b. Caracterización de las colonias bacterianas y de levaduras


• Seleccione las colonias bacterianas y de levaduras a caracterizar. Encierre en un circulo
estas colonias y asigneles un código de identificación.
• Identifique y registre el tamaño de la colonia en milimetros.
• Identifique y registre el color de la colonia.
• Identifique y registre la textura o aspecto de de la colonia como cremosa, seca, mucosa,
brillante, opaca
• Identifique y registre la forma, elevación y borde (margen) de la colonia teniendo en
cuenta la figura 1.

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Figura 1. Morfología de colonias bacterianas.


Tomado dehttp://projectomartin.blogspot.com/2012/12/practica-8_9.html

c. Identificación microscópica de las colonias bacterianas y levaduras


Para la identificación microscópica utilice las mismas colonias seleccionadas previamente para
la caracterización macroscópica.
Realización del frotis
• Limpie con alcohol una lamina porta objetos
• Rotule la lamina con la identificación de la colonia a analizar
• Con ayuda del asas redonda colóque una gota de agua sobre la lámina portaobjetos

• Esterilice un asa recta cerca en el mechero y deje enfriar cerca a este.


• Con el asa recta y cerca al mechero tome una muestra de la colonia y llévela a lala gota de
agua que previamente coloco en la lamina portaobjetos
• Con el asa recta, homogeníce la muestra de la colonia con el agua.
• Deje secar el agua a temperatura ambiente
• Fije lel frotis pasando la lamina 5 veces por la llama azul del mechero.
Tinción de Gram
• Colóque una gota de cristal violeta sobre el frotis realizado previamente y deje actuar por
1 minuto.
• Retire el colorante adicionando agua.
• Adicione una gota de Lugol de Gram y deje actuar por 1 minuto.
• Retire el lugol con agua.

• Adicione una gota de alcohol acetona y deje actuar por 15 segundos.


• Adicione agua para retirar el alcohol acetona.
• Adicione una gota de fucsina de Gram y deje actuar por un minuto

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• Retire el colorante con agua


• Deje secar la lamina
• Lleve la lamina al microscopio y observe en 100X
• Identifique la morfología de las células y clasifíquelas como bacterias negativas, Gram
negativas o levaduras. Tenga en cuenta que las levaduras después de haber sido teñida s
con los corantes de Gram van a presentar color morado, pero esto no significa que sean
Gram positivas. Es impor

d. Lectura y reporte de los resultados

• Terminado el tiempo de incubación, retire las cajas de la incubadora y proceda a realizar el


recuento.
• El recuento puede realizarse de manera manual o con un cuenta colonias.
• Para hacer recuento en agar PDA Seleccione las cajas de Petri que tienen como mínimo 15
colonias y máximo de 150 para hongos y levaduras.
• Para hacer recuento en agar nutritivo seleccione las cajas de Petri que tienen como
mínimo 20 y máximo de 200 colonias de bacterias.
• Descarte las cajas que no se puedan contar y las que no tienen colonias, sin embargo
siempre debe dejar la mejor caja de cada uno de los agares para contar.
• Proceda a realizar el conteo donde cada colonia es una unidad formadora de colonia
(UFC). Realice el recuento en las dos cajas de cada dilución escogida. Promedie el numero
de colonias obtenidas en la misma dilución
• Tome nota de las colonias obtenidas y la dilución utilizada para expresar los resultados

8. Formato para recolección de datos

Registre los datos derivados del ensayo en la tabla 3 y 4

Tabla 3. Formato para registrar los datos derivados de la identificación macroscópica

Características de las colonias


Número de Medio de
Borde o
Colonia cultivo Tamaño Forma Elevación
Margen

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Tabla 4. Formato para registrar los datos derivados de la identificación macroscópica

Características microscópicas
Número de Medio de
Resultado
Colonia cultivo Forma Color Imagen
Gram

9. Cálculos
No aplica

10. Disposición de residuos

Lave los colorantes de Gram sobre la jarra de residuos dispuesta para tal fin.

11. Documentos de referencia

• Pontificia Universidad Javeriana. (2010). Manual de procedimientos del laboratorio de


alimentos.
• Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. (1992). Microbiología. Manual de Métodos Generales (2da
edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela.
• Buckley, D. H., Stahl, D. A., Martinko, J. M., & Madigan, M. T. (2015). Brock, biología de los
microorganismos, 14? edición. Pearson.
• lifeder. (2019). Hongos unicelulares: funciones, usos, reproducción. Obtenido de
lifeder: https://www.lifeder.com/hongos-unicelulares/

13. Anexos
• No aplica.

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