BIOSENSORES AMPEROMETRICOS Y APLICACIONES

Nanomateriales para mejorar la sensibilidad de biosensores y bioanálisis

Durante la última década, varios nanomateriales prometedores (p. Ej., nanopartículas,

nanotubos de carbono (CNT) y grafeno) con superficies modificadas con biomoléculas se han
utilizado ampliamente en los campos de biodetección, bioanálisis y diagnóstico (Kwon et al.,
2015). Por ejemplo

Uno de los primeros nanomateriales que tuvo un impacto en los biosensores amperométricos
fueron los nanotubos de carbono (CNT), que tienen ventajas tales como un tamaño pequeño
con una gran área de superficie, una excelente capacidad de transferencia de electrones y una
fácil inmovilización de biomoléculas. Los electrodos modificados con CNT mejoraron las
densidades de corriente y mejoraron la reactividad de biomoléculas, cofactores redox, y
enzimas redox.

Transductores electroquímicos

Los dispositivos electroquímicos generalmente monitorean la corriente a un voltaje fijo

(amperometría) o al voltaje a corriente cero (potenciometría. Biosensores Amperométricos
fueron el primer tipo que se desarrolló y han estado en utilizar como biosensores de glucosa
por más de 35 años. Estas los dispositivos han seguido siendo los más populares, en gran
medida debido a su simplicidad, facilidad de producción y el bajo costo de los dispositivos e
instrumentos. La señal en los dispositivos amperométricos depende de la tasa de masa
transferir a la superficie del electrodo. Lo más común los dispositivos usados monitorean la
concentración de analito por midiendo la caída en la tensión de O2, la producción de H2O2 o
determinación de la reacción redox de una molécula mediadora (lanzadera de electrones). Un
número grande de mediadores disponibles, pero los más utilizados incluyen ferricianuro de
potasio, tetratiafulvaleno (TTF), tetracianoquinodimetano (TCNQ) y el ferrocenos.
Biosensores basados en Interacciones biocatalíticas (sensores biocatalíticos)

El mercado de biosensores ha sido dominado por muchos años por sensores biocatalíticos
electroquímicos. Los La mayoría de los sensores biocatalíticos se basan en enzimas o sensores
de células enteras. Biosensores enzimáticos amperométricos forman la mayoría de los
biosensores comerciales disponible hoy. En el electrodo enzimático, por ejemplo, una enzima
específica para el sustrato de interés es inmovilizado en la superficie del sensor. La conversión
química del analito se cataliza a medida que entra en la capa enzimática, y el cosustrato o el
producto de la reacción se transduce a una electroquímica señal, que es proporcional a la
concentración de el sustrato. El enfoque biosensor más simple es medir amperométricamente
el agotamiento de oxígeno o producción de peróxido de hidrógeno asociada con las reacciones
que involucran enzimas oxidasa. La combinación de simplicidad, facilidad de fabricación, alta
sensibilidad, disponibilidad y bajo costo de instrumentación es Muy atractivo en este tipo de
dispositivos. Una variedad de enzimas pertenecientes a clases de oxidorreductasas, hidrolasas,
y las liasas se han aplicado en enzimas sensores Estas enzimas pueden actuar sobre los ácidos
grasos, azúcares, aminoácidos, ácidos orgánicos y fenoles. Biosensores basados en el uso de
mediadores redox para transportar los electrones, resultantes de la oxidación catalítica o
reducción del sustrato de interés, al electrodo Ha sido un área de gran interés para muchos
investigadores. Gran parte del trabajo se centra en el uso de redox compuestos mediadores
como ferroceno, TTF, TCNQ, hexacianoferrato (III), azul de metileno, quinonas y sus derivados
Selección cuidadosa del mediador también puede eliminar problemas de interferencia de otras
sustancias en la muestra.

Hasta la fecha, hay varios biosensores exitosos dispositivos en el mercado basados en los
diferentes amperométricos principios de transducción descritos anteriormente. Estas incluir el
analizador de glucosa en sangre mediado por MediSense para aplicación médica y los resortes
amarillos sistemas basados en peróxido de hidrógeno (YSI, amarillo Springs, OH) desarrollado
para uso médico y alimentario análisis y para control de bioprocesos. El YSI El analizador de
bioquímica SELECTTM (Figura 5) puede ser utilizado para el monitoreo de fermentación en
línea o fuera de línea Análisis de muestras para fermentación de alimentos y bebidas. Se
pueden realizar análisis de nutrientes y bioproductos. utilizando el sistema biosensor
incluyendo glucosa,
l-lactato, l-glutamina, l-glutamato, etanol, lactosa, sacarosa, galactosa y metanol. Otros
comercialmente los biosensores disponibles para el análisis de alimentos incluyen; Sensomat
B10, para análisis de alcohol (Gonotec, Alemania); Microzym-L para análisis de lactato (Kalger
GmbH, Alemania) y Glu-11 para análisis de glucosa (TOA Electronics, Japón). Una gama de
biosensores simples y multianalíticos basados en el mismo principio se están desarrollando
para una amplia gama de aplicaciones en la industria alimentaria.

La mayoría de los biosensores desarrollados para la alimentación. Los análisis son sistemas a
base de agua. Fase orgánica electrodos enzimáticos, sin embargo, se han desarrollado para
trabajar en disolventes orgánicos y se han utilizado para análisis de compuestos como
colesterol, alcoholes, peróxidos orgánicos y fenoles. Esta técnica tiene Las ventajas de la
facilidad de preparación de muestras de materiales, como grasas y aceites, y aumento de
enzimas estabilidad. En principio, analitos solubles en sustancias grasas. También se puede
medir con biosensores. Los biosensores enzimáticos también se han aplicado ampliamente a
La detección de compuestos fenólicos. Contaminación por estos compuestos aromáticos
resulta de la producción de drogas, colorantes y antioxidantes y también de la industria del
papel y la pulpa. Enzimas utilizadas en desarrollo de biosensores para este tipo de compuestos
son fenol oxidasas (tirosinasas), lacasas y peroxidasas.
Biosensores Amperométricos

Sinónimos

Sensores bioanalíticos; Biodetectores; Biodispositivos; Biosensores; Sensores electroquímicos;

Electrodos enzimáticos.

Definición

Los biosensores amperométricos son dispositivos integrados independientes, basados en la

medición de la corriente resultante de la oxidación o reducción de un elemento biológico
electroactivo que proporciona Información analítica cuantitativa.

Introducción

Determinar las concentraciones de un analito es esencial para una amplia gama de

aplicaciones, incluidas detección de drogas de alto rendimiento, diagnóstico de enfermedades
y tratamiento, control de calidad y supervisión. La investigación en el campo de los
biosensores, biosensores amperométricos en particular, se inició por Clark, cuyo estudio sobre
el electrodo de oxígeno fue publicado en 1956 (Clark 1956). Desde entonces los biosensores
electroquímicos han sido ampliamente utilizados para determinar las concentraciones de
analito, tanto en investigación y aplicaciones comerciales.

Un biosensor consta de dos elementos estrechamente asociados: un elemento de

reconocimiento biológico y una unidad de conversión de señal, el transductor fisicoquímico,
que eventualmente producen una lectura. Los elementos de reconocimiento biológico
determinan el grado de selectividad o especificidad del biosensor mientras que la sensibilidad
del biosensor está muy influenciada por el transductor. Muchos elementos biológicos
diferentes. incluyendo enzimas, anticuerpos, antígenos, receptores, los orgánulos,
microorganismos y ADN / ARN pueden actuar como el elemento de reconocimiento en un
biosensor; sin embargo, debido a limitaciones de espacio, solo las enzimas redox serán
discutido.

Los biosensores se pueden clasificar según el parámetro que es medido por el transductor del
evento biológico, estos incluyen óptico, electroquímico, acústica, piezoeléctrica y térmica. Más
los biosensores usan detección electroquímica para el transductor debido al bajo costo,
facilidad de uso, portabilidad, y simplicidad de construcción (Eggins 2002). Electroquímica es
una técnica de superficie y ofrece ciertas ventajas para la detección en biosensores. No es así
dependen en gran medida del volumen de reacción, y se pueden utilizar muy pequeños
volúmenes de muestra para la medición. Además, la detección electroquímica no se ve
afectada por componentes de muestra como cromóforos, fluoróforos y partículas que a
menudo interfieren con detección espectrofotométrica. La reacción es resultados
electroquímicamente monitoreados en un medible corriente (amperometría), un potencial
medible (potenciometría) o cambios en las propiedades conductoras del medio
(conductometría).

Entre los biosensores electroquímicos, los más exitosos que han llevado a dispositivos
comerciales son los los basados en el monitoreo de la transferencia de electrones,
perteneciente a la categoría amperométrica.

Biosensores Amperométricos, Fig. 1

Un típico experimento de cronoamperometría que muestra las respuestas de tiempo actuales

de una enzima inmovilizada sobre sucesivas adiciones de su Inserción del sustrato: la curva de
calibración correspondiente.

La señal de estos biosensores es generada por el intercambio de electrones entre el

componente biológico y el electrodo en general, los biosensores amperométricos funcionan
mediante la producción de una corriente cuando se aplica un potencial entre dos electrodos y
el analito sufre o está involucrado en una reacción redox que puede seguirse midiendo la
corriente en una celda electroquímica El analito medido o la biomolécula involucrada con ella
cambia su estado de oxidación en el electrodo. La señal de transferencia de electrones luego
se mide y es proporcional a la cantidad de la especie redox-activa en el electrodo.

En amperometría, los cambios en la corriente generados por la oxidación o reducción

electroquímica son monitoreado directamente con el tiempo, mientras que un potencial
constante se mantiene en el electrodo de trabajo con respecto a un electrodo de referencia
(Bartlett 2008). La técnica es implementada incrementando el potencial directamente al valor
deseado y luego medir la corriente, o mantener el potencial en el valor deseado y fluyendo
muestras a través del electrodo como en inyección de flujo análisis. En todos los casos, la
corriente resultante es proporcional a la concentración de la especie electroactiva en la
muestra.

La técnica electroquímica típica que se realiza cuando se trabaja con biosensores

amperométricos es la cronoamperometría, en la que se mide la corriente. en función del
tiempo, cuando una constante apropiada se aplica el potencial. La figura 1 muestra una curva
estándar obtenido al usar un biosensor amperométrico, en que la corriente varía con la adición
de un compuesto particular (sustrato de una enzima redox) para renderizar un producto
particular que se electrotransforma en el electrodo El cambio actual medido es proporcional a
la cantidad de especies oxidadas / reducidas, que a su vez es directamente proporcional a la
concentración de analito, dependiendo en el formato de ensayo.

Los biosensores amperométricos tienen selectividad adicional en que los potenciales de

oxidación o reducción utilizados para la detección son característicos del componente
biológico o su analito. Ventajosamente, el potencial fijo durante la detección amperométrica
da como resultado una corriente de carga insignificante (la corriente necesaria para aplicar el
potencial al sistema), que minimiza la señal de fondo. Adicionalmente, técnicas
amperométricas hidrodinámicas pueden proporcionar transporte de masa significativamente
mejorado a la superficie del electrodo, por ejemplo, cuando se usa rotación electrodos de
disco, o en condiciones de flujo continuo donde la solución de muestra pasa sobre el
estacionario electrodos.
Biosensores Amperométricos, Fig. 2

Esquema representación de las tres generaciones diferentes de biosensores amperométricos

Tres generaciones principales de biosensores amperométricos

Los biosensores amperométricos se pueden dividir en tres categorías principales según los
diferentes mecanismos del transporte electrónico (Fig. 2):

1. Los biosensores de primera generación se basan en medición de la concentración de

sustratos o productos de la reacción enzimática. La disminución de la concentración del
sustrato o el aumento de la concentración del producto se puede medir por amperometría si
son electroactivos. En la mayoría casos, estos biosensores funcionan midiendo la reducción de
oxígeno o generación de hidrógeno peróxido y por lo tanto oxidasas y deshidrogenasas son las
dos clases principales de enzimas utilizadas en este tipo de biosensores.

Aunque sería deseable electroquímicamente detectar cambios en el sustrato enzimático (el

analito) o en un producto de reacción, desafortunadamente, Esto no siempre es posible. Por
ejemplo, la mayoría los analitos de interés clínico no son sustratos naturales de una enzima
redox. Una variedad de estrategias han sido desarrolladas para superar este problema,
dependiendo de las propiedades químicas del analito. Las últimas estrategias se basan en el
hecho de que es factible transformar una reacción no redox en uno redox, mediante el uso de
enzimas acopladas reacciones (acoplando una reacción donde el analito participa a otro,
produciendo una especie detectable por amperometría). Ejemplos de esto Los tipos de
biosensores amperométricos incluyen creatina, Determinación de urea, lactato y piruvato
(Belluzo et al. 2008).

2. En los biosensores de segunda generación, se agrega un mediador a la configuración que

transporta electrones entre el centro redox de la enzima y el electrodo de trabajo. La mayoría
de las enzimas utilizadas en la tecnología de biosensores tienen su centro redox incrustado en
el núcleo de la proteína, de modo que el sitio activo está aislado eléctricamente. Una forma de
abordare ste problema es mediante el uso de mediadores redox, que lanza los electrones
entre el sitio activo de la enzima y la superficie del electrodo. El mediador más conocido y
ampliamente utilizado es el ferroceno y sus derivados. El biosensor ExacTECH ™ de Abbott-
Medisense aprovecha la última estrategia, utilizando un derivado de ferroceno como mediador
para controlar el nivel de glucosa en sangre (Cass et al. 1984; Hill y Sanghera 1990).
Electroquímica mediada de algunas peroxidasas también se ha informado (Sadeghi et al.
1997). Otros biosensores que usan mediadores solubles para detectar anticuerpos marcadores
de infección, acetilcolina, demanda biológica de oxígeno, así como moléculas simples como el
glutatión, L-alanina, piruvato, lactato y colesterol tienen También se ha informado (revisado en
Chaubey y Malhotra 2002).

3. Los biosensores de tercera generación se basan en la transferencia directa de electrones

entre la enzima y el electrodo y, por lo tanto, evitan la necesidad de mediadores externos. Sin
embargo, como se mencionó anteriormente, generalmente es difícil para las proteínas redox
en solución transferir electrones directamente a los electrodos desnudos. Allí Hay varias
posibles razones para esto. La orientación desfavorable de las moléculas de proteínas en la
superficie del electrodo puede no solo dificultar el intercambio de electrones entre el
electrodo y el centro electroactivo de las proteínas, pero también aumenta la distancia entre el
centro redox y los electrodos y, por lo tanto, disminuye la velocidad de transferencia directa de
electrones. Sin embargo, en los últimos años, se ha logrado la transferencia directa de
electrones para muchas proteínas y enzimas redox mediante diferentes técnicas de
inmovilización (descritas en la siguiente sección), modificación de la superficie de los
electrodos y también ingeniería de proteínas para lograr la orientación más favorable de la
enzima y También para hacer que las superficies de los electrodos sean más compatibles con
las enzimas redox.

electrodo. El electrodo de referencia generalmente se retira más lejos del sitio de la reacción
redox para mantener un potencial de referencia estable. Por otro lado, un sistema de dos
electrodos solo incluye los electrodos de trabajo y de referencia. Si la densidad de corriente es
lo suficientemente baja (<mA cm 2), entonces el electrodo de referencia puede transportar la
carga sin efectos adversos (Ronkainen et al. 2010). Los sistemas de tres y dos electrodos se
utilizan para sensores; sin embargo, generalmente se prefieren dos electrodos debido a los
menores costos de fabricación. Además, estos electrodos se pueden miniaturizar fácilmente

hasta dimensiones en el orden no solo de micrómetros sino también de nanómetros

(Wightman y Wipf 1989). La reducción de las dimensiones del electrodo no solo reduce los
volúmenes de muestra requeridos, sino que también conduce a una mayor sensibilidad y
procesos de fabricación más rentables (Fig. 3). También permite la integración de conjuntos de
sensores con una gran cantidad de sitios de detección y diversas funcionalidades, lo que
permite la capacidad de biorreconocimiento paralelo (Yang et al. 2009). El mini biosensor
resultante combinaría las ventajas de la miniaturización con una precisión de medición
mejorada debido a la reducción de las fuentes de ruido externas. Sin embargo, existen desafíos
en la miniaturización e integración de los biosensores y su electrónica de instrumentación que
aún deben abordarse.

electrodo. El electrodo de referencia generalmente se retira más lejos del sitio de la reacción
redox para mantener un potencial de referencia estable. Por otro lado, un sistema de dos
electrodos solo incluye los electrodos de trabajo y de referencia. Si la densidad de corriente es
lo suficientemente baja (<mA cm 2), entonces el electrodo de referencia puede transportar la
carga sin efectos adversos (Ronkainen et al. 2010). Los sistemas de tres y dos electrodos se
utilizan para sensores; sin embargo, generalmente se prefieren dos electrodos debido a los
menores costos de fabricación. Además, estos electrodos se pueden miniaturizar fácilmente

Configuración electroquímica

Los sensores electroquímicos consisten en dos o tres electrodos. Una celda electroquímica
típica de tres electrodos consiste en un electrodo de trabajo de un material conductor, como
platino, oro o carbono; un electrodo de referencia, que generalmente consiste en metal
plateado recubierto con una capa de cloruro de plata (Ag / AgCl) o electrodo de calomel
saturado (SCE) basado en la reacción entre mercurio / Hg2Cl2; y un contador de alambre de
platino hasta dimensiones en el orden no solo de micrómetros sino también de nanómetros
(Wightman y Wipf 1989). La reducción de las dimensiones del electrodo no solo reduce los
volúmenes de muestra requeridos, sino que también conduce a una mayor sensibilidad y
procesos de fabricación más rentables (Fig. 3). También permite la integración de conjuntos de
sensores con una gran cantidad de sitios de detección y diversas funcionalidades, lo que
permite la capacidad de biorreconocimiento paralelo (Yang et al. 2009). El mini biosensor
resultante combinaría las ventajas de la miniaturización con una precisión de medición
mejorada debido a la reducción de las fuentes de ruido externas. Sin embargo, existen desafíos
en la miniaturización e integración de los biosensores y su electrónica de instrumentación que
aún deben abordarse.

Componente biológico del biosensor: selectividad / especificidad

El componente biológico es responsable de la selectividad / especificidad del biosensor y, en

teoría, puede usarse cualquier biomolécula biológica o derivada biológicamente. Como se
mencionó anteriormente, se pueden usar diferentes componentes biológicos que incluyen
enzimas, anticuerpos, antígenos, receptores, orgánulos, microorganismos y ADN / ARN para
lograr la selectividad deseada, de acuerdo con la naturaleza del analito. Aunque se pueden
usar muchos tipos de elementos biológicos en los dispositivos biosensores, los biosensores
electroquímicos usan principalmente enzimas debido a su notable especificidad por sus
sustratos naturales.

Componente del transductor del biosensor: sensibilidad

Mejorar la sensibilidad de cualquier método analítico significa aumentar la relación señal /

ruido. Se pueden seguir dos rutas obvias: aumentar la señal o reducir el ruido. En los
biosensores amperométricos, se puede mejorar la relación señal / ruido aumentando el
número de electroactivos.

Biosensores amperométricos, Fig. 3

Una célula microfluídica que integra un electrodo de trabajo de oro y un contador combinado
de carbón serigrafiado y electrodos de referencia Ag / AgCl. (a) Sección transversal de la celda
con microcanales de entrada y salida. (b) Microscopía de fuerza atómica en modo de
derivación de una enzima inmovilizada en el electrodo de trabajo de oro: imagen 2D grabada
en agua (izquierda), vista 3D de proteínas individuales (centro) y perfil de sección transversal
de proteína única (derecha). (c) Representación general del sistema de detección
amperométrica

Los biosensores amperométricos constituyen un campo interdisciplinario que actualmente es

una de las áreas de investigación más activas. Aunque hay mucha literatura sobre estudios en
los que estos biosensores han sido exitosos ideado para medir compuestos específicos de
interés, sin embargo, hasta el día de hoy, la traducción del laboratorio a la industria ha sido
muy lenta. El cuello de botella en la realización del último paso parece deberse principalmente
a los problemas de estabilidad y actividad de las enzimas después de la inmovilización en la
superficie del electrodo, que por supuesto es el paso fundamental en el desarrollo de
biosensores electroquímicos. Los investigadores continúan sus esfuerzos para superar la
dependencia de la actividad / estabilidad enzimática de las condiciones de la solución, como la
temperatura, el pH, la fuerza iónica y la composición del tampón mediante ingeniería de
proteínas. Finalmente, se espera que los avances en los campos de investigación de ingeniería
de proteínas, nanotecnología y nanomateriales de biosensores ayuden enormemente a
abordar los desafíos actuales y futuros en el desarrollo de nuevas tecnologías para biosensores
amperométricos en diagnóstico clínico, detección de drogas de alto rendimiento, control de
calidad, monitoreo ambiental y control de seguridad.