U 250973

IQ-2004-I-23
ANÁLISIS Y VALIDACIÓN DE UN MODELO MATEMÁTICO PARA EL

CRECIMIENTO MICROBIAL DEL Bacillus thuringiensis subespecie. Kurstaki POR
EL MÉTODO DE FERMENTACIÓN FED-BATCH CONTINUO
CAROLINA ANDREA ZERDA MÉNDEZ
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTÁ, D.C
2004
IQ-2004-I-23
ANÁLISIS Y VALIDACIÓN DE UN MODELO MATEMÁTICO PARA EL

CRECIMIENTO MICROBIAL DEL Bacillus thuringiensis subespecie. Kurstaki POR
EL MÉTODO DE FERMENTACIÓN FED-BATCH CONTINUO
CAROLINA ANDREA ZERDA MÉNDEZ
Propuesta de Proyecto de Grado para optar el título en Ingeniero Químico
Director
CARLOS ANDRÉS GARNICA VALENZUELA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTÁ, D.C
2004
2
IQ-2004-I-23
Nota de Aceptación
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
Asesor
__________________________________
Jurado
__________________________________
Jurado
Bogotá, 23 de julio de 2004
3
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A Dios,
A mis Padres y Hermanos,
Gracias por haberme brindado esta

oportunidad.
Gracias por su apoyo y confianza en este largo

y maravilloso proceso que acabo de culminar.
Carolina A. Zerda Méndez.
4
IQ-2004-I-23
AGRADECIMIENTOS
Deseo agradecer a todos mis profesores, amigos y compañeros que me han acompañado a
lo largo de este proceso de aprendizaje, gracias por sus enseñanzas y buenos consejos.
Especialmente a:
Fernando Torres Jiménez, Ingeniero Químico e Industrial, por ser tan buen amigo, por estar
siempre conmigo en las buenas y en las malas, apoyándome y ayudándome, gracias a sus
valiosos aportes y conocimientos, este Proyecto de Grado pudo culminar con éxito.
Fabio Andrés Díaz, Ingeniero Industrial, gracias por su invaluable asesoría y colaboración
en la parte de simulación y análisis de este Proyecto de Grado, gracias por brindarme su
amistad y apoyo.
José María Robles y el personal del CITEC1, gracias por su disposición y amable
colaboración durante el proceso de experimentación.
Y Carlos Garnica, Ingeniero Químico, gracias por su colaboración.
1
Centro de Innovación y desarrollo Tecnológico de la Universidad de los Andes.
5
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TABLA DE CONTENIDO
Pag.
INTRODUCCIÓN 1
OBJETIVOS 3
1. BACILLUS THURINGIENSIS: INSECTICIDA MICROBIAL 4

1.1. MARCO HISTÓRICO 4
1.2. GENERALIDADES 5
1.3. CICLO DE VIDA 5
1.3.1. FISIOLOGÍA DE LA FERMENTACIÓN 6
1.3.1.1. Metabolismo del Carbón 6
1.3.1.2. Fuente de Nitrógeno 6
1.3.2. ESPORULACIÓN Y FORMACIÓN DE PROTEÍNA TÓXICA 7
1.3.2.1. Toxinas Producidas por el BT y su modo de acción. 7
1.4. PRODUCCIÓN COMERCIAL 9
2. CRECIMIENTO DE BIOMASA DEL CULTIVO 10

2.1. ETAPAS DEL CRECIMIENTO MICROBIAL 10
2.2. CINÉTICA DEL CRECIMIENTO MICROBIAL. 11
2.2.1. VELOCIDAD ESPECÍFICA 11
3. METODOLOGÍA 13
3.1. MODO DE OPERACIÓN 14
3.1.1. FERMENTACIÓN “BATCH” 14
3.1.2. FERMENTACIÓN “FED-BATCH” 14
3.1.2.1. Ventajas y desventajas de una producción Fed-Batch. 15
3.1.2.2. Estrategias de alimentación 15
3.2. FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL PROCESO DE FERMENTACIÓN 16
3.2.1. TEMPERATURA 17
3.2.2. pH. 17
3.2.3. TRANSFERENCIA DE OXÍGENO 17
3.2.4. CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA Y MODO DE ALIMENTACIÓN 18
EN EL FLUJO DE ALIMENTACIÓN.
4. DISEÑO DE EXPERIMENTOS 20
4.1. MODELO DE REGRESIÓN LINEAL 20
4.2. FORMULACIÓN DE HIPÓTESIS. 21
4.3. SELECCIÓN DE FACTORES Y NIVELES. 22
4.4. SELECCIÓN DE LA VARIABLE DE RESPUESTA 22
4.5. SELECCIÓN DEL DISEÑO DE EXPERIMENTO. 23
4.5.1. PROYECCIÓN DE FRACCIÓN EN FACTORIALES. 23
4.5.1.1. Diagrama del diseño de experimentos 24
5. MODELO MATEMÁTICO 25
5.1. CRECIMIENTO CELULAR 25
5.1.1. CRECIMIENTO CON SUSTRATO LIMITADO 25
5.1.1.1. Modelo Monod: 26
5.1.1.2. Crecimiento Celular y utilización del sustrato 27
6
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5.2. EFECTOS DEL METABOLISMO ENDÓGENO 28

5.3. TRANSFERENCIA DE OXÍGENO. 28
5.4. BALANCE DE MASA GENERAL 29
6. RESULTADOS 30
6.1. RESULTADOS EXPERIMENTALES DE LAS FERMENTACIONES. 30
6.2. CONCENTRACIÓN FINAL DE ESPORAS 35
6.3. VARIABLE DE RESPUESTA DEL COMPORTAMIENTO MICROBIAL 35
6.4. RESULTADOS DE LA SIMULACIÓN 36
6.4.1. VARIABLES DE LA SIMULACIÓN 36
6.4.2. SIMULACIÓN PARA FERMENTACIÓN FED- BATCH CON FLUJO 37
DE ALIMENTACIÓN CONSTANTE
6.4.3. SIMULACIÓN PARA FERMENTACIÓN FED- BATCH CON FLUJO 38
DE ALIMENTACIÓN ESCALONADO.
6.4.4. SIMULACIÓN DEL OXIGENO DISUELTO 40
7. ANÁLISIS DE RESULTADOS 41
7.1. ANÁLISIS DE RESULTADOS DE LA PRESENCIA DE PROTEÍNA 41
7.2. ANÁLISIS DE VARIANZA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS 42
7.2.1. ANOVA DE CANTIDAD DE ESPORAS 42
7.2.2. ANOVA DE LA TASA DE CRECIMIENTO 44
7.3. RELACIÓN ENTRE LA PRODUCCIÓN FINAL DE ESPORAS Y LA DE 47
BIOMASA.
7.4. DATOS COMPARATIVOS ENTRE DIVERSOS MODELOS. 48
7.5. PRUEBAS AL MODELO SIMULADO 49
7.5.1. ANÁLISIS DE SENSIBILIDAD 50
7.5.2. ANÁLISIS DIMENSIONAL 55
7.5.3. PRUEBAS DE REPRODUCCIÓN DEL COMPORTAMIENTO 57
7.5.4. ADECUACIÓN DE LOS LÍMITES 61
7.5.5. ERRORES DE INTEGRACIÓN 62
65
CONCLUSIONES
67
BIBLIOGRAFÍA
7
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ILUSTRACIONES
Ilustración 1. Ciclo de vida del BT 6

Ilustración 2. Producción del Bacillus thruringiensis mediante el proceso de fermentación. 9
Ilustración 3. Etapas del crecimiento Microbial 10
Ilustración 4. Reactor bien mezclado 13
Ilustración 5. Grafica del comportamiento microbial, consumo de glucosa y Oxígeno
disuelto con respecto al tiempo (Fermentación I) 30
disuelto con respecto al tiempo (Fermentación II) 31
disuelto con respecto al tiempo (Fermentación III) 31
disuelto con respecto al tiempo (Fermentación IV) 32
disuelto con respecto al tiempo (Fermentación V) 32
disuelto con respecto al tiempo (Fermentación VI) 33
disuelto con respecto al tiempo (Fermentación VII) 33
disuelto con respecto al tiempo (Fermentación VIII) 34
Ilustración 13. Gráfica de aumento de volumen con flujo de alimentación constante (F=
0.04 L/h) 37
Ilustración 14. Consumo de glucosa y crecimiento microbial a flujo constante 38
Ilustración 15. Aumento de volumen a flujo escalonado (F1: 0.04 L/h y F2: 0.07 L/h) 38
Ilustración 16. Flujo escalonado (F1: 0.04 L/h y F2 : 0.07 L/h) 39
Ilustración 17. Consumo de glucosa y crecimiento microbial a flujo escalonado 39
Ilustración 18. Comportamiento del oxígeno en función del tiempo 40
Ilustración 19. Resultado de la electroforesis. 41
Ilustración 20. Gráfica de contorno 46
Ilustración 21. Análisis Gráfico comparativo del comportamiento microbial, según su factor
de relevancia C, Rojo: [Fermentación V, VI, VII] y Azul [Fermentación I, II, III, IV]
46
Ilustración 22. Análisis Gráfico comparativo del comportamiento microbial, según su factor
de relevancia D Rojo: [Fermentación VI, VII] y Azul [Fermentación V, VIII] 47
Ilustración 23 Comportamiento de la biomasa para un µ máx. para valores de µ máx. de 1)
0.17 2) 0.21 3) 0.25 4) 0.3 50
Ilustración 24 Comportamiento de la biomasa para un Y x/s para valores de Y x/s de 51
Ilustración 25. Comportamiento del Sustrato para un Y x/s para valores de Y x/s de 52
Ilustración 26. Comportamiento de sustrato para valores de Si de 52
8
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Ilustración 27. Comportamiento del coeficiente volumétrico de transferencia de masa KLa

(h-1), para valores de 53
Ilustración 28. Comportamiento de Crecimiento Microbial y del Sustrato para un Y x/s de
0.7 54
Ilustración 29. Comportamiento del Crecimiento Microbial y del sustrato para un Y x/s de
0.44 55
Ilustración 30. Comportamiento del Crecimiento Microbial y del sustrato para un Y x/s de
0.2 55
Ilustración 31. Comparación del OD teórico y el OD experimental 58
Ilustración 32. Comparación de la Biomasa (Valores Teóricos y Reales) frente a flujos
constantes. 59
Ilustración 33. Comparación del sustrato experimental y el sustrato simulado frente a flujos
constantes. 59
Ilustración 34. Comparación valores experimentales de la biomasa versus valores
esperados de la biomasa 60
Ilustración 35. Comparación del comportamiento del sustrato entre los datos simulados y
los valores experimentales 60
Ilustración 36. Comparación de la Biomasa para diferentes métodos de integración 63
Ilustración 37. Comparación del Sustrato para diferentes métodos de integración 63
Ilustración 38. Comparación del Oxígeno Disuelto para diferentes métodos de integración
64
Ilustración 39. Gráfica de la tasa específica de crecimiento contra la concentración de
sustrato, S 79
Ilustración 40. Interacción de los diferentes dlementos del modelo 110
Ilustración 41. Definición del Modelo 110
9
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TABLAS
Tabla 1. Aplicaciones de Bacillus thuringiensis (BT). 4

Tabla 2. Variables del proceso de Fermentación Fed batch Continuo. 17
Tabla 3. Factores y Niveles del diseño de Experimentos 22
Tabla 4. Variables de Respuesta 23
Tabla 5. Diagrama del Diseño de experimentos 24
Tabla 6. Balance de Masa para una Fermentación Fed-batch continua 29
Tabla 7. Concentración Final de Esporas (UFC/ml) 35
Tabla 8. Variable de respuesta del Crecimiento microbial 36
Tabla 9. Variables para una Fermentación Batch 36
Tabla 10. Resultados del diseño de experimentos en términos de producción final de
Esporas UFC/ml 42
Tabla 11. ANOVA de la producción final de esporas (UFC/ml). 42
Tabla 12. ANOVA de la producción Final de esporas (UFC/ml). 43
Tabla 13. ANOVA de la producción Final de esporas (UFC/ml). 43
Tabla 14. Relación entre la agitación y la producción de esporas 43
Tabla 15. Resultados del diseño de experimentos en términos de la Biomasa 44
Tabla 16. ANOVA del crecimiento microbial. 44
Tabla 19 . Datos comparativos entre la producción final de esporas (UFC/mL) y Biomasa
(g/L). 48
Tabla 20. Análisis comparativo de producción de esporas 49
Tabla 21. Contenido de Aminoácidos (en mmoles/10mg del extracto de levadura) 70
Tabla 22. Medio de Cultivo 71
Tabla 23. Porcentaje del medio de cultivo 72
Tabla 24. medio de cultivo LB 72
Tabla 25. Patrones estándares de proteína 76
Tabla 26 . Densidad del agua 77
Tabla 27. Constante de Henry 77
Tabla 28. Condiciones para la Fermentación I 81
Tabla 29. Datos de Oxígeno disuelto, pH y Biomasa para la Fermentación I 82
Tabla 30. . Datos de la Biomasa para la Fermentación I 82
Tabla 31. Datos de consumo de glucosa para la Fermentación I 83
Tabla 32. Síntesis de datos para la Fermentación I 83
Tabla 33. Conteo de esporas para la Fermentación I 83
Tabla 34. Condiciones para la Fermentación II 84
Tabla 35. Datos de Oxígeno disuelto, pH y Biomasa para la Fermentación II 85
Tabla 36. Datos de la Biomasa para la Fermentación II 86
Tabla 37. Datos de la Biomasa para la Fermentación II 86
Tabla 38. Síntesis de datos para la Fermentación II 86
10
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Tabla 39. Conteo de esporas para la Fermentación II 86

Tabla 40. Condiciones para la Fermentación III 87
Tabla 41. .Datos de Oxígeno disuelto, pH y Biomasa para la Fermentación III 88
Tabla 42. Datos de la Biomasa para la Fermentación III 88
Tabla 43. Datos de la Biomasa para la Fermentación III 89
Tabla 44. Síntesis de datos para la Fermentación III 89
Tabla 45. Conteo de esporas para la Fermentación III 89
Tabla 46. Condiciones para la Fermentación IV 90
Tabla 47. Datos de Oxígeno disuelto, pH y Biomasa para la Fermentación IV 91
Tabla 48. Datos de la Biomasa para la Fermentación IV 92
Tabla 49. Datos de la Biomasa para la Fermentación VI 92
Tabla 50. Síntesis de datos para la Fermentación IV 92
Tabla 51. Conteo de esporas para la Fermentación IV 93
Tabla 52. Condiciones para la Fermentación V 94
Tabla 53. Datos de Oxígeno disuelto, pH y Biomasa para la Fermentación V 95
Tabla 54. Datos de la Biomasa para la Fermentación V 95
Tabla 55. Datos de la Biomasa para la Fermentación V 96
Tabla 56. Síntesis de datos para la Fermentación V 96
Tabla 57. Conteo de esporas para la Fermentación V 96
Tabla 58. Condiciones para la Fermentación VI 97
Tabla 59. Datos de Oxígeno disuelto, pH y Biomasa para la Fermentación VI 98
Tabla 62. Síntesis de datos para la Fermentación VI 99
Tabla 63. Conteo de esporas para la Fermentación VI 99
Tabla 64. Condiciones para la Fermentación VII 100
Tabla 65. Datos de Oxígeno disuelto, pH y Biomasa para la Fermentación VII 101
Tabla 66. Datos de la Biomasa para la Fermentación VII 102
Tabla 67. Datos de la Biomasa para la Fermentación VII 102
Tabla 68. Síntesis de datos para la Fermentación VII 102
Tabla 69. Conteo de esporas para la Fermentación VII 102
Tabla 70. Condiciones para la Fermentación VIII 103
Tabla 71. Datos de Oxígeno disuelto, pH y Biomasa para la Fermentación VIII 104
Tabla 72. Datos de la Biomasa para la Fermentación VIII 104
Tabla 73. Datos de la Biomasa para la Fermentación VIII 105
Tabla 74. Síntesis de datos para la Fermentación VIII 105
Tabla 75. Conteo de esporas para la Fermentación VIII 105
Tabla 76. Datos para una fermentación Fed-Batch Escalonada (Fermentación (VII) 106
Tabla 77. Datos para una fermentación Fed-Batch Constante (Fermentación III) 107
Tabla 78. Datos del Oxígeno Disuelto 108
11
IQ-2004-I-23
LISTAS DE ANEXOS
Anexo A. MEDIO DE CULTIVO 70

Anexo B. METODOLOGÍAS PARA LOS PARÁMETROS DE EVALUACIÓN 73
Anexo C. CALCULO DE CONSTANTES 77
Anexo D. METODOLOGÍA DE LA FERMENTACIÓN 80
Anexo E. TABLAS DE DATOS 81
Anexo F. TABLA DE DATOS DE LA SIMULACIÓN 106
Anexo G. LENGUAJE DEL PROGRAMA 109
12
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INTRODUCCIÓN
Los agricultores tienen la necesidad de utilizar medios efectivos para la protección de los
cultivos contra los insectos plagas, los cuales causan pérdidas millonarias todos los años a
través de todo el mundo.
Tradicionalmente, el empleo de plaguicidas químicos ha solucionado estos problemas de

forma relativamente fácil, sin embargo la lucha química, aunque efectiva tiene algunos
inconvenientes, y gran cantidad de efectos colaterales como el desarrollo de inmunidad a
los agentes químicos, la afectación de los depredadores naturales de las plagas, y efectos de
intoxicación que se transmiten alrededor de toda la cadena alimenticia.
Frente a este panorama se ha optado por desarrollar bioplaguicidas, que usan a los
depredadores naturales de las plagas contra estas, en vez de hacer uso de agentes químicos.
Los bioplaguicidas se producen y emplean con eficacia a partir de diferentes especies de

hongos, algunos virus y bacterias principalmente de la especie Bacillus thuringiensis (BT).
El Bacillus thuringiensis (BT) es una bacteria que al desarrollar esporas y por ende toxinas
proteicas, se convierte en un biopesticida microbial utilizado en la agroindustria, y su uso
permite el control de plagas en cultivos intensivos.
En la actualidad los productos de BT representan más del 90% de los bioplaguicidas que se
comercializan. Su producción industrial está concentrada en un número reducido de
grandes firmas que controlan el mercado mundial. Abbot de Estados Unidos, Sandoz de
Suiza y Novo Nordisk de Dinamarca, abarcan más del 75% de todos los productos.
Durante años, se han dedicado esfuerzos no sólo en estudiar su actividad sobre insectos, en
especial los lepidópteros, sino en desarrollar métodos de fabricación, que aumenten de
alguna manera su productividad y así mismo generen un margen de rentabilidad. En la
actualidad el método de producción se realiza con el sistema tradicional operación por lotes
o “batch
Buscar alternativas diferentes a la tradicional, tales como la operación con flujo de

alimentación fed-batch continuo y discontinuo, han resultado ser muy efectivas al nivel de
laboratorio.
En el futuro la industrialización del pesticida y el desarrollo de un producto basado en los

conceptos y aplicabilidades de la biotecnología agrícola que remplace a los productos
químicos, será de gran importancia; pero para esto será vital ser capaces de dimensionar y
IQ-2004-I-23
predecir el comportamiento de las variables que participan en el proceso de fabricación y

de esta forma encontrar una alternativa biológica como lo es esta bacteria, caracterizada por
su alta especificidad, estabilidad, biodegradabilidad, de actividad rápida y baja toxicicidad
para animales mamíferos.
El presente documento tiene como objetivo sintetizar la investigación realizada para

simular y validar un modelo matemático que describa el comportamiento de un sistema en
crecimiento para la bacteria, por el método de fermentación fed-batch continuo.
Para tal efecto, se identificaron las variables que participan en el proceso de fermentación,
se diseño el experimento que permitiera su evaluación y posteriormente se desarrolló el
modelo matemático para cuantificar y validar el mencionado proceso.
2
IQ-2004-I-23
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Desarrollar y validar un modelo matemático que describa el comportamiento de un

sistema en crecimiento de Bacillus thuringiensis por el método de fermentación fed-
batch continuo.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Estudiar que implicaciones tienen en el proceso de fermentación -

esporulación variables como la cantidad de nutrientes, el oxigeno disuelto
requerido, el flujo de aire, la temperatura de crecimiento y el pH.
• Elaborar un adecuado diseño de experimentos que permita validar de manera

óptima los resultados obtenidos por el modelo para una alimentación Fed-Batch
continua.
• Plantear un modelo matemático donde se incluyan variables del sistema

necesarias para una adecuada implementación de un simulador.
• Identificar los niveles críticos de las variables del proceso y así mismo
determinar los efectos de éstas, sobre el proceso en cuanto al crecimiento celular y
síntesis de toxinas proteicas se refiere.
3
IQ-2004-I-23
1. BACILLUS THURINGIENSIS: INSECTICIDA MICROBIAL
1.1. MARCO HISTÓRICO
La bacteria Bacillus thuringiensis (BT) fue descubierta en el año de 1901 por S. Ishiwata en
Japón, al intentar aislar a un organismo llamado Bacillus sotto, causante del ablandamiento,
flacidez y ennegrecimiento en la producción de gusano de seda (Bombix mori). Sin
embargo fue en 1911, cuando E.Berliner aisló un Bacillus similar al B. sotto de la larva de
la polilla de harina del mediterráneo al cual llamó Bacillus thuringiensis.
A partir de este descubrimiento, se han realizado numerosos estudios acerca de la influencia

patógena y la baja actividad en el desarrollo de larva, que ejerce esta bacteria sobre los
lepidópteros (mariposas y polillas), los dípteros (voladores y mosquitos) y coleópteros
(escarabajos).
Hoy en día esta bacteria se ha posicionado dentro del mercado de los insecticidas, como
biopesticida, el cual ha sido aplicado exitosamente en una gran variedad de cosechas,
incluyendo vegetales, algodón, maíz, papa, entre otros.
Insectos Cosechas y productos

Pieris brassicae (mariposa blanca) Vegetales
Pieris rapae (col importada) Vegetales
Plutella masculipennis (polilla negra) Vegetales
Tichoplusia ni (col) Vegetales, tabaco, algodón.
Heliothis virescens (gusano del tabaco) Algodón, tabaco
Heliothis zea (gusano del algodón) Algodón, tabaco
Ostrinia nubilalis (borer maíz europeo) Maíz
Manduca sexta (gusano del tabaco) Tabaco
Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de papa) Papa
Lymantia dispar (polilla gitana) Bosques
Choritoneura fumiferana Bosques
Malacosoma disstria Bosques
Denrolimus sibiricus (gusano de seda siberiano) Bosques
Plodia interpunctella (polilla india) Productos almacenados
Anagasta kübniella (polilla de harina mediterránea) Productos almacenados
Ephestia cautella (polilla de almendra) Productos almacenados
Culex spp., Aedes spp. (especies de mosquito) Malaria diseminada, fiebre amarilla y
dengue
Simulium spp. (especies de volador negro) Onchoceriasis diseminada
Tabla 1. Aplicaciones de Bacillus thuringiensis (BT). 2
2
Tomado de GLAZER, Microbial Biotechnology: Fundamentals and Applied Microbiology, 1995
4
IQ-2004-I-23
1.2. GENERALIDADES
Las bacterias de la familia Bacillaceae se caracterizan porque todas forman esporas en su

proceso metabólico (Glazer, 1995). Esta familia está compuesta por dos géneros Bacillus y
Clostridium. Las especies Bacillus son aeróbicas o facultativamente anaeróbicas mientras
que las del Clostridium son anaeróbicas (Glazer, 1995).
Todas las bacterias formadoras de esporas producen endoesporas, que les permiten persistir
en un estado quiescente fuera del huésped. Una vez que el huésped susceptible ingiere las
esporas éstas germinan en el intestino. Las esporas germinadas entran a la cavidad
hemocélica donde se multiplican rápidamente, destruyen ciertos tejidos y pronto llenan
gran parte de la cavidad. Este estado de la infección se conoce como “septicemia”, donde
con anterioridad a la muerte del huésped, se forman esporas refráctiles de paredes gruesas,
que aparentan un color blanco a través del intestino y de aquí se deriva el nombre de
enfermedades lechosas. Después de la muerte el huésped se desintegra y las esporas son
liberadas en el suelo (Butillo, 1978).
1.3. CICLO DE VIDA
Los diversos componentes de la célula Bt y su ciclo de vida se esquematizan en la Figura 1.

Bajo condiciones favorables las esporas germinan y forman células vegetativas, las cuales
se dividen por mitosis produciendo más células; al cabo de un tiempo sufren cambios en su
metabolismo y dan origen a la endoespora y al cristal proteináceo o delta-endotoxina. La
producción del cristal en bacterias de colonias mantenidas en platos de Agar a 24ºC se
obtiene al cabo de 10 días de incubación. Posterior a la producción del cristal ocurre la lisis
o disolución de la pared celular para dejar libre las esporas y los cristales.
5
IQ-2004-I-23
Ilustración 1. Ciclo de vida del BT3
1.3.1. FISIOLOGÍA DE LA FERMENTACIÓN
Las investigaciones de la optimización-fermentación, envuelven tanto los nutrientes

requeridos, como la inhibición metabólica, y a su vez parámetros del proceso tales como el
oxígeno requerido, Crecimiento, temperatura, entre otros.
1.3.1.1.Metabolismo del carbón
Luthy (Luthy P, 1982) y Bulla (Bulla Jr, 1980) demostraron que la glucosa fue asimilada a
través del mecanismo Embden-Meyerhof- Parnas. Subsecuentemente, el ciclo del ácido
tricarboxílico, resulto ser el mejor mecanismo para la asimilación y provisión de energía
para el crecimiento y la esporulación. El acetato es acumulado durante la fase de
crecimiento exponencial y este mismo comienza a ser asimilado mientras todavía hay un
bajo nivel de glucosa.
Algunas fuentes de carbono que pueden ser utilizadas además de la glucosa son la
fructuosa, sucrosa, lactosa, etc. Sin embargo, la más utilizada a nivel industrial debido a los
bajos costos y grandes cantidades existentes en el mercado es la glucosa.
1.3.1.2.Fuente de Nitrógeno
Los compuestos de amonio inorgánico (tales como (NH4)2SO4) no son suficientes para
soportar el crecimiento. Las fuentes orgánicas como complejos orgánicos son generalmente
requeridas para un crecimiento rápido. Siempre y cuando estas contengan porciones de
3
Adaptado por El Algodonero, 1977, pág. 16.
6
IQ-2004-I-23
varios aminoácidos, ya que estos juegan un papel determinante en la producción de BT y de

proteína tóxicas.
1.3.2. ESPORULACIÓN Y FORMACIÓN DE PROTEÍNA TÓXICA
La esporulación del BT, se inicia por la inhibición de ciertos nutrientes. Sakharova y otros
(Sakharova et al, 1984) investigaron la limitación de sustrato, a partir de los siguientes
compuestos: glucosa, extracto de levadura, PO43-, Mg2+ y K+. Ellos encontraron que la
reducción de cualquiera de ellos iniciaba la esporulación, en especial la fuente de nitrógeno.
1.3.2.1.Toxinas Producidas por el BT y su modo de acción.
Además del cristal proteína el BT produce como mínimo dos sustancias proteicas a los
insectos (Yang, 1998):
BT α - exotoxina: conocida como lecitinasa C, fosfolipasa C.

BT β - exotoxina: Conocida en la literatura como exotoxina; el factor mosca; la toxina
termoestable de la mosca; el factor de McConnell y Richard; la exotoxina termoestable.
BT ϕ - exotoxina: Es una enzima no identificada, diferente a fosfolipasa C que ataca
fosfolipidos in vitro.
BT δ - endotoxina: Conocida como endotoxina ó cristal; el cristal proteínaceo; el cuerpo
paraesporal cristalino.
A continuación se discutirá separadamente los aspectos más importantes de cada una de

estas toxinas.
BT α - exotoxina
Es una enzima producida por las células en crecimiento, este enzima destruye fosfolípidos
esenciales en las células de los insectos. Estudios histológicos en algunos insectos sugieren
que el daño ocurre en células del intestino medio y otros tejidos del cuerpo (compuestos
parcialmente de fosofolípidos) (Yang, 1998).
La bacteria debe crecer en el intestino del insecto para secretar estas enzimas, siempre y
cuando el intestino del insecto tenga un pH inferior a 9.0, es decir que no sea muy básico.
Sin embargo, el crecimiento de la bacteria es posible cuando ocurre un cambio de pH
debido a la ingestión del cristal o δ - endotoxina.
BT β - exotoxina
Es una molécula pequeña, la cual es estable al calor ya que resiste al autoclave a 120 ºC
durante 15 minutos. Esta toxina es secretada afuera de la célula bacterial en el medio del
7
IQ-2004-I-23
cultivo durante la fase activa del crecimiento vegetativo. Inicialmente se observó que era
efectiva contra los insectos del orden díptero, sin embargo, se ha determinado que es tóxica
también para insectos lepidópteros, hymenópteros, coleópteros y orthópteros. Su rango de
huéspedes es más amplio que el de la δ - endotoxina (Harper, 1974).
BT ϕ - exotoxina
No se ha determinado con precisión la naturaleza de esta exotoxina. Se ha observado

cuando la bacteria crece en un medio con agar4, se produce un aro de aclaramiento5 del
medio alrededor de las colonias. Sin embargo su toxicidad en insectos no ha sido
demostrada (Harper, 1974).
BT δ - endotoxina
Esta fue reconocida por Hanney (1953), quien descubrió que al momento de la
esporulación, la célula produce a un lado de la endoespora, una proteína cristalizada que es
tóxica a la mayoría de los lepidóteros Este cristal paraesporal se compone de una subunidad
sencilla de glicoproteínas con un peso molecular aproximadamente de 1.2 x 105 gramos.
Las larvas susceptibles tienen en su intestino la combinación necesaria de pH, sales y

enzimas suficientes para descomponer y activar los cristales altamente insolubles del BT.
El pH alcalino en el intestino (superior a 7.0) causa la disolución de los cristales en sus
componentes tóxicos. El cristal una vez descompuesto en moléculas más pequeñas ataca las
células del intestino medio del insecto. En ese momento ocurren inestabilidades osmóticas
que destruyen las células, ocasionando un escape del contenido alcalino del intestino hacia
la cavidad hemocélica del insecto (Hanney, 1953).
En algunas ocasiones, el contenido alcalino es tan severo para matar las larvas y ocasionar
cambios dentro de estas, permitiendo el crecimiento del BT hasta causar una infección. El
daño del intestino ocasiona también un cese en la alimentación del insecto que junto con la
infección, generalmente, matan al insecto al cabo de unos cuatro días, dependiendo de la
especie, su estado de desarrollo y las condiciones ambientales (Hanney, 1953).
Los cristales que contienen la δ - endotoxina son producidos en las células vegetativas que
esporulan. La proteína del cristal aparece al mismo tiempo que el cristal y esta formada por
aminoácidos que resultan del proceso metabólico que ocurre en esta etapa de esporulación
de la célula bacterial. Este cristal tóxico tiene la forma de octaedro; sin embargo, se pueden
encontrar formas triangulares o cúbicas, esta formada por 18 aminoácidos, como el ácido
aspártico y el ácido glutámico constituyendo alrededor del 30 % de los aminoácidos
4
Agar un medio de cultivo
5
Como analogía se puede imaginar una yema de huevo separada de su clara, es decir en este caso hay una
clara separación entre la unidad formadora de colonia y la proteína.
8
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presentes. La δ - endotoxina es insoluble en agua o solventes orgánicos y pierde su

toxicidad cuando se le trata con denaturalizantes proteicos.
1.4. PRODUCCIÓN COMERCIAL
La mayoría de las formulaciones empleadas por la industria están dirigidas hacia el control
de insectos lepidópteros, por ello se ha hecho énfasis en la δ-endotoxina. Sin embargo, las
esporas y la β– exotoxina pueden jugar un papel complementario (aunque importante) en el
control de muchos insectos, razón por la cual últimamente se está buscando obtener
formulaciones que contengan estas toxinas en mayores niveles.
La fermentación sumergida, es la más usada y consiste en permitir un crecimiento bacterial

a través de un inóculo en medio líquido nutritivo esterilizado, todo ello en un fermentador
de gran volumen. Después de obtener el crecimiento y la esporulación óptima, el material
se filtra, se centrifuga, se estandariza para finalmente formular el producto comercial (véase
ilustración 3).
Ilustración 2. Producción del Bacillus thruringiensis mediante el proceso de fermentación6.
6
Tomado de : Ignoffo, 1967
9
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2. CRECIMIENTO DE BIOMASA DEL CULTIVO
2.1. ETAPAS DEL CRECIMIENTO MICROBIAL
En el cultivo, después de proveer las sustancias nutritivas al fermentador, suministrar los

materiales y la energía requerida para la síntesis de biomasa, se inocula el medio con una
cantidad determinada de células viables. El cultivo se desarrolla con intercambio de gases
tales como el aire, CO2 y H2.
El desarrollo del cultivo, bajo condiciones fisicoquímicas adecuadas en un sustrato simple y

homogéneo (libre de sustancias inhibitorias), las células se reproducen siguiendo el
comportamiento típico que se muestra a continuación (véase ilustración 4):
Ilustración 3. Etapas del crecimiento Microbial

Tomado de www.np.edu.sg, recuperado el 15 de junio de 2004.
- Periodo de latencia, o periodo “lag”, es el periodo de adaptación de la célula a los

cambios de su ambiente fisicoquímico. Es el tiempo requerido para inactivar un
inhibidor presente en el medio o el tiempo de germinación de un inóculo de esporas.
- Periodo de crecimiento exponencial. Las células se reproducen en un medio sin
limitación de sustancias nutritivas a la máxima velocidad compatible con el conjunto de
condiciones existentes.
10
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- Periodo estacionario. Las causas que explican este periodo son: a) las células agotaron
el sustrato o los nutrientes necesarios para su crecimiento y b) el crecimiento de células
nuevas se compensa con el número de células muertas.
- Periodo endógeno, o crecimiento críptico. En esta fase los microorganismos son
forzados a metabolizar su protoplasma sin que haya reemplazo del mismo. Esto es
debido a que la concentración de alimento disponible se encuentra en sus valores
mínimos. Durante este periodo puede ocurrir el fenómeno conocido como “lisis”, en el
cual los nutrientes que quedan en las células muertas, se difunden hacia el exterior para
suministrar alimento a las células vivas restantes.
2.2. CINÉTICA DEL CRECIMIENTO MICROBIAL.
Para asegurar que los organismos crezcan, se debe permitir que permanezcan en el sistema
el tiempo suficiente para que se reproduzcan. El tiempo requerido depende de su tasa de
crecimiento, la cual se relaciona directamente con la velocidad a la cual ellos metabolizan o
utilizan los desechos. Suponiendo que las condiciones ambientales se controlan (ver
capitulo 3.0), se puede asegurar la estabilización efectiva de los desechos al controlar la
tasa de crecimiento de los microorganismos. La cinética de crecimiento biológico se
considera a continuación.
2.2.1. VELOCIDAD ESPECÍFICA
En los procesos de fermentación, los microorganismos desarrollan su actividad vital en

medios de elevada complejidad. El agente responsable de la transformación es la célula
viva que asimila el sustrato, se reproduce y produce otras sustancias.
Uno de los aspectos más importantes del estudio de la cinética de estos procesos es la
selección de métodos analíticos para evaluar las sustancias consumidas y producidas por el
microorganismo y la variación de su concentración en el tiempo.
La concentración de las células en el medio constituye una medida adecuada de la

concentración del sistema enzimático responsable de la transformación. Por esta razón, las
velocidades de consumo de sustrato y de formación de producto generalmente son
expresadas como velocidades específicas referidas a la concentración de las células
(Duarte, 1993):
1 dx 1
µx = = rx
x dt x
11
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Donde,
µx: velocidad específica de crecimiento microbial [tiempo-1]

x: concentración de células [masa de células secas / unidad de volumen]
rx: velocidad de crecimiento de las células, [masa / unidad de volumen x tiempo].
1 ds 1
µs = = rs
x dt x
Donde,
µs: velocidad específica de consumo de sustrato, [tiempo-1]

s: concentración de sustrato, [masa de sustrato / unidad de volumen]
rs: velocidad de consumo de sustrato, [masa / unidad de volumen x tiempo].
12
IQ-2004-I-23
3. METODOLOGÍA
Para realizar una correcta experimentación, es necesario establecer una metodología que
permita el adecuado desarrollo de la misma; es por ello que se procederá a definir el modo
de operación, así como los factores físicos y químicos que interactúan sobre el sistema.
El proceso de cultivo toma lugar en un recipiente llamado bio-reactor o fermentador. En el

reactor, se encuentra un liquido compuesto de células y nutrientes. Hoy en día existen
diferentes tipos de bio-reactores, pero el más usado por la industria de la biotecnología es el
reactor de tanque agitado (véase ilustración 5):
Ilustración 4. Reactor bien mezclado
Estos a su vez deben operar bajo condiciones asépticas y por lo tanto, deben estar
esterilizados. Para reactores a escala laboratorio deben colocarse en autoclave7.
3.1. MODO DE OPERACIÓN
En la actualidad, a nivel industrial, el método empleado para la obtención del biopesticida a

partir del crecimiento microbial del Bacillus Thuringiensis subespecie Kurstaki es la
fermentación de tipo batch; sin embargo, se han encontrado alternativas (a nivel de
laboratorio) a este modo de operación, tales como la fed-batch continua y la discontinua
que resultan ser más efectivas y ofrecen un rango de producción final de esporas y de
7
Procedimiento que se utiliza para esterilizar equipos, materiales y reactivos de una fermentación a
temperatura de 121ºC.
13
IQ-2004-I-23
toxinas proteicas mayor a las registradas por la fermentación batch (Para mayor detalle en
este tópico, véase el capítulo 7).
A continuación se explicará los dos modos de fermentación existentes (batch y fed-batch),

enfatizando el estudio, en el modo de fermentación fed-batch, que es finalmente el modo
que será empleado en esta investigación.
3.1.1. FERMENTACIÓN “BATCH”
La fermentación batch se refiere a un sistema parcialmente cerrado en el cual la mayoría de

los materiales requeridos han de ser cargados en el fermentador, siempre y cuando hayan
sido descontaminados antes de comenzar el proceso. Los únicos materiales que van ha
hacer añadidos y removidos durante el curso de la fermentación, serán la corriente de
oxigeno y los agentes que controlan el pH.
La principal desventaja de un proceso es batch es la alta proporción de tiempo

improductivo (down time) entre lotes, la carga y la descarga, la limpieza, la esterilización y
el proceso de volver a comenzar (McNeil, 1990).
3.1.2. FERMENTACIÓN “FED-BATCH”
La técnica de fermentación Fed Batch es aplicada básicamente, en células que crecen a una
tasa específica (µx, t-1) por algún tiempo; generalmente, hasta cuando llegan al final de la
fase de crecimiento exponencial. En este punto, el reactor se alimenta con una solución de
sustrato8, sin la remoción del cultivo. Esta alimentación ha de ser lo suficientemente
balanceada a fin de conservar el crecimiento de los microorganismos a la tasa de
crecimiento específica deseada, y de esta manera reducir la probabilidad de producir
subproductos que puedan ocasionar una muerte temprana de las bacterias.
Un proceso fed-batch es útil para el desarrollo de productos9 de alta concentración como

resultado de una gran producción de células durante un tiempo relativamente largo. Dos
casos pueden considerarse: La producción de un crecimiento asociado al producto y la
producción de un no-crecimiento asociado al producto. En el primer caso, es necesario
extender la fase de crecimiento tanto como sea posible, minimizando los cambios en el
8
El sustrato empleado en esta investigación es glucosa, que a su vez, es la misma fuente de carbono.
9
En el caso de esta investigación, esporas y toxinas proteicas.
14
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fermentador hasta la tasa de crecimiento específica máxima y evitar la formación de

productos indeseados.
3.1.2.1.Ventajas y desventajas de una producción Fed-Batch.
Ventajas:
• Producción de alta densidad de células debido a la extensión de tiempo

(particularmente importante en la producción de crecimiento asociado al producto).
• Existen condiciones de control en la provisión de sustrato durante la fermentación,
teniendo que la concentración específica de sustrato se mantiene, por ejemplo, la
fuente de carbono.
• Control sobre la formación de subproductos o efectos de la represión catabólica
debido a la limitación de sustrato.
• El modo de operación puede superar y controlar las desviaciones de crecimiento del
organismo patrón.
Desventajas:
• Es necesario un análisis previo del microorganismo.

• Se requiere una habilidad sustancial del operador para la disposición, definición y
desarrollo del proceso.
• En un ciclo de cultivo fed batch, hay que tener un especial cuidado en el diseño del
proceso, para así asegurar que las toxinas no se acumulen en los niveles inhibitorios.
También hay que considerar que los otros nutrientes incorporados no lleguen a ser
limitantes dentro del sistema.
• Las cantidades de componentes a controlar deben estar sobre los límites de
detección de los rangos cuantificables por los equipos.
3.1.2.2.Estrategias de alimentación
Generalmente se utilizan las siguientes estrategias de control con el propósito de alimentar

el reactor ya sea de forma continua o discontinua:
• Alimentación con caudal constante o con caudal linealmente creciente.

• Alimentación con caudal exponencialmente creciente. Tiene por objeto el mantener
constante la concentración de sustrato y alcanzar un crecimiento exponencial.
• Alimentación con caudal controlado por alguna respuesta del sistema.
15
IQ-2004-I-23
• Alimentación cíclica o en lotes repetidos. Después de cada periodo de operación, el

reactor se desocupa parcialmente y entonces se alimenta el sustrato para recuperar
el volumen inicial.
3.2. FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL PROCESO DE

FERMENTACIÓN
La mayoría de proceso de fermentación, se encuentran restringidos y confinados a sus

propiedades físicas y químicas del medio y sus alrededores; tales como: el pH, la
temperatura, el oxígeno disuelto, la presión, la concentración de sustrato en el medio de
cultivo y la concentración de sustrato en el flujo de alimentación, entre otros (Varios,
1998).
A continuación se presentará una tabla de las distintas variables que actúan sobre el proceso
de fermentación fed –batch continuo, y de esta misma forma se ubicarán según el grado de
importancia y de complejidad:
CONTROLABILIDAD Efectos sobre la Fermentación

Directa Indirecta
Directa Temperatura Presión
Concentración de Velocidad del agitador
oxígeno disuelto. y/o Tasa de flujo de gas
pH Homogeneidad
Alimentación de la fuente Espuma
de carbono
Tasa específica de
crecimiento
Indirecta Concentración de CO2 Coeficiente de
disuelto transferencia de masa
Concentración de los (kLa)
otros nutrientes.
Concentración de
biomasa
Dificultad Concentración de la Concentración del
Biomasa producto
Concentración de los Redox10 potencial
principales nutrientes
10
Reducción oxidación
16
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Concentración del
producto inhibido.
Actividad del agua.
Fuerza iónica
Tabla 2. Variables del proceso de Fermentación Fed batch Continuo.
De la anterior tabla se puede observar, que las variables que actúan directamente sobre el
proceso y son determinantes para el crecimiento y la producción de biomasa son: La
temperatura, el pH, la transferencia de oxígeno disuelto, la alimentación de la fuente de
carbono, entre otros.
3.2.1. TEMPERATURA
La temperatura afecta la velocidad de las reacciones celulares, la naturaleza del

metabolismo, los requerimientos nutricionales y energéticos, y la composición de la
biomasa. Generalmente los microorganismos crecen en un intervalo de temperatura
ambiente entre 25 y 30 ºC (Duarte, 1993).
3.2.2. pH.
El valor óptimo de pH, entendido como el valor para el cual la velocidad de crecimiento es
máxima, varia entre 6.5 y 7.5 para las bacterias.
El pH del medio de cultivo cambia como respuesta a la actividad microbial: se genera H+

durante la demanda de NH4+. Se consume H+, en el metabolismo de NO3 -. Se consume H+
en la utilización de aminoácidos, como fuente de carbono. Estos cambios muestran la
necesidad de determinar y controlar el pH en el cultivo, usualmente mediante la adición de
hidróxido de sodio al medio. Para el caso donde se requiere favorecer la formación de
esporas, pasando al medio de un nivel ligeramente ácido, a un nivel básico el pH ha de
estar entre 6.5 y 8.0.
3.2.3. TRANSFERENCIA DE OXÍGENO11
11
Citado en Duarte, 1994
17
IQ-2004-I-23
En los procesos de fermentación microbiana aeróbica, es esencial la presencia de oxígeno

disuelto en el crecimiento debido a la importancia que tiene en el ciclo vital y metabólico
del microorganismo.
Un suministro adecuado que satisfaga la cantidad de oxígeno necesario para la oxidación de
las fuentes de carbono y su transformación en células, productos y dióxido de carbono,
establece la demanda de oxígeno que se satisface a través de la aireación y mezcla del
cultivo.
La velocidad de transferencia de oxígeno en el caldo de fermentación se afecta por algunos

factores físicos y químicos. Estos factores pueden influir en la fuerza impulsora o en el
coeficiente de transferencia KLa. Por esto, es posible aumentar la velocidad de transferencia
de oxígeno controlando los siguientes factores en sus niveles óptimos.
• Flujo de aire. Los cambios en la velocidad de aire tienen un pequeño efecto sobre los
valores de KLa en sistemas convencionales agitados. El intervalo de flujo raramente se
sale de 0.5 –2.5 [volumen de aire / volumen del medio por minuto] (vvm). Si se usa una
velocidad muy alta de flujo, se puede alcanzar un valor muy bajo de velocidad de
transferencia de oxígeno debido a que el agitador se inunda. La inundación es el
fenómeno que ocurre cuando la velocidad de flujo es tan alta que el agitador rota
prácticamente en una fase gaseosa y no ayuda a la transferencia de gas a la solución.
• Velocidad de agitación. Se ha demostrado que el grado de agitación tiene un profundo

efecto sobre la velocidad de transferencia de oxígeno en un fermentador. La agitación
ayuda a la transferencia de oxígeno en los siguientes aspectos: Incrementa el área
disponible para la transferencia de oxígeno por dispersión del aire en el medio de
cultivo en forma de burbujas pequeñas, retarda el escape de las burbujas de aire en el
líquido, evita la coalescencia de la burbujas de aire, disminuye el espesor de la película
líquida por incremento en la turbulencia del fluido.
• Surfactantes. Un alto grado de aireación y agitación en una fermentación,

frecuentemente produce un aumento en la formación de la espuma. En circunstancias
extremas la espuma puede salir de fermentador por el conducto del aire o por el toma
muestras, lo cual ocasiona una pérdida de medio y de producto e incrementa la
posibilidad de contaminación. Por esto es necesario eliminar la espuma mediante el uso
de rompe espumas mecánicos, o con agentes espumante (surfactantes). Los surfactantes
se absorben en la interfase gas-líquido reduciendo la tensión superficial y por lo tanto el
diámetro de las burbujas. Esto hace que el área interfacial aumente. Se ha encontrado
que el coeficiente volumétrico KLa disminuye con cantidades pequeñas de
antiespumante hasta un valor crítico, después del cual aumenta.
3.2.4. CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA Y MODO DE ALIMENTACIÓN

EN EL FLUJO DE ALIMENTACIÓN.
18
IQ-2004-I-23
Las fermentaciones fed-batch continuas, se caracterizan por la introducción de un flujo de

alimentación durante cierto tiempo en el proceso, esto se hace con el fin de aumentar la fase
exponencial de crecimiento celular y de esta forma garantizar una producción mayor de
biomasa. Por ello, es necesario utilizar concentraciones de sustrato y formas de
alimentación óptimas, de tal manera que se garantice un crecimiento máximo de biomasa,
sin que este interfiera en el metabolismo y formación de productos.
19
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4. DISEÑO DE EXPERIMENTOS
4.1. MODELO DE REGRESIÓN LINEAL
A continuación se presentará el modelo de regresión lineal representado por niveles y

efectos que explica el diseño de experimentos a evaluar.
yijkl = µ + α i + β j + δ k + γ l + αβ ij + αγ ik + αδ il + βγ jk + βδ jl + γδ kl + ...
... + αβγ ijk + αβδ ijl + βγδ jkl + αβγδ ijkl + ε ijkl
Donde
yijkl: La observación de el nivel i del factor A, j del factor B, k del factor C y l del nivel D.
µ: Media general de las observaciones.
αi: Efecto del nivel i del factor A.
βj: Efecto del nivel j factor B.
γk: Efecto del nivel k factor C.
δl: Efecto del nivel l factor D.
αβij: Efecto de la interacción doble del nivel i del factor A y nivel j del factor B.
αγik: Efecto de la interacción doble del nivel i del factor A y nivel k del factor C.
αδil: Efecto de la interacción doble del nivel i del factor A y nivel l del factor D.
βγjk: Efecto de la interacción doble del nivel j del factor B y nivel k del factor C.
βδjl: Efecto de la interacción doble del nivel j del factor B y nivel l del factor D.
γδkl: Efecto de la interacción doble del nivel k del factor C y nivel l del factor D.
αβγijk: Efecto de la interacción triple del nivel i del factor A, nivel j del factor B y nivel k
del factor C.
αβδijl: Efecto de la interacción triple del nivel i del factor A, nivel j del factor B y nivel l
del factor D.
βγδjkl: Efecto de la interacción triple del nivel j del factor B, nivel k del factor C y nivel l
del factor D.
αβγδijkl: Efecto de la interacción cuádruple nivel i del factor A, nivel j del factor B, nivel k
del factor C y nivel l del factor D.
εijkl: Error asociado a la observación del nivel i del factor A, j del factor B, k del factor C y l
del nivel D.
En la anterior ecuación, se representa la variable de respuesta al diseño de experimentos, en

función de un promedio y la interacción de los factores que lo integran.
20
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4.2. FORMULACIÓN DE HIPÓTESIS.
Por medio del análisis de varianza ANOVA se va a probar la significancia de los

tratamientos de cada factor por medio de las siguientes pruebas de hipótesis:
Hipótesis nula se asume que algún (todos) factor no produzca efecto sobre el sistema; es
decir, que cause (o causen) inhibición de crecimiento y por ende no exista desarrollo de
esporas y producción de toxinas proteicas.
Contrario a lo anterior se plantea una Hipótesis alterna, donde se busca la relevancia de los
factores a estudiar.
Ho : τ i = 0 ∀ i ∈ {−,+}
Ha : ∃i / τ i ≠ 0
τ ∈ {α , β , γ , δ }
La anterior prueba de hipótesis, busca evaluar el efecto de un solo factor.
Para evaluar las interacciones se procede de una manera similar:
Ho : τλij = 0 ∀ i, j ∈ {−,+}
Para interacciones dobles: Ha : ∃ij / τλij ≠ 0
τλ ∈ {αβ ,..., γδ }
Ho : τλθ ijk = 0 ∀ i, j , k ∈ {−, +}

Para interacciones triples: Ha : ∃ijk / τλθ ijk ≠ 0
τλθ ∈ {αβγ ,..., βγδ }
Ho : αβγδ ijkl = 0 ∀ i, j , k , l ∈ {−,+}

Para la interacción cuádruple:
Ha : ∃ijkl / αβγδ ijkl ≠ 0
El estadístico de prueba que se usa para cada hipótesis es una variable aleatoria F, la cual se
obtiene de la siguiente manera:
21
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SSFactor
Fon, m = n
SSError
m
Donde SSFactor es la suma de cuadrados del factor ó interacción, SSError es la suma de

cuadrados del error, n los grados de libertad asociados al factor ó interacción y m los grados
de libertad del error.
4.3. SELECCIÓN DE FACTORES Y NIVELES.
Los factores representan las variables independientes que serán evaluadas durante el
experimento, debido a su relevancia y sus efectos sobre el sistema, se han clasificado las
variables discutidas en el capítulo anterior, en fijas y versátiles.
Como variables fijas se tiene la temperatura (T: 30 ºC), el tiempo (50 horas), rango de pH
(6.5 – 8.0) y la adición de surfactante (20 ml).
Mientras que las variables o factores versátiles, se les asignará niveles que representan un
rango óptimo de evaluación, por el cual, serán estudiados sus efectos e interacciones sobre
el proceso.
- 1.5 vvm
A: Flujo de Aire
+2.5 vvm
- 400 ppm
B: Velocidad de Agitación
+ 300 ppm
- 40 ml/h
C: Modo de Alimentación
+ escalón 40 ml/h y 70 ml/h
- 30 g/L
D: Concentración de Glucosa
+ 50 g/L
Tabla 3. Factores y Niveles del diseño de Experimentos
4.4. SELECCIÓN DE LA VARIABLE DE RESPUESTA
En la selección de variable de respuesta o variable dependiente, hay que tener en cuenta que
la repuesta debe proveer suficiente información acerca del problema estudiado, por esta
razón se determinó realizar las siguientes experimentaciones.
22
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Oxigeno disuelto (%) Monitoreo cada 30 minutos

Crecimiento biomasico (g/L) Peso de la biomasa en base seca.
Consumo de glucosa (g/L) DNS- Espectrofotómetro
Esporas (UFC/mL) Conteo de esporas
Formación de proteínas (Kda) Electroforesis
Tabla 4. Variables de Respuesta
Sin embargo para evaluar el diseño de experimentos, se realizará con base a la respuesta
obtenida en función del producto dado, es decir, la determinación de biomasa (g/L) a través
del tiempo y el conteo final de esporas (UFC/mL)
4.5. SELECCIÓN DEL DISEÑO DE EXPERIMENTO12.
El diseño se realizara bajo un diseño factorial de hk, donde se permite estimativos

independientes de k efectos principales, h es el factor interacción y k describe los factores
independientes que influyen sobre el experimento, tales como concentración de sustrato, el
tipo de alimentación, el flujo de aire y la velocidad de agitación. Cada uno de estos factores
estarán representados bajo la notación convencional de a, b, c, d respectivamente. Mientras
que h, hace referencia a el número de niveles al que se va hacer el experimento, para este
caso se van a utilizar niveles altos y bajos, que se van a denotar por el signo menos (-) para
bajo y el signo (+) para alto.
4.5.1. PROYECCIÓN DE FRACCIÓN EN FACTORIALES.
Cualquier diseño de fracción factorial de resolución R contiene diseños de factoriales

completos (posibilidad de replicación factorial) en cualquier subconjunto de R-1 factores.
En este caso se tienen cuatro variables potencialmente importantes pero se cree que solo R-
1 son relevantes. Si el experimento es correcto, entonces el diseño de fracción factorial R va
a ser proyectada a una serie de valores R-1 significantes, a través de la confusión de efectos.
Siempre que la resolución posible máxima sea la mitad de la fracción 2k es R=K, para todo
diseño 2k será proyectado a cualquier (k-1) de los factores k originales.
12
Montgomery, 1998
23
IQ-2004-I-23
Siguiendo la técnica de diseño de fracción factorial, se llega a obtener un sistema

económico y experimentalmente eficiente. Para esta caso serán k = 4 factores, entonces 2k-1
dará 23 y como resultado ocho corridas. Con el fin de realizar un posterior análisis de
resultados y decidir cual es el mejor sistema para la próxima corrida.
4.5.1.1.Diagrama del diseño de experimentos
A B C D= -ABC Intersección
- - - + D
+ - - - A
- + - - B
+ + - + ABD
- - + - C
+ - + + ACD
- + + + BCD
+ + + - ABC
Tabla 5. Diagrama del Diseño de experimentos
24
IQ-2004-I-23
5. MODELO MATEMÁTICO
A continuación se presentará el desarrollo del modelo matemático del crecimiento

microbial, consumo de sustrato y transferencia de oxígeno de la fermentación del Bacillus
thuringiensis por el método fed-batch continuo.
Esta metodología consiste en dividir la fermentación en cuatro etapas, que son:
1. Etapa de adaptación: Se realiza por un tiempo aproximado de 14 horas (Anexo D),

para efectos prácticos esta no se toma en cuenta para el modelo matemático.
2. Cultivo en “Batch: En esta etapa el microorganismo se encuentra en una solución
rica en sustrato (glucosa). Este procedimiento lleva un tiempo de 5 horas.
3. Alimentación “Fed-batch”continua: Para este instante, los niveles de glucosa se
deben encontrar bajos y se comienza a alimentar el reactor de manera constante por
un tiempo de 12 horas.
4. Cultivo en “Batch”: En esta etapa los niveles de glucosa se encuentran al mínimo,
se espera que se de una mezcla completa por un tiempo de 33 horas.
5.1. CRECIMIENTO CELULAR
Para un cultivo, en el cual el contenido del reactor se mezcla completamente, la tasa de

crecimiento de células se puede definir con la siguiente relación (Shuler, 1992):
dx
= µx X
dt
Donde,
dx/dt: tasa de crecimiento bacteriano, [masa / unidad de volumen * tiempo]

µ: Tasa específica del crecimiento, [tiempo-1]
X: Concentración de biomasa, [masa seca / unidad de volumen.]
5.1.1. CRECIMIENTO CON SUSTRATO LIMITADO
Para un cultivo continuo se ha encontrado que el efecto limitante de un sustrato se puede

con frecuencia definir como un modelo de crecimiento cinético estructurado y segregado,
25
IQ-2004-I-23
que es donde el microorganismo o la célula se considera como un componente simple con

una población celular heterogénea (Shuler, 1992).
Para cuantificar la cinética de crecimiento microbial, se han desarrollado modelos, que

explican este comportamiento.
5.1.1.1.Modelo Monod:
El efecto de la composición de un medio de cultivo libre de sustancias inhibitorias sobre la

velocidad de crecimiento fue estudiado por Monod (1949). Las ecuaciones básicas que
describen la iteración entre los microorganismos y el sustrato limitante de crecimiento son:
1 dx s
= µ x = µ max
x dt s + ks
ds 1 dx
rs = − =−
dt Yx / s dt
Donde,
s: concentración del sustrato limitante, [masa / unidad de volumen]

rs: velocidad de consumo de sustrato [masa / unidad de volumen * tiempo]
Yx/s: factor de producción [masa seca / masa de sustrato]
X: concentración de biomasa [masa seca / unidad de volumen]
µx: velocidad específica de crecimiento, [tiempo –1]
µmax: velocidad específica máxima de crecimiento, [tiempo –1]
Ks: constante de saturación, [masa /unidad de volumen]
Ks: es la concentración del sustrato para la cual la velocidad específica es la mitad del
crecimiento del valor máximo, (ver Anexo C).
Ahora bien, los valores de la constante de saturación, Ks, para diversas fuentes de carbono
varían típicamente entre 1 y 10 mg/L. Estos valores significan que las células crecen a su
máxima velocidad cuando la concentración excede 10 el Ks; es decir, entre 10 y 100 mg/L
(Monod, 1942).
Para todos los nutrientes hay un valor de la concentración que al ser sobrepasado origina
una disminución de la velocidad de crecimiento. Este efecto, conocido como “inhibición
por sustrato” puede presentarse en el caso de carbohidratos alrededor de 50 g/L, aunque
generalmente solo se manifiesta entre 100 g/L y 150 g/L.
En la inhibición competitiva la sustancia inhibitoria compite con el sustrato limitante del

crecimiento. En la inhibición no competitiva, la sustancia inhibitoria reacciona o se
combina con la biomasa sin afectar la afinidad por el sustrato.
26
IQ-2004-I-23
Para cuantificar este fenómeno se han desarrollado una serie de modelos, a partir del
modelo de Monod, que a su vez se adaptan a modelos que utilizan concentraciones de
sustrato altas (del orden de 50 a 200 g/L) y para cultivos en reactores de mezcla completa.
A continuación se expondrá el modelo propuesto por Andrews (1971)13:
1
µ x = µ max
ks s
1+ +
s k IS
Donde, KIS: constante de inhibición por sustrato, [masa / unidad de volumen].
Las demás variables tiene el mismo significado que en la ecuación de Monod.
5.1.1.2.Crecimiento Celular y utilización del sustrato
En sistemas de cultivo, una porción de sustrato se convierte en células nuevas y la otra se

oxida en productos finales orgánicos e inorgánicos. Debido a que la cantidad de células
nuevas producidas se puede reproducir para un determinado sustrato, se desarrollo la
siguiente relación entre tasa de utilización del sustrato y la tasa de crecimiento (Crites,
1998).
dx ds
= −Yx / s
dt dt
Donde ds/dt: tasa de utilización del sustrato, [masa / unidad de volumen * tiempo]
Si se sustituye la anterior ecuación sobre la ecuación de crecimiento bacterial (dx/dt), se
puede definir como:
⎛ ⎞
⎜ ⎟
ds 1 ⎜ 1 ⎟X
1 =
⎜
µ max ⎟
dt Yx / s k s
⎜ 1+ s + ⎟
⎝ s k IS ⎠
13
Citado por Duarte, pág 371
27
IQ-2004-I-23
5.2. EFECTOS DEL METABOLISMO ENDÓGENO
La distribución de las edades de las células en los sistemas bacterianos que se utilizan en
sistemas fermentativos es tal que no todas las células del sistema se encuentran en fase
exponencial. Por lo tanto, la expresión para la tasa de crecimiento debe corregirse de
manera que represente la energía requerida para el mantenimiento celular. También deben
considerarse otros factores tales como la muerte de biomasa. Con frecuencia esta
disminución se identifica como decaimiento endógeno. La respiración endógena se
representa mediante la siguiente ecuación:
C 5 H 7 O2 N + 5O2 → 5CO2 + 2 H 2 O + NH 3 + energía

(células)
A pesar de que la reacción de la respiración endógena mostrada genera productos finales

relativamente simples y energía, también se forman productos finales estables.
El término decaimiento endógeno (rd) se puede formular de la siguiente manera:
rd = − k d X
Donde
kd: coeficiente de decaimiento endógeno, [tiempo-1].
5.3. TRANSFERENCIA DE OXÍGENO.
Un balance general de transferencia de oxígeno durante un cultivo continuo en un

fermentador aireado y agitado esta dado por (Duarte, 1994):
dC L dP
= K La (C * −C L ) + D(C LR − C L ) − QO2 X − K
dt dt
El primer término de la ecuación, corresponde al suministro de oxígeno de la fase gaseosa a

la líquida, y es influenciado por la velocidad de agitación, el flujo de aire (Hoyos, 2003) y
las propiedades fisicoquímicas del medio de cultivo. El siguiente término D(CLR-CL),
representa la diferencia entre oxígeno disuelto presente en el alimento y el oxígeno disuelto
removido por el líquido efluente. Los otros términos expresan la demanda de oxígeno por
unidad de volumen de cultivo y el consumo de oxígeno para la oxidación de producto,
respectivamente.
28
IQ-2004-I-23
Para resolver la ecuación anterior, se hacen las siguientes suposiciones:
• El suministro de oxígeno en el alimento puede ser despreciado.

• QO2 es constante, y KLa es constante en el cultivo continuo en estado estable, y
durante un corto periodo de medición en el cultivo por lotes (Duarte, 1994).
• El consumo de oxígeno por la oxidación de productos se incluye en la demanda de
oxígeno por las células, debido a que es imposible estimar todos los productos
metabólicos.
• Cuando el cultivo es por lotes el término D(CLR-CL) es cero (Duarte, 1994).
Entonces la ecuación queda:

dC L
= K La (C * −C L ) − QO2 X
dt
5.4. BALANCE DE MASA GENERAL
dz F F
= z i − z + rz
dt V V
Planteamiento general
Planteamiento simplificado
Acumulación: entrada – salida + crecimiento neto – decaimiento endógeno*
*En este sistema no se considera ya que es del orden de 10-5 para bacterias facultativas.
Cultivo “Batch” Cultivo “Fed-batch”
= µ x [ X + Yx / s × (S )] = X + µ x [ X + Yx / s × (S )]
dx dx F
dt dt V
µ x [X + Yx / s × (S )] µ x [ X + Yx / s × (S )]
ds 1 ds F 1
=− = (S a − S ) −
dt Yx / s dt V Yx / s
Donde µx se representa por la ecuación de Andrews: Donde F: caudal (unidad de volumen / tiempo), V:
1 volumen (unidad de volumen); Sa: concentración de
µ x = µ max alimentación (masa / unidad de volumen).
ks s Donde µx se representa por la ecuación de Andrews:
1+ +
s k IS 1
µ x = µ max
ks s
1+ +
s k IS
La transferencia de oxígeno es:
dC L
= K La (C * −C L ) − QO2 X
dt
Donde, QO2: (YO/S / YX/S) µX
Tabla 6. Balance de Masa para una Fermentación Fed-batch continua
29
IQ-2004-I-23
6. RESULTADOS
6.1. RESULTADOS EXPERIMENTALES DE LAS FERMENTACIONES.
A continuación se representará de manera gráfica el comportamiento microbial (g/L),

consumo de glucosa (g/L) y oxígeno disuelto (ppm) con respecto al tiempo (minutos).
Primera fermentación
Resultado Experimental (Fermentación I)
I II III
7
5
Masa
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Tiempo (min)
Biomasa (g/l) Oxigeno Disuelto (mg/L) Consumo de Glucosa (g/l)
Ilustración 5. Grafica del comportamiento microbial, consumo de glucosa y Oxígeno disuelto con respecto al tiempo
(Fermentación I)
30
IQ-2004-I-23
Segunda Fermentación
Resultado Experimental (Fermentación II)
I II III
8
5
Masa
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Tiempo (min)
(Fermentación II)
Tercera Fermentación
Resultado Experimental (Fermentación III)
I II III
8
5
Masa
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Tiempo (min)
(Fermentación III)
31
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Cuarta Fermentación
Resultado Experimental (Fermentación IV)
11
I II III
7
Masa
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
-1
Tiempo (min)
(Fermentación IV)
Quinta Fermentación
Resultado Experimental (Fermentación V)
15
I II III
13
11
9
Masa
0 500 1000 1500 2000 2500 3000

-1
Tiempo (min)
(Fermentación V)
32
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Sexta Fermentación
Resultado Experimental (Fermentación VI)
14 I II III
12
10
8
Masa
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Tiempo (min)
(Fermentación VI)
Séptima Fermentación
Resultado Experimental (Fermentación VII)
20
I II III
18
16
14
12
Masa
10
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Tiempo (min)
(Fermentación VII)
33
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Octava Fermentación
Resultado Experimental (Fermentación VIII)
I II III
7
5
Masa
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Tiempo (min)
(Fermentación VIII)
Las ocho fermentaciones obtuvieron un comportamiento similar en su crecimiento

microbial, consumo de sustrato y transferencia de oxígeno contra el tiempo. Es por esto que
se procederá a realizar una explicación en general, de cada una de las variables a
considerar:
Biomasa: En general, se observa un comportamiento de crecimiento microbial lineal

positivo; con ciertas fluctuaciones en sus etapas iniciales (primeras 7 horas), como es el
caso de las fermentaciones II y III, donde se observa ligeras concavidades hacia abajo.
El rango de producción final de biomasa (g/L) se encuentra entre los 6 y 19 g/L. Los
factores que influyen sobre la mayor y menor productividad serán estudiados en el análisis
de resultados (véase capítulo 8).
Glucosa: Mientras que la glucosa durante la primera etapa de cultivo “batch”, sufre un
agotamiento acelerado hasta llegar a niveles mínimos de concentración. En la etapa de
alimentación fed-batch continua, se mantiene un remanente de glucosa estable de
aproximadamente 0.4 g/L, (una concentración pequeña con respecto a la inicial) suficiente
para satisfacer las necesidades de consumo de la bacteria. Durante la tercera etapa de
cultivo “batch”, se mantiene un nivel mínimo de glucosa constante.
34
IQ-2004-I-23
Oxigeno: Aunque el oxígeno presenta serias discrepancias entre fermentaciones, se ha

obtenido una dinámica generalizada de su transferencia al medio. Esta comienza con una
saturación del sistema, que decae aceleradamente durante las primeras seis horas hasta
llegar un punto mínimo, (alrededor de 0.3 ppm) donde el consumo de oxígeno va ser igual a
la “oferta” del mismo.
A partir de ahí, su consumo disminuye y el oxígeno disuelto en el medio aumenta hasta

llegar a saturar el sistema (a las 12 horas aproximadamente). Después el consumo tiende
aumentar y se mantiene constante hasta el final del experimento en sus niveles de
disolución mínimos.
6.2. CONCENTRACIÓN FINAL DE ESPORAS
Para analizar el grado de importancia de la producción final de esporas, se tomó el

promedio de los datos experimentales de la concentración final de esporas (UFC/mL), de
cada una de las ocho fermentaciones realizadas. Este se utilizó como variable de respuesta,
para realizar el análisis de varianza ANOVA correspondiente:
-6 -7
10 (UFC/mL) 10 (UFC/mL)
Fermentación Promedio
1 2 3 1 2 3
1 IND IND IND IND 1.72E+03 IND 1.72E+03
2 IND 2.98E+04 2.85E+04 1.47E+04 9.60E+03 2.18E+04 2.98E+03
3 6.40E+03 1.02E+04 0 1.92E+03 0 0 8.32E+03
4 6.40E+03 7.68E+03 IND 3.84E+03 1.09E+04 0 8.32E+03
5 2.24E+04 IND IND 1.34E+04 2.82E+04 IND 2.13E+04
6 IND IND 6.08E+03 0 2.56E+03 1.28E+03 1.92E+03
7 3.30E+04 IND IND 2.88E+04 3.07E+04 2.50E+04 3.08E+04
8 7.04E+03 3.52E+03 IND 1.60E+04 9.60E+03 5.76E+03 8.38E+03
Tabla 7. Concentración Final de Esporas (UFC/ml)
6.3. VARIABLE DE RESPUESTA DEL COMPORTAMIENTO MICROBIAL
Para analizar el grado de importancia de la producción de biomasa, se llevo a cabo una

linealización de los datos experimentales del crecimiento microbial (g/L) de cada una de las
ocho fermentaciones realizadas. Se tomo la pendiente, como variable de respuesta, para
realizar el análisis de varianza ANOVA correspondiente:
35
IQ-2004-I-23
Primera Fermentación
y = 0.0014 x + 1.3897
Segunda Fermentación
y = 0.0018 x + 1.0996
Tercera Fermentación
y = 0.0024 x + 1.9462
Cuarta Fermentación
y = 0.0027 x + 1.4393
Quinta Fermentación
y = 0.004 x + 0.5421
Sexta Fermentación
y = 0.0038 x + 1.3273
Séptima Fermentación
y = 0.0055 x - 0.6927
Octava Fermentación
y = 0.0016 x + 0.6658
Tabla 8. Variable de respuesta del Crecimiento microbial
6.4. RESULTADOS DE LA SIMULACIÓN
6.4.1. VARIABLES DE LA SIMULACIÓN
Las simulaciones se hicieron basándose en los resultados obtenidos en el proyecto de grado

”Producción de Bacillus thuringiensis subesp Kurstaki por la metodología en FED-BATCH
discontinuo con membrana de flujo tangencial” 14 , donde se encontraron variables para
una fermentación batch, tales como , Yx/s, µ máx., Yx/o y Ks:
Yx/s 44.16 %
µ max 0.17 h-1
Yx/o .95 %
Ks 0.83 g/L
Tabla 9. Variables para una Fermentación Batch
El coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, KLa (h-1) se tomó de los datos

obtenidos por Avignone (1995), el cual se encuentra dentro de un rango de (9.92 y 23.04
[h-1] ). La constante de inhibición, Ksi (g/L), es una constante dada en el artículo ”Enhanced
spore production of Bacillus Thuringiensis by fed-batch Culture”15, donde se menciona que
14
Maria Alejandra Delgado, 2003
15
Kang , 1992
36
IQ-2004-I-23
la inhibición del crecimiento microbial comienza a partir de una concentración de glucosa

de 100 g/L.
Para realizar la simulación, se tomaron en cuenta tan solo dos escenarios de fermentación
Fed-batch continua:
1. Fermentación “Fed – batch” con flujo de alimentación constante.

2. Fermentación “Fed – batch” con flujo de alimentación escalonado.
Los datos iniciales de concentración de glucosa inicial, So (g/L), concentración de biomasa

inicial, Xo (g/L) y la concentración del sustrato en el flujo de alimentación, Si (g/L), el
Flujo, F (L/h) y el volumen, V (L); se tomaron como base la Fermentación III para flujo de
alimentación constante y para flujo de alimentación escalonado se tomó la Fermentación
VII. Estas a su vez, se utilizarán como parámetros de comparación en la prueba de
reproducción del modelo, para el análisis de resultados.
Las ecuaciones utilizadas, están expresadas en el capítulo 5.
6.4.2. SIMULACIÓN PARA FERMENTACIÓN FED- BATCH CON FLUJO

DE ALIMENTACIÓN CONSTANTE
Volumen (L)
Aumento de Volumen a Flujo Constante (F: 0.04 L/h)
3.06
3.05
3.04
Volumen (L)
3.03
3.02
3.01
2.99
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Tiempo (min)
Ilustración 13. Gráfica de aumento de volumen con flujo de alimentación constante (F= 0.04 L/h)
37
IQ-2004-I-23
Simulación
1: S 2: X
1: 8
2: 10
2
1
2
2
1: 4
2: 5
1: 0 1
2: 1 1 1
0.00 12.50 25.00 37.50 50.00
Page 2 Hours 8:20 mar, 29 de jun de 2004
CONSUMO DE GLUCOSA Y CRECIMIENTO MICROBIAL A FLUJO CONSTANTE
Ilustración 14. Consumo de glucosa y crecimiento microbial a flujo constante
6.4.3. SIMULACIÓN PARA FERMENTACIÓN FED- BATCH CON FLUJO

DE ALIMENTACIÓN ESCALONADO.
Volumen (L)
Aumento de Volumen a Flujo Escalonado (F1:0.04L/h y F2: 0.07 L/h)
3.07
3.06
3.05
3.04
Volumen (L)
3.03
3.02
3.01
2.99
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Tiempo (min)
Ilustración 15. Aumento de volumen a flujo escalonado (F1: 0.04 L/h y F2: 0.07 L/h)
Flujo (L/h)
38
IQ-2004-I-23
Flujo Escalonado (F1:0.04L/h y F2: 0.07 L/h)

0.08
0.07
0.06
0.05
Volumen (L)
0.04
0.03
0.02
0.01
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Tiempo (min)
Ilustración 16. Flujo escalonado (F1: 0.04 L/h y F2: 0.07 L/h)
Simulación
1: S 2: X
1: 8
2: 20
1 2
1: 4
2: 10
2
1
1: 0 1 1
2: 0
0.00 12.50 25.00 37.50 50.00
Page 3 Hours 8:24 mar, 29 de jun de 2004
CONSUMO DE GLUCOSA Y CRECIMIENTO MICROBIAL A FLUJO ESCALONADO
Ilustración 17. Consumo de glucosa y crecimiento microbial a flujo escalonado
39
IQ-2004-I-23
6.4.4. SIMULACIÓN DEL OXIGENO DISUELTO
1: OD
1: 5
1: 3
1 1
1: 0 1
0.00 12.50 25.00 37.50 50.00
Page 6 Hours 8:19 jue, 01 de jul de 2004
COMPORTAMIENTO DEL OXIGENO EN FUNCION DEL TIEMPO
Ilustración 18. Comportamiento del oxígeno en función del tiempo
Las simulaciones se llevaron a cabo, bajo un programa llamado “ithink”.
40
IQ-2004-I-23
7. ANÁLISIS DE RESULTADOS
7.1. ANÁLISIS DE RESULTADOS DE LA PRESENCIA DE PROTEÍNA
Bajo el diseño de experimentos planteado, se encontró que la presencia de la toxina

proteica es independiente de los factores y niveles considerados; es decir, que es
independiente de las variables evaluadas.
Aunque se puede evidenciar la presencia de la proteína en las muestras, no se logró

establecer la cantidad de proteína, ya que la electroforesis, método por el cual se valoró la
presencia de proteínas (δ - endotoxina, 127 KDa), indica el peso molecular de la misma,
que se encuentra dentro de un rango de 60 y 130 KDa.
KDa
207
121
81
1 2 3 4 5 6 7 8
5
1
28.6
21.1
P Ilustración 19. Resultado de la electroforesis.
P
Por lo tanto, para efectos prácticos del análisis de resultados, se va a partir del hecho que la
formación de esporas y la producción de toxinas proteicas están ligadas (Kang, 1992).
7.2. ANÁLISIS DE VARIANZA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS
En el diseño de experimentos, se evaluaron dos variables de respuesta: la tasa de

crecimiento de biomasa y la cantidad de esporas (UFC/mL).
41
IQ-2004-I-23
7.2.1. ANOVA DE CANTIDAD DE ESPORAS
En la siguiente tabla se encuentran consignados los datos obtenidos a partir del conteo de
unidades de formadoras de colonias (UFC) por mililitro:
A B C D Y
(vvm) (rpm) (-) (g/L) (UFC/ml)
1.5 400 0 50 1.790E+04
2.5 400 0 30 2.98E+03
1.5 300 0 30 8.320E+03
2.5 300 0 50 8.320E+03
1.5 400 1 30 2.133E+05
2.5 400 1 50 1.920E+03
1.5 300 1 50 3.083E+04
2.5 300 1 30 8.384E+03
Tabla 10. Resultados del diseño de experimentos en términos de producción final de Esporas UFC/ml
La siguiente es la tabla ANOVA para esta variable de respuesta:
ANOVA SS Gl MS F P valor
A 56551612.5 1 56551612.5 0.40680187 0.63855393
B 275772613 1 275772613 1.98375977 0.3930508
C 59350512.5 1 59350512.5 0.42693565 0.63154748
D ABC 54340312.5 1 54340312.5 0.39089497 0.64428579
AC 70745512.5 1 70745512.5 0.50890515 0.60552062
AB 68269612.5 1 68269612.5 0.49109485 0.61086595
Error 139015125 1 139015125
Total 651673688 7 93096241.1
Tabla 11. ANOVA de la producción final de esporas (UFC/ml).
El error en realidad es el efecto de la interacción BC, el cual es el que tiene menor efecto,
ya que en este diseño factorial es de una sola réplica.
Para hacer más robusta la prueba se añadió a la suma de cuadrados del error el efecto de la
interacción AB:
A 56551612.5 1 56551612.5 1.59873356 0.33347998
B 275772613 1 275772613 7.79618672 0.10790195
C 59350512.5 1 59350512.5 1.67785943 0.32457019
D ABC 54340312.5 1 54340312.5 1.53621935 0.34089134
42
IQ-2004-I-23
AC 70745512.5 1 70745512.5 2 0.29289322

Error 70745512.5 2 35372756.3
Total 651673688 7 93096241.1
Tabla 12. ANOVA de la producción Final de esporas (UFC/ml).
Finalmente se agregó a la suma de cuadrados del error el efecto de la interacción AC:
A 56551612.5 1 56551612.5 1.2204056 0.3499258
B 275772613 1 275772613 5.95127931 0.0925395
C 59350512.5 1 59350512.5 1.28080694 0.34003514
D ABC 54340312.5 1 54340312.5 1.1726849 0.35812124
Error 139015125 3 46338375
Total 651673688 7 93096241.1
Tabla 13. ANOVA de la producción Final de esporas (UFC/ml).
En las tres tablas ANOVA se encuentra la agitación (Factor B), como el único factor
significativo, a un nivel de confianza del 92.8%, para la producción de esporas y por lo
tanto de toxinas proteicas.
Según los resultados de la experimentación, la agitación óptima para producir un mayor

número de esporas es 300 rpm, ya que propicia una adecuada velocidad de transferencia de
masa y evita posibles inundaciones del sistema a causa de la formación de esporas, como
sucedía a 400 rpm. A su vez, se obtiene una mayor producción de esporas en la mayoría de
los casos, tal y como se puede apreciar en la siguiente tabla:
B Y
(rpm) (UFC/ml)
400 1.790E+04
400 2.98E+03
300 8.320E+03
300 8.320E+03
400 2.133E+05
400 1.920E+03
300 3.083E+04
300 8.384E+03
Tabla 14. Relación entre la agitación y la producción de esporas
43
IQ-2004-I-23
7.2.2. ANOVA DE LA TASA DE CRECIMIENTO
En la siguiente tabla se encuentran consignados los datos obtenidos a partir de la tasa de

crecimiento de biomasa en gramos sobre litro por minuto
A B C D Y
(vvm) (rpm) (-) (g/L) (g/L/min)
1.5 400 0 50 0.0014
2.5 400 0 30 0.0018
1.5 300 0 30 0.0024
2.5 300 0 50 0.0027
1.5 400 1 30 0.004
2.5 400 1 50 0.0038
1.5 300 1 50 0.0055
2.5 300 1 30 0.0016
Tabla 15. Resultados del diseño de experimentos en términos de la Biomasa
La siguiente es la tabla ANOVA para esta variable de respuesta:
A 1.445E-06 1 1.445E-06 1.71005917 0.41561507
B 1.8E-07 1 1.8E-07 0.21301775 0.72472066
C 5.445E-06 1 5.445E-06 6.44378698 0.23890483
D ABC 0.00000162 1 0.00000162 1.91715976 0.39819614
AC 2.88E-06 1 2.88E-06 3.40828402 0.31603254
AB 1.805E-06 1 1.805E-06 2.13609467 0.38200383
Error 8.45E-07 1 8.45E-07
Total 0.00001422 7 2.0314E-06
Tabla 16. ANOVA del crecimiento microbial.
Como en el caso anterior, el efecto atribuido al error es la suma de cuadrados (SS) efecto de
la interacción BC, el cual es el que tiene menor efecto, ya que en este diseño factorial es de
una sola réplica.
Para hacer más robusta la prueba se añadió a la suma de cuadrados del error el efecto de la
interacción AB:
44
IQ-2004-I-23
A 1.445E-06 1 1.445E-06 1.09056604 0.40597193
B 1.8E-07 1 1.8E-07 0.13584906 0.74780119
C 5.445E-06 1 5.445E-06 4.10943396 0.17985524
D ABC 0.00000162 1 0.00000162 1.22264151 0.38405268
AC 2.88E-06 1 2.88E-06 2.17358491 0.27833826
Error 2.65E-06 2 1.325E-06
Total 0.00001422 7 2.0314E-06
Finalmente se agregó a la suma de cuadrados del error el efecto de la interacción AC:
A 1.445E-06 1 1.445E-06 0.78390597 0.44115828
B 1.8E-07 1 1.8E-07 0.09764919 0.77513101
C 5.445E-06 1 5.445E-06 2.95388788 0.18416496
D ABC 0.00000162 1 0.00000162 0.87884268 0.41767628
Error 5.53E-06 3 1.8433E-06
Total 0.00001422 7 2.0314E-06
En las tres tablas ANOVA de la tasa de crecimiento se encontró que el único factor
significativo es la forma de alimentación (Factor C). Se consideró que la concentración de
glucosa en el flujo de alimentación (Factor D) es relevante ya que tiene un P – valor bajo,
aunque no lo suficiente para ser significativo, siguiendo los parámetros de confiabilidad del
factor C. Esto se debe a que por el esquema de confusión, no es posible discernir que
proporción tiene el factor D respecto a la triple interacción ABC lo cual afecta la
significancia del mismo. Los otros dos factores resultaron no ser significativos.
Para evaluar la importancia de los niveles por los cuales se valoro el experimento para el
factor C y el factor D, se realizó una gráfica de contornos, donde se explica la relación que
existe entre la tasa de crecimiento específica (g/L/min) y la cantidad de glucosa consumida
(g/L) durante la fermentación
45
IQ-2004-I-23
Gráfico de efectos
0.006
0.005
Tasa de crecimiento
0.004
Nivel -C
0.003
Nivel +C
0.002
0.001
0
25 30 35 40 45 50 55
Cantidad de glucosa
Ilustración 20. Gráfica de contorno
Por medio de la anterior gráfica se puede apreciar que los niveles óptimos son los más
altos de cada uno de los factores significativos.
De esta misma forma, se procederá a mostrar un análisis gráfico que compara el

comportamiento microbial, según su relevancia en cuanto al modo de alimentación (Factor
C) (véase ilustración 22):
ANÁLISIS GRAFICO COMPARATIVO DEL COMPORTAMIENTO M ICROBIAL
20
18
16
14
12
Biomasa (g/L)
10
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Tiempo (min)
Ilustración 21. Análisis Gráfico comparativo del comportamiento microbial, según su factor de relevancia C, Rojo:
[Fermentación V, VI, VII] y Azul [Fermentación I, II, III, IV]
En, esta, se puede apreciar que para el nivel del modo de alimentación superior (flujo de
alimentación escalonado), se tiene una mayor producción final de biomasa, con valores que
oscilan entre los 14.5 y los 19 g/L, mientras que para el nivel inferior (flujo de
alimentación constante) se obtiene una menor producción final de biomasa, con valores que
oscilan entre 5.5 y 9 g/L.
Tomando en cuenta este resultado, donde el modo de alimentación escalonado resulta

relevante, se toma a consideración la concentración de glucosa en el flujo de alimentación
46
IQ-2004-I-23
(Factor D) y se observa la relevancia de este factor, tomando el crecimiento de la biomasa

de las fermentaciones con el Factor C en común, en la cual se aprecia la siguiente tendencia
(ilustración 23):
Análisis de Comportamiento Microbial
20
18
16
14
12
Biomasa (g/L)
10
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Tiempo (min)
Ilustración 22. Análisis Gráfico comparativo del comportamiento microbial, según su factor de relevancia D Rojo:
[Fermentación VI, VII] y Azul [Fermentación V, VIII]
Se observa, que para el nivel de la concentración de alimentación (50 g/L), se tiene una
mayor producción final de biomasa, con valores de 14.5 y 19 g/L, para las fermentaciones
VI y VII respectivamente; mientras que para el nivel inferior (30 g/L) se obtiene una menor
producción final de biomasa, con valores de 5.05 y 14.5 g/L.
Por lo tanto, se concluye que para garantizar una alta producción de biomasa, siguiendo los
parámetros estadísticos y gráficos, Las condiciones óptimas de operación son: Un modo de
alimentación escalonado (Factor C) y una concentración de 50 g/L de glucosa.
7.3. RELACIÓN ENTRE LA PRODUCCIÓN FINAL DE ESPORAS Y LA DE

BIOMASA.
Si se desea relacionar el resultado de la producción final de biomasa, con la producción

final de esporas, hay que partir del hecho, que se rechaza la hipótesis nula (H0), ya que
ninguna de las ocho fermentaciones realizadas presentó algún tipo de inhibición, ya sea por
el crecimiento microbial (debido a la baja concentración de glucosa disuelta en el medio) o
por inhibición en el momento de metabolizar esporas y toxinas proteicas, debido a la
sobresaturación de glucosa en el medio.
De lo anterior se obtiene:
47
IQ-2004-I-23
Producción final Producción

Fermentación de esporas final de
(UFC/mL) Biomasa (g/L)
1 1.72E+03 5.65
2 2.98E+03 6.7
3 8.32E+03 9
4 8.32E+03 10.5
5 2.13E+04 14.5
6 1.92E+03 14.5
7 3.08E+04 19
8* 8.38E+03 5.05
Tabla 19 . Datos comparativos entre la producción final de esporas (UFC/mL) y Biomasa (g/L).
*la Fermentación VIII no se toma en cuenta en el análisis.
Del cual se puede decir que el desarrollo del producto, está asociado con el crecimiento,
debido a que existe una directa proporcionalidad entre la producción final de esporas
(UFC/mL) y la producción final de biomasa (g/L); es decir, que a medida que aumenta la
concentración de esporas, aumenta la concentración de la biomasa.
Lo que implica que una alta concentración de glucosa y un modo de alimentación

escalonado, favorece directamente y de igual manera al metabolismo y desarrollo de
esporas y por ende de toxinas proteicas.
Por lo tanto, la fermentación que contiene los factores a sus niveles relevantes a considerar,
es la fermentación VII.
7.4. DATOS COMPARATIVOS ENTRE DIVERSOS MODELOS.
Para estudiar la eficiencia y efectividad del proceso desarrollado, se ha comparado la

fermentación VII, que obtuvo a su vez, la mayor producción de biomasa y esporas. Si se
compara este experimento con estudios realizados anteriormente en el CITEC16 y otras
investigaciones realizadas bajo condiciones de tiempo, concentración de glucosa en el flujo
de alimentación, flujo de aire y agitación similares, se obtiene:
16
Delgado, 2003.
48
IQ-2004-I-23
Tabla 20. Análisis comparativo de producción de esporas
Si se compara el resultado arrojado en este experimento, con los realizados anteriormente

en el CITEC, se observa un incremento del 600% en la producción final de esporas. De este
resultado se concluye, que el experimento, genera una gran efectividad y eficiencia de los
factores introducidos. Si se comparan los resultados con otros estudios, se observa que la
producción final de esporas es comparativamente baja (cantidad de esporas del orden de
109 UFC/mL). Es por esto que se recomienda realizar investigaciones y pruebas,
aumentando la concentración de oxígeno en el flujo de aire que alimenta el sistema.
7.5. PRUEBAS AL MODELO SIMULADO
Para encontrar la relación entre el experimento y la simulación se realizó una adecuada

validación y análisis del modelo matemático desarrollado para representar el
comportamiento microbial, el consumo de glucosa y la transferencia de oxígeno
Fue necesario entonces realizar una serie de pruebas tales como:
¾ Análisis de sensibilidad
¾ Análisis dimensional
¾ Reproducción del comportamiento
¾ Adecuación de los limites
¾ Errores de integración.
49
IQ-2004-I-23
7.5.1. Análisis de sensibilidad
Análisis del comportamiento de la sensibilidad de la Biomasa (X).
Para analizar el comportamiento del modelo ante variaciones de los parámetros implícitos
en la ecuación de la biomasa, será necesario variar parámetros que sean significativos y
representativos de la dinámica de la población de Bacillus thuringiensis. En este caso se
tiene que los factores críticos serian el µ máx. y el Yx/s debido a que el µ máx. es la cota
superior de la gráfica del crecimiento microbial versus el consumo de sustrato. Por otro
lado, el Yx/s es el porcentaje de producción de biomasa a partir del consumo de sustrato.
X: 1 - 2 - 3 - 4 -
1: 20
4
3
2
1
4
3
2
1
1: 10 4
3
2
1
4
3
2
1
1: 0
0.00 12.50 25.00 37.50 50.00
Page 2 Hours 10:01 vie, 02 de jul de 2004
COMPORTAMIENTO DE LA BIOMASA PARA DIFERENTES PARAMETRO…
Ilustración 23 Comportamiento de la biomasa para un µ máx. para valores de µ máx. de 1) 0.17 2) 0.21 3) 0.25 4) 0.3
Al variar únicamente µ máx y manteniendo el resto constante (“ceteris paribus”) se observa

que el comportamiento de la biomasa pareciera variar sólo al inicio de la simulación
durante las primeras 6 horas, y el comportamiento de la biomasa permanece igual por el
resto de la simulación.
50
IQ-2004-I-23
X: 1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 6 - 7 -
1: 30
1: 15
1: 0
0.00 12.50 25.00 37.50 50.00
comportamiento de la biomasa ente cambios de Y x/s
Ilustración 24 Comportamiento de la biomasa para un Y x/s para valores de Y x/s de

1) 0.2 2) 0.3 3) 0.4 4) 0.44 5) 0.5 6) 0.6 7) 0.7
Al variar los parámetros del valor de Yx/s se tiene que el modelo varía ostensiblemente
desarrollando aumentos en la cantidad de producción de biomasa variando entre 9 g/L y 30
g/L para parámetros entre 0.2 y 0.7 respectivamente, por ello se podría decir que el modelo
es mucho más sensible a los cambios del Yx/s que ante cambios en el µ máx.
Análisis del comportamiento de la sensibilidad del Sustrato (S).
en la ecuación del sustrato, será necesario variar parámetros que sean significativos y
representativos de la dinámica de consumo de glucosa. En este caso se tiene que los
factores críticos serian el Si y Yx/s. debido a que el Si es la concentración de alimentación en
la fase de alimentación fed- batch; por otro lado el Yx/s es el porcentaje de producción de
biomasa a partir del consumo de sustrato.
51
IQ-2004-I-23
S: 1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 6 - 7 -
1: 8
1: 4
1: 0
0.00 12.50 25.00 37.50 50.00
COMPORTAMIENTO DEL SUSTRATO PARA DIFERENTES VALORES DE Yx/s
Ilustración 25. Comportamiento del Sustrato para un Y x/s para valores de Y x/s de
1) 0.2 2) 0.3 3) 0.4 4) 0.44 5) 0.5 6) 0.6 7) 0.7
Al variar los parámetros del valor de Yx/s se tiene que el modelo solo varía en su fase
preliminar, en las primeras 8 horas de fermentación, para valores pequeños el sustrato se
agota mas rápidamente que para valores altos.
S: 1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 6 - 7 - 8 -
1: 8
1: 4
1: 0
0.00 12.50 25.00 37.50 50.00
COMPORTAMIENTO DEL SUSTRATO PARA DIFERENTES VALORES DE Si
Ilustración 26. Comportamiento de sustrato para valores de Si de

1) 10 g/L 2) 20 g/L 3) 30 g/L 4) 40 g/L 5) 50 g/L 6) 60 g/L 7) 70 g/L
52
IQ-2004-I-23
Al variar los parámetros del valor de Si se tiene que el modelo en la fase de alimentación
fed-batch, mantiene su nivel remanente de sustrato alto, a medida que la concentración de
alimentación, Si, es alto, mientras que para valores bajos de Si el nivel remanente de
sustrato se mantiene bajo.
Análisis de sensibilidad del OD
en la ecuación del oxígeno disuelto será necesario variar parámetros que sean
significativos y representativos de la dinámica de la población de Bacillus thuringiensis. En
este caso se tiene un factor crítico, el KLa, debido a que el KLa. Representa el coeficiente
volumétrico de transferencia de oxígeno disuelto dentro del reactor.
OD: 1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 6 - 7 - 8 - 9 - 10 - 11 -
1: 5
1: 3
1: 0
0.00 12.50 25.00 37.50 50.00
OXIGENO DISUALETO PARA VARIACIONES DEL Kla
Ilustración 27. Comportamiento del coeficiente volumétrico de transferencia de masa KLa (h-1), para valores de
1) 9 2) 10 3) 11 4) 12 5) 13 6) 14 7) 15 8) 16 9) 17 10) 18 11) 19
Se observa que a medida que se aumenta el valor del coeficiente volumétrico de

transferencia de masa de oxígeno aumenta la cantidad de oxígeno disuelto en el sistema,
mientras que si se reduce la transferencia el oxígeno disuelto llegaría a sus valores mínimos
en la mayoría de los casos, debido a que la “oferta” de oxigeno es igual a la “demanda” del
mismo por parte de la biomasa.
Por ello al aumentar la transferencia, se tiene que los valores de oxígeno disuelto aumentan;
aunque es incierto su efecto sobre el crecimiento celular ya que el oxígeno llegaría a
sobresaturar el sistema, y por ende las células morirían. Por lo anterior se podría intuir que
53
IQ-2004-I-23
la biomasa es dependiente del oxígeno disuelto, convirtiéndose así en una posible fuente de
estudio para futuras investigaciones.
A pesar de la posible “robustez” frente a las pruebas de sensibilidad que pudiera tener el
modelo, en realidad se tiene que el modelo cambia abruptamente para variaciones del nivel
de biomasa o de glucosa en el sistema. Si bien los parámetros externos que afectan estas
variables de manera directa no logran cambios representativos, implícitamente se cambian
las condiciones en las cuales se pueden desarrollar los Bacillus thuringensis y por ende el
comportamiento del sistema se “volatiliza”. Para ello sería bueno contrastar el
comportamiento del sistema para diversos valores de Yx/s (0.2, 0.44, 0.7), en los cuales si
se puede observar que no hay mayores variaciones para el comportamiento de S, estas
pequeñas variaciones se traducen en grandes variaciones de X.
1: S 2: X
1: 8
2: 30
2
1
1: 4
2: 15
2
2
1
1: 0 1 1
2: 0
0.00 12.50 25.00 37.50 50.00
Page 3 Hours 04:21 p.m. Mar, 06 de Jul de 2004
COMPORTAMIENTO DE X Y DE S PARA UN Yxs DE 0.7
Ilustración 28. Comportamiento de Crecimiento Microbial y del Sustrato para un Y x/s de 0.7
54
IQ-2004-I-23
1: S 2: X
1: 8
2: 20
1 2
1: 4
2: 10
2
2
1
1: 0 1 1
2: 0
0.00 12.50 25.00 37.50 50.00
COMPORTAMIENTO DE X Y DE S PARA UN Y xs DE 0.44
Ilustración 29. Comportamiento del Crecimiento Microbial y del sustrato para un Y x/s de 0.44
1: X 2: S
1: 10
2: 8
1
1: 5
2: 4
1
2
1
1: 1 2
2 2
2: 0
0.00 12.50 25.00 37.50 50.00
COMPORTAMIENTO DE X Y S PARA UN Yxs DE 0.2
Ilustración 30. Comportamiento del Crecimiento Microbial y del sustrato para un Y x/s de 0.2
7.5.2. ANÁLISIS DIMENSIONAL
Se hará un análisis de la consistencia dimensional del modelo de tal manera que las
unidades empleadas en el modelo tengan una contraparte en el mundo real sin la necesidad
de constantes o parámetros que busquen ajustar las unidades (Sterman, 2000).
55
IQ-2004-I-23
Para Cultivo batch, se tiene la ecuación para crecimiento microbial, X (g/L):

= µ x [ X + Yx / s × (S )]
dx
dt
Su análisis dimensional correspondiente es:
⎡ g ⎤ ⎡ 1 ⎤ ⎡ ⎡ g ⎤ ⎡⎛ g ⎞ ⎛ g ⎞⎤ ⎤
⎢⎣ L × h ⎥⎦ ≡ ⎢⎣ h ⎥⎦ × ⎢ ⎢⎣ L ⎥⎦ + ⎢⎜⎜ g ⎟⎟ × ⎜⎝ L ⎟⎠⎥ ⎥
⎣⎢ ⎣⎝ ⎠ ⎦ ⎦⎥
y para el consumo de sustrato, (g/L):
µ x [X + Yx / s × (S )]
ds 1
=−
dt Yx / s
Su análisis dimensional correspondiente:
⎡ g ⎤ ⎡ g ⎤ ⎡ 1 ⎤ ⎡ ⎡ g ⎤ ⎡⎛ g ⎞ ⎛ g ⎞⎤ ⎤
⎢⎣ L × h ⎥⎦ ≡ − ⎢ g ⎥ ⎢ h ⎥ × ⎢ ⎢ L ⎥ + ⎢⎜⎜ g ⎟⎟ × ⎜ L ⎟⎥ ⎥
⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎢⎣ ⎣ ⎦ ⎣⎝ ⎠ ⎝ ⎠⎦ ⎥⎦
Para el cultivo fed-batch, se tiene la ecuación de crecimiento microbial, X (g/L):
= X + µ x [ X + Yx / s × (S )]
dx F
dt V
⎡⎛ L ⎞ ⎤
⎡ g ⎤ ⎢⎜ h ⎟ ⎡ g ⎤ ⎥ ⎡ 1 ⎤ ⎡ ⎡ g ⎤ ⎡⎛ g ⎞ ⎛ g ⎞⎤ ⎤
⎢⎣ L × h ⎥⎦ ≡ ⎢⎜⎜ L ⎟⎟ × ⎢⎣ L ⎥⎦ ⎥ + ⎢⎣ h ⎥⎦ × ⎢ ⎢⎣ L ⎥⎦ + ⎢⎜⎜ g ⎟⎟ × ⎜⎝ L ⎟⎠⎥ ⎥
⎢⎣ ⎣⎝ ⎠ ⎦ ⎥⎦
⎣⎝ ⎠ ⎦
y para el consumo de sustrato, (g/L):
µ x [ X + Yx / s × (S )]
ds F 1
= (S a − S ) −
dt V Yx / s
56
IQ-2004-I-23
⎡⎛ L ⎞ ⎤
⎡ g ⎤ ⎢⎜ h ⎟ ⎡ g g ⎤ ⎥ ⎡ 1 ⎤ ⎡ ⎡ g ⎤ ⎡⎛ g ⎞ ⎛ g ⎞⎤ ⎤
⎢⎣ L × h ⎥⎦ ≡ ⎢⎜⎜ L ⎟⎟ × ⎢⎣ L − L ⎥⎦ ⎥ − ⎢⎣ h ⎥⎦ × ⎢ ⎢⎣ L ⎥⎦ + ⎢⎜⎜ g ⎟⎟ × ⎜⎝ L ⎟⎠⎥ ⎥
⎣⎝ ⎠ ⎦ ⎣⎢ ⎣⎝ ⎠ ⎦ ⎦⎥
Para la ecuación de Andrews, µx (h-1):
1
µ x = µ max
ks s
1+ +
s k IS
1 ⎡1⎤ 1
≡ ⎢ ⎥×
h ⎣ h ⎦ ⎡ ⎡ g ⎤ ⎡ g ⎤⎤
⎢1 + ⎢ L ⎥ + ⎢ L ⎥ ⎥
⎢ ⎢ g ⎥ ⎢ g ⎥⎥
⎢⎣ ⎣⎢ L ⎦⎥ ⎣⎢ L ⎦⎥ ⎥⎦
Para la ecuación de oxígeno disuelto se tiene que:
dC L Y
= K La (C * −C L ) − O / S µ X X
dt YX / S
⎡ ⎡⎛ g ⎞ ⎤⎤
⎡ g ⎤ ⎢ ⎡⎛ 1 ⎞ ⎛ mg mg ⎞⎤ ⎢ g ⎜ ⎟ ⎡1⎤ ⎡ g ⎤ ⎛ mg ⎞ ⎥ ⎥
≡ ⎢ ⎢⎜ ⎟ × ⎜ − ⎟ ⎥ − ⎢⎜ ⎟ × × × ⎜ 1000 ⎟⎥⎥
⎢ L × h⎥
⎣ ⎦ ⎢ ⎣⎝ h ⎠ ⎝ L L ⎠⎦ ⎢⎜ g ⎟ ⎢⎣ h ⎥⎦ ⎢⎣ L ⎥⎦ ⎜⎝ g ⎟⎠ ⎥ ⎥
⎣ ⎣⎝ g ⎠ ⎦⎦
7.5.3. PRUEBAS DE REPRODUCCIÓN DEL COMPORTAMIENTO
El objetivo de un modelador ha de ser el caracterizar el problema de manera dinámica. Esta

caracterización, sin embargo, no buscará representar de manera fidedigna el
comportamiento de las variables que describen la naturaleza del problema a través del
tiempo, sino que buscará comprender la estructura y las interrelaciones que conducen a que
este comportamiento se presente, esto será un patrón de comportamiento, que muestra
como y cuando surgió el problema y como se podría comportar el problema en un futuro
(Díaz, 2004).
57
IQ-2004-I-23
Esta prueba aborda la fidedignidad con la cual el modelo logra representar la realidad de
una problemática frente a los datos históricos sobre el mismo (Sterman, 2002) (citado en
Díaz, 2004). La mejor manera de realizar esta prueba es desarrollar una comparación entre
los modos de referencia del modelo. En este caso se compararán solamente los valores
simulados versus los valores experimentales de la biomasa, el sustrato y la cantidad de
oxígeno disuelto en el sistema.
COMPARACION DEL OD TEORICO Y EL OD EXPERIMENTAL
4,5
3,5
2,5
1,5
0,5
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
OD EXPERIMENTAL
T I E M P O ( mi n)
OD TEORICO
Ilustración 31. Comparación del OD teórico y el OD experimental
Al contrastar el comportamiento de la cantidad de oxígeno disuelto se puede observar que

los valores experimentales presentan grandes discrepancias respecto a los valores teóricos,
esto se puede deber a la aleatoriedad inherente al comportamiento del oxígeno, y a que las
ecuaciones implementadas en la simulación no son suficientes para explicar toda la
volatilidad del oxígeno disuelto.
COMPARACION DE LA BIOMASA (VALORES TEORICOS Y
REALES) FRENTE A FLUJOS CONSTANTES
10
9
BIOMASA (g/L)
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
TIEMPO (Min) BIOMASA EXPERIMENTAL

BIOMASA SIMULADA
58
IQ-2004-I-23
Ilustración 32. Comparación de la Biomasa (Valores Teóricos y Reales) frente a flujos constantes.
En el caso del comportamiento de la biomasa el modelo de simulación presenta un

comportamiento bastante aceptable, teniendo sólo una discrepancia de alrededor de una
unidad en el peor de los casos. De igual manera al realizar líneas de tendencia se puede
observar que ambas gráficas tienen pendientes casi iguales, y la única diferencia entre
ambas gráficas radica en el comportamiento inicial del sistema donde el comportamiento
del experimento pareciera tener una clara tendencia lineal a comparación del
comportamiento simulado que es un crecimiento exponencial cóncavo hacia abajo.
COMPARACION DEL SUSTRATO EXPERIMENTAL Y EL SUSTRATO

SIMULADO FRENTE A FLUJOS CONSTANTES
5
Sustrato (g/L)
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
SUSTRATO EXPERIMENTAL
Tiempo (Min)
SUSTRATO SIMULADO
Ilustración 33. Comparación del sustrato experimental y el sustrato simulado frente a flujos constantes.
El comportamiento del sustrato varía bastante entre los valores reales y los valores
simulados, aunque ambas gráficas presentan un comportamiento de decaimiento
exponencial, en el cual los valores del sustrato decaen de sus valores iniciales y se podría
pensar que al largo plazo convergen a números muy pequeños que tiendan a cero. La
diferencia que se encuentra entre el valor simulado y el teórico es que la primera decae
mucho más rápido a valores mínimos y cercanos a cero, mientras que la segunda tarda
alrededor de 10 horas en empezar a aproximarse a valores muy pequeños de glucosa en el
sistema. Esto puede ser fruto de las diferencias y pequeñas variaciones (no cuantificables)
que hayan sucedido durante la experimentación.
59
IQ-2004-I-23
COMPARACION VALORES ESPERIMENTALES DE LA BIOMASA VERSUS

VALORES ESPERADOS DE LA BIOMASA
20
15
BIOMASA (g/L)
10
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
TIEMPO (MINUTOS)
VALORES SIMULADOS
VALORES EXPERIMENTALES
Ilustración 34. Comparación valores experimentales de la biomasa versus valores esperados de la biomasa
El comportamiento de la biomasa para los valores simulados y los valores experimentales

presenta un comportamiento ligeramente diferente en gran parte del tiempo, pero convergen
a valores muy similares, aunque al realizar una línea de tendencia del valor experimental se
encuentra de nuevo (al igual que la biomasa en flujo constante) que la pendiente es similar
para ambos casos.
COMPARACION DEL COMPORTAMIENTO DEL SUSTRATO ENTRE

LOS DATOS SIMULADOS Y LOS VALORES EXPERIMENTALES
7
Sustrato (g/L)
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
COMPORTAMIENTO SIMULADO
Tiempo (Min)
COMPORTAMIENTO EXPERIMENTAL
Ilustración 35. Comparación del comportamiento del sustrato entre los datos simulados y los valores experimentales
A diferencia de la gráfica de flujos constantes, tenemos que para los flujos escalonados, se
comporta de manera similar aunque el comportamiento experimental pareciera hallarse
escalado hacia arriba en un valor cercano a una unidad. En ambos casos se presencia un
comportamiento de decaimiento exponencial, que tiende a converger a cero (nunca llegará
60
IQ-2004-I-23
a cero porque en la ecuación se reintrodujo una restricción que permitiera la existencia de

un “sustrato residual”).
7.5.4. ADECUACIÓN DE LOS LÍMITES
Con esta prueba se busca evaluar la sensibilidad del modelo frente a la variaciones que
puedan sufrir los límites del problema, para ello se buscará identificar si los conceptos que
abordan la explicación del problema se hallan endógenos o exógenos al modelo, o que tanto
cambian los efectos de las soluciones frente a las variaciones en los límites del modelo
(véase Sterman, 200, p. 859).
Dentro de la formulación del modelo, se tiene que la concentración de oxígeno se hallaba

endógena al problema, es decir dependía de las interacciones entre sustrato y biomasa, pero
no afectaba el comportamiento de estas últimas, ya que sería de esperarse que cuando la
concentración de O2 fuera muy grande, o fuera mínima, la biomasa se reduciría por
sobresaturación de oxígeno o por ausencia del mismo.
El modelo en general tiene una gran cantidad de variables exógenas, que son determinantes
de el comportamiento del sistema, y muchas de la cuales se podría llegar a pensar que
dependerá de los valores de otras variables del modelo y no serían constantes ajenas al
modelo, sino que su comportamiento y sus valores fueran función de la dinámica entre
biomasa, sustrato y concentración de OD. Por ejemplo el KLa (coeficiente volumétrico de
transferencia de masa) puede depender de la agitación y de el flujo de aire (Hoyos, 2003),
pero para propósito de las pruebas y la construcción del diseño del experimento y su
comparación con la simulación teórica, se tiene que estos parámetros no son relevantes para
el modelo ya que permanecen constantes durante todo el tiempo de estudio. En vez de tener
en cuenta esta consideración, se optó por considerar el rango de valores establecidos para
KLa por Avignone (1992).
Yx/s es el coeficiente de producción de biomasa por consumo de glucosa. Dentro del

modelo planteado Yx/s es una constante que se calculó en función del la brecha entre el
valor final y el inicial de la biomasa entre el consumo de glucosa. Debido a que se busca
evaluar el impacto de la interacción entre glucosa y biomasa, se generarían interacciones
adicionales (que no aportarían mucho al estudio de la biomasa) que no serán abordadas
actualmente por el modelo planteado.
Yo/s es el coeficiente de consumo de oxígeno por el consumo de glucosa, y tal como se halla
definido, depende del oxígeno disuelto (OD) y del sustrato (S), de tal manera que estaría
función de estos dos parámetros, por simplificación se optó por estimar este valor como una
constante y poder evaluar el impacto del cambio de otras variables dentro del modelo.
61
IQ-2004-I-23
El valor de referencia OD es un valor que no cambiarán nunca ni durante el experimento ni

en la simulación, debido a que este parámetro caracteriza el entorno en el cual se realiza el
experimento. En este caso el OD de referencia es la cantidad de oxígeno en saturación en
Bogotá a una altura de 2600 m.
Si es la concentración de alimentación para un flujo que alimente el sistema de la forma

fed-batch, se estableció siguiendo las recomendaciones planteadas por estudios anteriores
que se hallaban relacionados con el comportamiento del Bacillus thuringensis, razón por la
cual se optó por considerarlo una variable externa a este modelo.
V es el marco o la restricción espacial en la cual se desenvuelven los Bacillus thuringensis,

esta va a ser una constante que “variará” para ciertos intervalos de tiempo, ya que en
ciertos momentos del experimento el volumen cambia pasando de una capacidad de 3.0 L a
una de 3.66 L para el caso del flujo escalonado y tendrá un valor de 3.48 L para un flujo
constante.
En el caso de F, el flujo al cual se alimenta el sistema, tenemos de manera análoga al

comportamiento del volumen que este valor varía en función del tiempo cuando el flujo
pasa de ser constante a uno escalonado.
7.5.5. ERRORES DE INTEGRACIÓN
Para analizar el comportamiento del modelo de simulación se optará por contrastar el

comportamiento de las tres variables mas importantes dentro del sistema (sustrato, biomasa
y concentración de oxígeno disuelto) para diferentes métodos de interpolación y dar
solución a las ecuaciones diferenciales. Estos métodos son el método de Euler, el método
Runge Kutta de segundo orden y el método Runge Kutta de cuarto orden (para mayor
información véase Burden 2002)
Inicialmente se analizará el comportamiento de la biomasa, luego el sustrato y finalmente la

concentración de oxígeno disuelto para los tres sistemas de integración, esperando
encontrar diferencias entre las gráficas para los diferentes métodos.
62
IQ-2004-I-23
X: 1 - 2 - 3 -
1: 20
3
2
1
3
2
1
1: 10
3
2
1
3
2
1
1: 0
0.00 12.50 25.00 37.50 50.00
CPOMPARACION DE LA BIOMASA PARA DIFERENTES METODOS DE INTEGRACION
Ilustración 36. Comparación de la Biomasa para diferentes métodos de integración
S: 1 - 2 - 3 -
1: 8
1: 4
3
1 2 3 1 2 3 1 2 3
1: 0
0.00 12.50 25.00 37.50 50.00
COMPARACION DEL SUSTRATO PARA DIVERSOS METODOS DE INTEGRACION
Ilustración 37. Comparación del Sustrato para diferentes métodos de integración
63
IQ-2004-I-23
OD: 1 - 2 - 3 -
1: 5
1: 3
3
3 1 2 3 1 2 3
2
1: 0 1 2
0.00 12.50 25.00 37.50 50.00
COMPARACION DEL OD PARA DIVERSOS METODOS DE INTEGRACION
Ilustración 38. Comparación del Oxígeno Disuelto para diferentes métodos de integración
Al observar el comportamiento tanto de la biomasa como de la concentración de oxígeno

disuelto y del sustrato (consumo de glucosa), se tiene que los tres métodos se comportan de
manera idéntica. Ello en parte se puede deber al bajo grado de las ecuaciones diferenciales
asociadas a las variables de interés representadas por el modelo matemático implementado,
razón por la cual los errores que pudieran generarse al usar los diferentes métodos de
interpolación son mínimos.
64
IQ-2004-I-23
CONCLUSIONES
El análisis estadístico realizado para la producción final de esporas (UFC/mL) se encontró

que la agitación (Factor B) es el factor más relevante para la producción de esporas y se
acepta con un grado de confianza del 90.8%. Y mediante la experimentación se encuentra
que para obtener una mayor producción de esporas y evitar posibles inundaciones del
sistema se recomienda operar a una velocidad de 300 rpm.
A través del análisis de varianza ANOVA realizado para la biomasa en términos de la tasa
específica de crecimiento (g/L/min), se obtuvo que los factores significativos fueron: El
modo de alimentación (factor C) y la concentración de glucosa en el flujo de alimentación
(factor D). Los cuales, resultan ser relevantes cuando se encuentran en niveles altos, es
decir, un flujo de alimentación escalonado y una concentración de glucosa en el flujo de
alimentación de 50 g/L. Por lo tanto las fermentaciones óptimas a desarrollar son la
Fermentación VI y la Fermentación VII.
Al tomar en cuenta los análisis estadísticos de las dos variables de respuesta (producción
final de esporas en términos del promedio y el crecimiento microbial, en términos de la tasa
especifica de crecimiento), se recomienda para un futuro escalamiento industrial la
fermentación VII.
Si se establece una relación entre la producción final de esporas y la producción final de

biomasa, se encuentra que la formación del producto esta asociado al producto, es decir,
que la producción final de esporas y la de biomasa son directamente proporcionales, ya que
a medida que aumenta la producción de biomasa, aumenta la de esporas. Por lo tanto, el
flujo de alimentación escalonado (Factor C, superior) y la concentración de glucosa de 50
g/L (Factor D) favorecen directamente la producción final de esporas
Para medir la efectividad y eficiencia de la producción de esporas y por ende de toxinas

proteicas, se realizó una comparación con otros modelos realizados en el CITEC y otros
encontrados en investigaciones realizadas por Kang (1992). De ella se pudo concluir que la
producción final de esporas de la fermentación Fed-batch continua realizada en esta
investigación supera a los valores registrados anteriormente en CITEC por fermentación
batch y fermentación fed-batch discontinua (Delgado, 2003). Si se comparan estos
resultados con los datos arrojados por la investigación de Kang (1992), se encuentra que los
valores de la producción final de esporas son muy bajos; esto se debe a que Kang aumentó
65
IQ-2004-I-23
la concentración de oxígeno en el flujo de aire de alimentación al sistema, buscando

garantizar un oxígeno disuelto OD mínimo de 2 a 3 ppm, ya que finalmente, es la
transferencia de oxígeno es el directo responsable de la formación de esporas en el sistema.
Es por esto, que se recomienda aumentar el coeficiente de transferencia de oxígeno KLa
(mayor al utilizado de 13.5 h-1), el cual resulta ser una variable crítica tanto para el sistema
como para el modelo (ver análisis de sensibilidad), aunque esta variación en el coeficiente
de transferencia de oxígeno KLa puede ser fuente de estudios futuros, donde se considere el
aumento de costo de un insumo adicional, pero a la vez el aumento en la rentabilidad
debido a las mejoras existentes en la producción de esporas.
A partir de un análisis de sensibilidad para el modelo de simulación se encontró que el

sistema es sensible para variables tales como el Yx/s (%), KLa (h-1), Si (g/L) y el modo de
alimentación, por lo cual es necesario buscar cierto rango para estas variables que permita
reproducir adecuadamente los experimentos.
Al realizar la prueba de reproducción de comportamiento se puede observar que tanto para

los dos escenarios, el comportamiento de crecimiento microbial y consumo de glucosa de
los valores simulados, resultaron ser una representación aceptable frente a los valores
experimentales, mientras que para el comportamiento de transferencia de oxígeno
representa serias discrepancias debidos a la aleatoriedad inherente en la experimentación
que no se tomo en cuenta en la ecuación.
Por medio de la adecuación de límites, se establecieron las variables endógenas al sistema

que son el comportamiento del oxígeno, Yx/s y Yo/s, y las exógenos son KLa, Si, V y F.
Una de las grandes falencias del modelo de simulación implementado es que la biomasa no
depende de la concentración de oxígeno existente en el sistema, aunque se pudiera inferir
que a menores cantidades de oxígeno habría una menor biomasa, o contrario a esto, si su
valor fuera demasiado grande, la biomasa se reduciría por sobresaturación de oxígeno.
Adicionalmente se podría pensar que la cantidad de oxígeno en el sistema dependería de la
biomasa existente en el mismo, ya que a mayor cantidad de biomasa existiría un mayor
consumo de O2, por lo tanto será necesario establecer una relación entre biomasa y oxígeno
y viceversa, para buscar capturar de mejor manera el comportamiento del sistema.
66
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BIBLIOGRAFÍA
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69
IQ-2004-I-23
Anexo A
MEDIO DE CULTIVO
De la revisión bibliográfica se destaca la utilización de glucosa como fuente de carbono 17,

como fuente de nitrógeno extracto de levadura18. Se conoce también la importancia de
ciertos elementos inorgánicos cuyo efecto puede ser explicado en términos de activación o
inhibición enzimática en su proceso metabólicos, se enfatiza la importancia de Mn+2, K+,
Ca+2. Las sales comúnmente utilizadas son: K2PO4, MgSO4.7H2O, CaCO3, CaCl2,
(NH4)2SO4. Adicionalmente, se menciona el empleo de sustancias que estimules a las
células para que aumenten su velocidad de crecimiento llamadas factores de crecimiento19.
Selección de Factores
El medio para el crecimiento deberá contener mínimo una fuente de materia y energía, que
se proporciona con glucosa como fuente de carbono: esta se utiliza principalmente en la
fase de crecimiento vegetativo y es metabolizada. Como fuente de nitrógeno inorgánico se
utilizo sulfato de amonio, que se consume en la fase exponencial de crecimiento, como
fuente orgánica de nitrógeno se encuentra el extracto de levadura, cuya composición es:
AMINOÁCIDO COMPOSICIÓN
Ácido aspártico 5.240
Treonina 5.520
Serina 2.540
Prolina 2.180
Acido glutámico 5.220
Glicina 4.600
Alanita 4.760
Valina 3.280
Metionina
Isoleucina 2.240
Leucina 3.160
Tirosina 1.920
Fenilalanina 1.600
Lisina 4.600
Histidina 0.740
Arginina 0.920
Cistina Trazas
Tabla 21. Contenido de Aminoácidos (en mmoles/10mg del extracto de levadura)20
17
Rossa y Mignone, 1993; Navarro y Acosta, 1994
18
Estola, 1985
19
Duarte, 1991
20
Merk, 1990
70
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Los aminoácidos pueden ayudar también a formar intermediarios del ciclo de los Ácidos
Tricarboxilicos, utilizados como fuente de energía, la importancia de estos aminoácidos se
verifica porque en las células vegetativas y esporas se encuentra glutamato y alanita en
elevadas concentraciones.
Dentro los minerales importantes se encuentran:
Ca+2: es importante en la esporulación puesto que formaron el ácido dipicolínico

(aminoácido sintetizado durante la esporulación), el dipicolinato de calcio, constituyente
importante de la pared de la espora que resulta ser un compuesto estabilizador,
especialmente para el calor y rayos ultravioleta: durante la germinación el dipicolinato se
libera en el medio, la limitación de crecimiento Ca produce esporas menos resistentes al
calor21.
K+: es fundamental para el crecimiento, esporulación y producción de la endotoxina, se

sabe además que la capacidad para degradar PHB (compuesto intermedio en el ciclo
metabólico de BT) depende entre otros de la presencia de K.
Mn+2: es esencial para la formación de endoesporas –en las distintas especies de bacillus, su
deficiencia afecta la actividad de fosfoglicerato fosfomutasa, porque esta enzima requiere
Mn como cofactor.
Mg+2: junto con el fósforo intervienen en las reacciones que involucran adenosín difosfato
en la transferencia de energía.
Composición medio de cultivo líquido:
Componentes Cantidad (g/L)

Glucosa anhídrido 8
Extracto de levadura 8
Fosfato monobásico de Potasio 3
Fosfato bibásico de Potasio 3
Sulfato de Amonio 1
Cloruro de calcio 0.41
Sulfato de Magnesio 4
Tabla 22. Medio de Cultivo
Para una correcta esterilización, se debe autoclavar la glucosa y el sulfato de magnesio

aparte del resto de ingredientes, en las siguientes proporciones:
21
Estola, 1985
71
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Componentes del medio Líquido Volumen Total (%)

Glucosa Anhidrida 10
Fosfato monobásico de Potasio 80
Tabla 23. Porcentaje del medio de cultivo
Composición del medio de cultivo sólido LB:
Componentes Cantidad (g/L)

B Bacto-Tryptone 10
Cloruro de sodio 15
Agar 15
Tabla 24. medio de cultivo LB
72
IQ-2004-I-23
Anexo B22
METODOLOGÍAS PARA LOS PARÁMETROS DE EVALUACIÓN.
A partir de cada una de las fermentaciones, se tomaron de nueve a diez muestras a

diferentes instantes de tiempo.
Procedimiento de secado de muestras:
1. Se colocan los eppendor de 1.5 ml en el horno por una hora a 104 ºC.
2. Se llevan al desecador por media hora.
3. Se toma nota del peso de cada uno de los tubos.
4. Se toma 1 ml de cada una de las muestras a distintos instantes de tiempo por
fermentación.
5. Se va a la centrifugadora por 10 minutos (procurar mantener el eje de simetría entre
las muestras).
6. Retirar el sobrenadante (este ira a la prueba de sustratos).
7. A el fondo se le realiza un lavado con agua destilada para sustraer los posibles
solubles.
8. Retirar el sobrenadante.
9. Repetir el paso 7.
10. El fondo ira para la prueba de peso seco.
Determinación de Biomasa.
La determinación de biomasa es una estimación para conocer la concentración de

microorganismos que hay en una muestra, una de las metodologías para determinarla es el
peso seco.
Procedimiento:
1. Los tubos centrifugados, van al horno por espacio de una hora (en el caso de que no
este completamente seca dejar por mas tiempo)
2. Colocar en el desecador por espacio de una hora.
3. Se pesa los tubos y por diferencia de pesos se obtiene el valor del peso de la
biomasa.
7.0 Determinación de Azucares
Para determinación de azúcares reductores, como la glucosa, se utilizó el método DNS,

basado en la colorimetría dada por el ácido Di-nitro-salicílico, el cual reduce la glucosa
22
Manual Laboratorio Polímeros y Biopolímeros
73
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transformándolo en 3-amino-5-nitro-salicílico de color naranja rojo. La densidad óptica

del color producido es directamente proporcional a la cantidad del cuerpo reducido y a
la cantidad de glucosa en la solución.
Procedimiento
1. Se toma 800 µL de muestra y se completa a volumen con 10 mL de agua
destilada.
2. Se toma 2 mL de la muestra anterior y se mezcla con 5 mL de DNS.
3. Se calienta por 15 minutos, contabilizándolo a partir del punto de ebullición.
4. Se observa la absorbancia por el espectrofotómetro.
Determinación de la concentración de esporas.
Debido a que Bacillus thuringiensis es una bacteria esporulada, y que la esporulación esta
acoplada a la formación del cristal. El método que será utilizado para cuantificar la
concentración de esporas es el conteo de unidades formadoras de colonias UFC en caja de
petric.
Procedimiento.
1. Se preparan 7 tubos de ensayo, cada uno con 4.5 ml de agua estéril.

2. Se preparan 6 cajas de petric con medio sólido LB.
3. Se toma 500 µL de la ultima muestra de la fermentación y se hace una dilución
1/10 en uno e los 7 tubos de ensayo, para completar 5 ml.
4. Seguidamente se hace el mismo procedimiento se toma 500 µL de la mezcla
anterior y se agrega a un segundo tubo se ensayo.
5. Este procedimiento se hace hasta llegar a una dilución de 10–7 en el séptimo tubo.
6. Se toman las dos últimas muestras 10 –6 y 10 –7.
7. Se llevan a choque térmico. Este consiste en colocar las muestras a baño Maria a 80
ºC por 10 minutos.
8. Una vez se alcance la temperatura ambiente se toman 100 µL y se siembran e una
caja petric, este procedimiento se realiza por triplicado.
9. Se llevan a incubación por 20 horas a 30 ºC.
10. Se realiza el conteo de esporas y se escoge la dilución que presente una cifra más
cercana a 100.
Determinación de Proteínas.
Una de las principales características de las proteínas expresadas por B. Thuringiensis

es la que permite diferenciar cualitativamente el peso molecular. Uno de los
74
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procedimientos más adecuados para realizar una electroforesis en gel de poliacrilamida

(SGD PAGE).
Procedimiento.
1. Preparación del gel 10% para ml del gel:

Agua destilada: 2 ml
Tris-HCL 1.5 M pH: 8.8: 1.25 ml.
SDS 10% (w/v): 50 µL
2. Solución Acrilamida/Bisacrilamida al 30%:
Persulfato de amonio al 10%: 1.667 ml.
Temed: 10 µL
Se coloca en las láminas de vidrio.
3. Stakin Gel al 4% para un volumen de 2.5 mL:
Agua destilada 1.6 ml
Tris-HCL 0.5 M pH: 6.8: 625 µL.
SDS 10% (w/v) : 25 µL.
Acrilamida (30 g) + Bisacrilamida (1.6 g): 375 µL.
Persulfato de amonio 10%: 21 µl.
Temed: 28 µL.
Se coloca encima del anterior gel, colocándose la peineta y esperar 30
minutos hasta que endurezca.
4. Buffer de la muestra:
Agua deshionizada: 3.8 mL.
Tris-HCL 0.5 M pH: 6.5: 10 ml
Glycerol : 0.8 ml
SDS 10% (w/v) : 1.6 mL.
2 mercaptoetanol: 0.4 mL.
Azul de bromofenol 1% (w/v): 0.4 mL.
Diluir la muestra 1:4 con el buffer de la muestra y calentar a 95 ºC por 4
minutos.
5. Buffer de corrida
Glicina: 14.4 g
Trizma Base: 3.03 g
SDS al 20%: 5 mL.
Se completa con agua desionizada: hasta 1000 ml.
Una vez estén las muestras y el patrón en el gel, tapar la cámara, verificar el
color de los electrodos y colocar en 18 mA constantes hasta que lleguen al
final del gel las muestras.
6. Fijación de las proteínas
Una vez terminada la electroforesis, se sumerge los vidrios con el gel durante 5
minutos en la solución de fijado.
75
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Metano: 25 mL.
Agua: 75 mL
Ácido acético: 7 mL
Luego con ayuda de la micro espátula se despega el gel, Y se deja el gel por
mas de una hora.
7. Tinción de las proteínas con Azul de comassie al 0.2%.
Después de la fijación, se sumerge el gel en la solución de azul de conassie de 0.2%
durante media hora.
Azul de conassie: 0.2 g
Metanol: 50 mL
Ácido acético glacial: 5 ml
Se completa con agua hasta 1000 mL.
8. Decoloración del gel.
Se sumerge el gel en solución de ácido acético al 10 y 30 % de metanol. Cambiar la
solución 3 o 4 veces hasta obtener una buena decoloración.
9. Patrones estándares utilizados en la electroforesis:
Bio-rad. Broad Range, Catalog 161- 0.318, control 81623
Proteína Peso Molecular [Da]

Myosin 207.000
B-galactosidasa 121.000
Bovine Serium Albumin 81.000
Ovalbumin 51.000
Carbonic Anhydrase 33.600
Soybean Trypsin inhibitor 28.600
Lisozyme 21.100
Aprotinin 7.500
Tabla 25. Patrones estándares de proteína
76
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Anexo C
CALCULO DE CONSTANTES
Calculo del oxígeno disuelto en saturación.
Tabla 26 . Densidad del agua23
Tabla 27. Constante de Henry24
Según la ley de Dalton:

ni
pi = pt = pt yi
nt
La fracción de oxígeno en el aire es 21%

Yi= 0.21
p i = 0.74 atm × 0.21 = 0.156 atm
23
Perry, tabla 2-28
24
Ibid, 127.
77
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De la tabla de la constante de Henry, se obtiene H30ºC= 47500 atm/fracción mol.

Según Henry:
pi = Hx
pi mol O2
x= = 3.2816 × 10 −6
H mol total de s ln
1 mol H 2 O ⎡ 3.2819 × 10 −6 ⎤ 32 g O2
1 g H 2O × × = 5.83 × 10 −6 g O2
( ⎢ −6 ⎥
)
18 g H 2 O ⎣ 1 − 3.2819 × 10 ⎦ 1 mol O2
g O2 1000 mg 1000 g 995.647 KgH 2 O 1 m 3 mg O2
5.83 × 10 −6 × × × 3
× = 5.8032 = 5.8092 ppm
g H 2 O 1 g O2 1 Kg 1m 1000 L L
Estequiometría:
La estequiometría para el crecimiento celular varía con el microorganismo, con el sustrato y

las condiciones ambientales como el pH, temperatura y potencial de reducción.
Coeficiente de producción:
Biomasa Formada
Yx =
s Sustrato Consumido
X − Xo
Yx =
s So − S
1
Yx =
s Ys
x
Obtención de la constante de µmax y Ks.
Para hallar la tasa de crecimiento en cada punto se utiliza la siguiente ecuación:
X i +1 − X i −1
T −T
µ i = i +1 i −1
Xi
78
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Donde X, representa la biomasa; T el tiempo y i el instante de tiempo.
Se grafican cada µi con su correspondiente concentración de sustrato Si y se obtiene una

gráfica como la que se observa continuación:
Ilustración 39. Gráfica de la tasa específica de crecimiento contra la concentración de sustrato, S
De esta manera se obtiene el µmax y el Ks.
79
IQ-2004-I-23
Anexo D.
METODOLOGÍA DE FERMENTACIÓN
Procedimiento de Inoculación y Procedimiento Batch (T: 0-5 h) y (T: 17-50 h)
Para poder realizar el procedimiento de inoculación, se preparó un medio de cultivo con un

volumen total de 300 ml (Composición ver Anexo A) y con un ml de la solución de
esporas; este último equivale al 9% del volumen de control de un erlenmeyer de 500 ml, a
una temperatura de 30 ºC por un tiempo de 14 horas en el shaker. Este procedimiento se
desarrolla con el fin de disminuir la fase estacionaria.
Pasado el tiempo de inoculación, se paso el inóculo al fermentador (Bioflo 3000 New

Brunswick de 5 L de capacidad total) de manera aséptica con un volumen de medio de
cultivo de 2.7 ml, en las siguientes condiciones de fermentación:
• Temperatura: 30ºC (Controlador PID)

• pH: 6.5-8.0 (monitoreado por un electrodo pH Mettler Toledo)
• Velocidad de agitación: 300 – 400 rpm (Controlador PID), monitoreado por un
electrodo polarogáfico de oxígeno.
Procedimiento Fed-batch (T: 5-17 h)
Para realizar el procedimiento de fermentación Fed-batch, se tubo en cuenta el rango de

concentración óptima de sustrato y tipo de alimentación, hallados en estudios anteriores.
• El rango de concentración de Sustrato (glucosa) es de: [30 – 50 g/L].
• Tipo de alimentación:
1. Alimentación constante: 0.04 L/h
2. Alimentación escalonada: 0.04 L/h las primeras seis horas y 0.07 L/h las
siguientes 6 horas.
La fermentación fed-batch continua se desarrolla bajo las condiciones de operación
mencionadas en el epígrafe anterior.
80
IQ-2004-I-23
Anexo E.
TABLAS DE DATOS.
Primera fermentación
Condiciones:
Flujo de Aire 1,5 Vvm

Velocidad de agitación 400 Rpm
Modo de alimentación 40 ml/h
Concentración de glucosa 30 g/L
Oxigeno disuelto saturado 5,8092 Ppm
Tabla 28. Condiciones para la Fermentación I
Toma de datos del Oxígeno disuelto (% y ppm), pH y Biomasa.
Biomasa
T OD
OD (%) pH Promedi
(min) (ppm)
o (g/L)
0 79,5 4,618 6,52 1,05
30 78,8 4,578 6,52
60 77,7 4,514 6,48
90 76,3 4,432 6,5
120 73,9 4,293 6,5
150 69,3 4,026 6,5
180 58,6 3,404 6,5
210 48,4 2,812 6,5 1,35
240 36,6 2,126 6,5
270 30,4 1,766 6,5
300 22,2 1,290 6,5 1,85
330 15,8 0,918 6,5
360 12,8 0,744 6,5
390 81,6 4,740 6,5 2,05
1140 78,2 4,543 7,08 3,3
1170 16,4 0,953 7,08
1440 1,3 0,076 7,08
1470 1 0,058 7,35
1500 1 0,058 7,15 3,65
1530 1,2 0,070 7,09
1560 1,4 0,081 7,09
81
IQ-2004-I-23
Biomasa
T OD
OD (%) pH Promedi
(min) (ppm)
o (g/L)
1590 1,2 0,070 7,01
1620 1,1 0,064 6,98 4,25
2790 18,5 1,075 7,29
2820 21,7 1,261 7,34
2850 24,2 1,406 7,37
2880 16,2 0,941 7,6 4,85
2910 13,4 0,778 7,78
2940 25,9 1,505 7,85
2970 30,3 1,760 7,88
3000 27,3 1,586 7,9 5,65
Tabla 29. Datos de Oxígeno disuelto, pH y Biomasa para la Fermentación I
Datos de Biomasa
Peso Inicial Peso Final Diferencia Biomasa

Muestra Ref. Tubo
(g/ml) (g/ml) (g/ml) (g/L)
1 A21 0,9469 0,9479 0,001 1

A17 0,9399 0,941 0,0011 1,1
2 A13 0,8997 0,9012 0,0015 1,5
A20 0,9056 0,9068 0,0012 1,2
3 A11 0,8975 0,8993 0,0018 1,8
A19 0,895 0,8969 0,0019 1,9
4 A6 0,9455 0,9474 0,0019 1,9
A7 0,9024 0,9046 0,0022 2,2
5 A21 0,9038 0,9073 0,0035 3,5
A1 0,9268 0,9299 0,0031 3,1
6 A14 0,8969 0,9006 0,0037 3,7
A5 0,9022 0,9058 0,0036 3,6
7 A16 0,905 0,9091 0,0041 4,1
A4 0,934 0,9384 0,0044 4,4
8 A19 0,8946 0,8996 0,005 5
A8 0,9327 0,9374 0,0047 4,7
9 A8 0,9333 0,9391 0,0058 5,8
A14 0,8963 0,9018 0,0055 5,5
Tabla 30. . Datos de la Biomasa para la Fermentación I
82
IQ-2004-I-23
Datos de consumo de Glucosa
Muestra abs. (nm) Glucosa (g/L)

1 0,3672 7,6897424
2 0,2479 5,1675018
3 0,153 3,161126
4 0,0249 0,4528358
5 0,014 0,222388
6 0,0122 0,1843324
7 0,0079 0,0934218
8 0,0053 0,0384526
9 0,0036 0,0025112
Tabla 31. Datos de consumo de glucosa para la Fermentación I
Síntesis de datos
Biomasa Sustrato
Muestra T (min) OD (ppm)
(g/L) (g/L)
1 0 1,05 4,618 7,6897424

2 210 1,35 2,812 5,1675018
3 300 1,85 1,290 3,161126
4 390 2,05 4,740 0,4528358
5 1140 3,3 4,543 0,222388
6 1500 3,65 0,058 0,1843324
7 1620 4,25 0,064 0,0934218
8 2880 4,85 0,941 0,0384526
9 3000 5,65 1,586 0,0025112
Tabla 32. Síntesis de datos para la Fermentación I
Conteo de Esporas
1 2 3
-6
10 IND IND IND
10-7 IND 28 IND
Tabla 33. Conteo de esporas para la Fermentación I
83
IQ-2004-I-23
Segunda fermentación
Condiciones:

Tabla 34. Condiciones para la Fermentación II
Biomasa
t (min) OD (%) OD (ppm) pH Promedio
(g/L)
0 80 4,647 6,5 1,05
30 75,4 4,380 6,5
60 73,9 4,293 6,5
90 71,9 4,177 6,5
120 70,8 4,113 6,5
150 70 4,066 6,5
180 68,6 3,985 6,5
210 65,9 3,828 6,5
240 63,3 3,677 6,5
270 52 3,021 6,5
300 45,8 2,661 6,5 1,5
330 39,2 2,277 6,5
360 4,4 0,256 6,5
390 5,8 0,337 6,5
420 7,2 0,418 6,5
450 9,3 0,540 6,5 2,15
480 10,2 0,593 6,5
510 14,1 0,819 6,5
540 9,9 0,575 6,5
570 10 0,581 6,5
600 10,7 0,622 6,5 2,5
1560 86,1 5,002 7,32 3,6
1590 82,6 4,798 7,32
1620 81,1 4,711 7,32
84
IQ-2004-I-23
Biomasa
t (min) OD (%) OD (ppm) pH Promedio
(g/L)
1650 79,9 4,642 7,32 3,85
1680 68,2 3,962 7,26
1710 64,4 3,741 7,24
1740 58,3 3,387 7,21
1770 59,1 3,433 7,23 4,05
1800 56,4 3,276 7,25
1830 46,9 2,725 7,27
1860 39,8 2,312 7,27
1890 32,4 1,882 7,27
1920 21,4 1,243 7,3 4,25
1950 11,2 0,651 7,3
1980 7,9 0,459 7,3
2010 5,9 0,343 7,3
2040 6,8 0,395 7,3 5
3000 10 0,581 7,76 6,7
Tabla 35. Datos de Oxígeno disuelto, pH y Biomasa para la Fermentación II
Datos de Biomasa

Muestra Ref. Tubo
1 A17 0,9393 0,9402 0,0009 0,9

A13 0,8994 0,9006 0,0012 1,2
2 A14 0,8963 0,8979 0,0016 1,6
A11 0,8975 0,8989 0,0014 1,4
3 A22 0,9371 0,9392 0,0021 2,1
A10 0,898 0,9002 0,0022 2,2
4 A6 0,903 0,9055 0,0025 2,5
A4 0,9345 0,937 0,0025 2,5
5 A24 0,9068 0,9105 0,0037 3,7
A17 0,939 0,9425 0,0035 3,5
6 A7 0,9264 0,9301 0,0037 3,7
A20 0,9049 0,9089 0,004 4
7 A1 0,9017 0,9058 0,0041 4,1
A21 0,9454 0,9494 0,004 4
8 A6 0,9031 0,9074 0,0043 4,3
A18 0,9305 0,9347 0,0042 4,2
9 A2 0,9135 0,9184 0,0049 4,9
A12 0,902 0,9071 0,0051 5,1
85
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10 A16 0,905 0,9118 0,0068 6,8

A15 0,9026 0,9092 0,0066 6,6
Tabla 36. Datos de la Biomasa para la Fermentación II

1 0,3878 8,1252676
2 0,2836 5,9222712
3 0,0105 0,148391
4 0,0097 0,1314774
5 0,0081 0,0976502
6 0,0052 0,0363384
7 0,0058 0,0490236
8 0,0041 0,0130822
9 0,0039 0,0088538
10 0,0036 0,0025112
Tabla 37. Datos de la Biomasa para la Fermentación II
Síntesis de datos
Biomasa Sustrato
(g/L) (g/L)
1 0 1,05 4,647 8,1252676

2 300 1,5 2,661 5,9222712
3 450 2,15 0,540 0,148391
4 600 2,5 0,622 0,1314774
5 1560 3,6 5,002 0,0976502
6 1650 3,85 4,642 0,0363384
7 1770 4,05 3,433 0,0490236
8 1920 4,25 1,243 0,0130822
9 2040 5 0,395 0,0088538
10 3000 6,7 0,581 0,0025112
Tabla 38. Síntesis de datos para la Fermentación II
Conteo de Esporas
1 2 3
-6
10 IND 93 89
-7
10 23 15 34
Tabla 39. Conteo de esporas para la Fermentación II
86
IQ-2004-I-23
Tercera fermentación
Condiciones:

Oxigeno disuelto saturado 5,8092 ppm
Tabla 40. Condiciones para la Fermentación III
Biomasa
t OD
OD (ppm) pH Promedio
(min) (%)
(g/L)
0 72 4,182624 6,5 1,3
30 65,6 3,8108352 6,5
60 56,8 3,2996256 6,5
90 50,2 2,9162184 6,5
120 43,8 2,5444296 6,5
150 38,6 2,2423512 6,5
180 26,3 1,5278196 6,5
210 2 0,116184 6,5
240 1,2 0,0697104 6,5
270 1,5 0,087138 6,5
300 3 0,174276 6,5 2,6
330 2,3 0,1336116 6,5
360 2,2 0,1278024 6,5
390 2,2 0,1278024 6,5
420 2,6 0,1510392 6,5 3,05
450 3,3 0,1917036 6,5
480 2 0,116184 6,5
510 2,2 0,1278024 6,5 3,35
540 1,2 0,0697104 6,5
570 2 0,116184 6,5
600 1,8 0,1045656 6,5
630 2,3 0,1336116 6,5 4,05
1560 3,2 0,1858944 6,98 5,75
1590 4,4 0,2556048 7,01
1620 1,4 0,0813288 7,01
87
IQ-2004-I-23
Biomasa
t OD
(min) (%)
(g/L)
1650 1,8 0,1045656 7,01
1680 3,3 0,1917036 7,01 6
1710 4 0,232368 7,14
1740 5,1 0,2962692 7,14
1770 2 0,116184 7,14
1800 4,5 0,261414 7,14
1830 2,1 0,1219932 7,14 6,1
1860 1,2 0,0697104 7,14
1890 0,5 0,029046 7,14
1920 1,1 0,0639012 7,14
1950 0,4 0,0232368 7,14
1980 0,5 0,029046 7,14 6,5
3000 1,4 0,0813288 7,88 9
Tabla 41. .Datos de Oxígeno disuelto, pH y Biomasa para la Fermentación III
Datos de Biomasa

Muestra Ref. Tubo
1 0,9274 0,9286 0,0012 1,2

0,9074 0,9088 0,0014 1,4
2 0,9376 0,9403 0,0027 2,7
0,9454 0,9479 0,0025 2,5
3 0,9401 0,9432 0,0031 3,1
0,9399 0,9429 0,003 3
4 0,9468 0,9502 0,0034 3,4
0,947 0,9503 0,0033 3,3
5 0,9347 0,9389 0,0042 4,2
0,9076 0,9115 0,0039 3,9
6 0,9032 0,9091 0,0059 5,9
0,9057 0,9113 0,0056 5,6
7 0,8977 0,9038 0,0061 6,1
0,9266 0,9325 0,0059 5,9
8 0,9337 0,9399 0,0062 6,2
0,9351 0,9411 0,006 6
9 0,9103 0,9165 0,0062 6,2
0,9063 0,9131 0,0068 6,8
10 0,9311 0,9399 0,0088 8,8
0,9263 0,9355 0,0092 9,2
Tabla 42. Datos de la Biomasa para la Fermentación III
88
IQ-2004-I-23

1 0,3474 7,2711308
2 0,2684 5,6009128
3 0,1426 2,9412492
4 0,0554 1,0976668
5 0,0096 0,1293632
6 0,0074 0,0828508
7 0,0051 0,0342242
8 0,0036 0,0025112
9 0,0036 0,0025112
10 0,0035 0,000397
Tabla 43. Datos de la Biomasa para la Fermentación III
Síntesis de datos
Biomasa Sustrato
(g/L) (g/L)
1 0 1,3 4,182624 7,2711308

2 300 2,6 0,174276 5,6009128
3 420 3,05 0,1510392 2,9412492
4 510 3,35 0,1278024 1,0976668
5 630 4,05 0,1336116 0,1293632
6 1560 5,75 0,1858944 0,0828508
7 1680 6 0,1917036 0,0342242
8 1830 6,1 0,1219932 0,0025112
9 1980 6,5 0,029046 0,0025112
10 3000 9 0,0813288 0,000397
Tabla 44. Síntesis de datos para la Fermentación III
Conteo de Esporas
1 2 3
-6
10 20 32 0
-7
10 3 0 0
Tabla 45. Conteo de esporas para la Fermentación III
89
IQ-2004-I-23
Cuarta fermentación
Condiciones:
Flujo de Aire 2,5 vvm
Velocidad de agitación 300 rpm

Modo de alimentación 40 Ml/h
Tabla 46. Condiciones para la Fermentación IV
Biomasa
OD
t (min) OD (ppm) pH Promedio
(%)
(g/L)
0 78,3 4,5486036 6,5 1,4

30 77,1 4,4788932 6,5
60 73,3 4,2581436 6,5
90 66,6 3,8689272 6,5
120 44,1 2,5618572 6,5
150 21,9 1,2722148 6,5
180 4,4 0,2556048 6,5
210 7,2 0,4182624 6,5
240 10,5 0,609966 6,5
270 10,8 0,6273936 6,5
300 12,1 0,7029132 6,5 2,35
330 11,8 0,6854856 6,5
360 12,3 0,7145316 6,5
390 9,1 0,5286372 6,5 2,55
420 13,7 0,7958604 6,5
450 8,1 0,4705452 6,5
480 12,2 0,7087224 6,5 3,3
510 21,8 1,2664056 6,5
540 8,4 0,4879728 6,5
570 14,3 0,8307156 6,5 3,45
600 9,7 0,5634924 6,5
1470 13,4 0,7784328 6,6 4,75
1500 13,4 0,7784328 6,8
1530 7,1 0,4124532 6,7
1560 3,8 0,2207496 6,7
90
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Biomasa
OD
t (min) OD (ppm) pH Promedio
(%)
(g/L)
1590 1 0,058092 6,7

1620 0,6 0,0348552 6,7 5,2
1650 0,4 0,0232368 6,7
1680 0 0 6,71
1710 0,1 0,0058092 6,71
1740 0,4 0,0232368 6,71 5,7
1770 0,1 0,0058092 6,71
1800 0,1 0,0058092 6,79
1830 0 0 6,84
1860 0 0 6,89 6,55
1890 0 0 6,89
2880 1 0,058092 7,58
2910 0,7 0,0406644 7,59
3000 1 0,058092 7,6 10,5
Tabla 47. Datos de Oxígeno disuelto, pH y Biomasa para la Fermentación IV
Datos de Biomasa

Muestra Ref. Tubo
1 A1 0,9015 0,9028 0,0013 1,3

A23 0,9101 0,9116 0,0015 1,5
2 A11 0,8975 0,8999 0,0024 2,4
A15 0,904 0,9063 0,0023 2,3
3 A16 0,9307 0,9334 0,0027 2,7
A5 0,9023 0,9047 0,0024 2,4
4 A13 0,8996 0,9028 0,0032 3,2
A1 0,9021 0,9055 0,0034 3,4
5 A14 0,8968 0,9003 0,0035 3,5
A9 0,9055 0,9089 0,0034 3,4
6 A13 0,8992 0,9038 0,0046 4,6
A1 0,9018 0,9067 0,0049 4,9
7 A3 0,9261 0,9309 0,0048 4,8
A24 0,9069 0,9125 0,0056 5,6
8 A6 0,9038 0,9093 0,0055 5,5
A15 0,9037 0,9096 0,0059 5,9
91
IQ-2004-I-23
9 A6 0,9037 0,9106 0,0069 6,9

A24 0,9071 0,9133 0,0062 6,2
10 A15 0,9033 0,9139 0,0106 10,6
A17 0,9367 0,9471 0,0104 10,4
Tabla 48. Datos de la Biomasa para la Fermentación IV

1 0,3752 7,8588784
2 0,2625 5,476175
3 0,1379 2,8418818
4 0,0385 0,740367
5 0,007 0,074394
6 0,0059 0,0511378
7 0,0058 0,0490236
8 0,0039 0,0088538
9 0,0036 0,0025112
10 0,0036 0,0025112
Tabla 49. Datos de la Biomasa para la Fermentación VI
Síntesis de datos
Biomasa Sustrato
(g/L) (g/L)
1 0 1,4 4,5486036 7,8588784

2 300 2,35 0,7029132 5,476175
3 390 2,55 0,5286372 2,8418818
4 480 3,3 0,7087224 0,740367
5 570 3,45 0,8307156 0,074394
6 1470 4,75 0,7784328 0,0511378
7 1620 5,2 0,0348552 0,0490236
8 1740 5,7 0,0232368 0,0088538
9 1890 6,55 0 0,0025112
10 3000 10,5 0,058092 0,0025112
Tabla 50. Síntesis de datos para la Fermentación IV
Conteo de Esporas
92
IQ-2004-I-23
1 2 3
-6
10 20 24 IND
-7
10 6 17 0
Tabla 51. Conteo de esporas para la Fermentación IV
93
IQ-2004-I-23
Quinta fermentación
Condiciones:

Modo de alimentación Escalon ml/h
Tabla 52. Condiciones para la Fermentación V
Biomasa
t OD
(min) (%)
(g/L)
0 96,5 5,605878 6,51 1,15
30 92,3 5,3618916 6,5
60 88,3 5,1295236 6,5
90 84,9 4,9320108 6,5
120 76,9 4,4672748 6,5
150 72,3 4,2000516 6,5
180 61,7 3,5842764 6,5
210 40,9 2,3759628 6,5
240 19,2 1,1153664 6,5
270 15,9 0,9236628 6,5
300 13,8 0,8016696 6,5 1,85
330 14,9 0,8655708 6,5
360 21,3 1,2373596 6,5
390 33,2 1,9286544 6,5
420 42,1 2,4456732 6,59
450 46,9 2,7245148 6,7 2,65
480 55,8 3,2415336 6,82
510 61,2 3,5552304 6,91
540 67,7 3,9328284 7,1 3,1
570 54,6 3,1718232 7,22
600 58,6 3,4041912 7,35
630 63,9 3,7120788 7,39
660 74,1 4,3046172 7,49 3,35
1500 26,3 1,5278196 7,95 6
1530 2,3 0,1336116 7,51
1560 6,2 0,3601704 7,3
1590 16 0,929472 7,36
94
IQ-2004-I-23
Biomasa
t OD
(min) (%)
(g/L)
1620 0,2 0,0116184 7,35
1650 0,4 0,0232368 7,38 6,5
1680 0 0 7,42
1710 1,5 0,087138 7,46
1740 0 0 7,5
1770 0,1 0,0058092 7,54
1800 7,3 0,4240716 7,71 6,55
1830 15,2 0,8829984 7,8
1860 11,3 0,6564396 7,82
1890 16,9 0,9817548 7,85
1920 15,7 0,9120444 7,89
1950 12,3 0,7145316 7,9 7,05
2970 25,7 1,4929644 8,77
3000 20,3 1,1792676 8,74 14,45
Tabla 53. Datos de Oxígeno disuelto, pH y Biomasa para la Fermentación V
Datos de Biomasa

Muestra Ref. Tubo
1 A21 0,9415 0,9425 0,001 1

A14 0,8983 0,8996 0,0013 1,3
2 A21 0,9414 0,9433 0,0019 1,9
A7 0,9275 0,9293 0,0018 1,8
3 A13 0,9012 0,9039 0,0027 2,7
A16 0,9052 0,9078 0,0026 2,6
4 A16 0,9052 0,9082 0,003 3
A21 0,9419 0,9451 0,0032 3,2
5 A21 0,9466 0,9501 0,0035 3,5
A20 0,8981 0,9013 0,0032 3,2
6 A9 0,9061 0,9121 0,006 6
A7 0,9274 0,9331 0,0057 5,7
7 A16 0,9049 0,9113 0,0064 6,4
A7 0,9058 0,9124 0,0066 6,6
8 A14 0,897 0,9036 0,0066 6,6
A9 0,9078 0,9143 0,0065 6,5
9 A11 0,8978 0,9048 0,007 7
A1 0,9022 0,9093 0,0071 7,1
10 A20 0,906 0,9208 0,0148 14,8
A10 0,8984 0,9125 0,0141 14,1
Tabla 54. Datos de la Biomasa para la Fermentación V
95
IQ-2004-I-23

1 0,3487 7,2986154
2 0,1415 2,917993
3 0,0575 1,142065
4 0,025 0,45495
5 0,0247 0,4486074
6 0,0238 0,4295796
7 0,0196 0,3407832
8 0,0132 0,2054744
9 0,0113 0,1653046
10 0,0098 0,1335916
Tabla 55. Datos de la Biomasa para la Fermentación V
Síntesis de datos
Biomasa Sustrato
4uestra T (min) OD (ppm)
(g/L) (g/L)
1 0 1,15 5,605878 7,2986154

2 300 1,85 0,8016696 2,917993
3 450 2,65 2,7245148 1,142065
4 540 3,1 3,9328284 0,45495
5 660 3,35 4,3046172 0,4486074
6 1500 6 1,5278196 0,4295796
7 1650 6,5 0,0232368 0,3407832
8 1800 6,55 0,4240716 0,2054744
9 1950 7,05 0,7145316 0,1653046
10 3000 14,45 1,1792676 0,1335916
Tabla 56. Síntesis de datos para la Fermentación V
Conteo de Esporas
1 2 3
-6
10 70 IND IND
-7
10 21 44 IND
Tabla 57. Conteo de esporas para la Fermentación V
96
IQ-2004-I-23
Sexta fermentación
Condiciones:

Tabla 58. Condiciones para la Fermentación VI
Biomasa
t OD
(min) (%)
(g/L)
0 87,9 5,1062868 6,5 1,4
30 87,4 5,0772408 6,5
60 86,3 5,0133396 6,5
90 77,4 4,4963208 6,5
120 69,3 4,0257756 6,5
150 63,2 3,6714144 6,5
180 57,8 3,3577176 6,49
210 49,7 2,8871724 6,5
240 28,2 1,6381944 6,5
270 26,7 1,5510564 6,5
300 13,2 0,7668144 6,5 2,3
330 10,1 0,5867292 6,5
360 6,7 0,3892164 6,5
390 3,6 0,2091312 6,51
420 0,7 0,0406644 6,54
450 1 0,058092 6,63 3,6
1380 78,3 4,5486036 7,45 6,35
1410 78,3 4,5486036 7,5
1440 78,6 4,5660312 7,55
1470 78 4,531176 7,6 6,4
1500 72,6 4,2174792 7,61
97
IQ-2004-I-23
Biomasa
t OD
(min) (%)
(g/L)
1530 71,5 4,153578 7,62
1560 70 4,06644 7,63 7,45
2790 13,3 0,7726236 8,83 10,3
2820 12,2 0,7087224 8,82
2850 18,4 1,0688928 8,88
2880 18,7 1,0863204 8,81
2910 21,3 1,2373596 8,81 11,95
2940 21,6 1,2547872 8,81
2970 18,6 1,0805112 8,81
3000 20,3 1,1792676 8,81 14,8
Tabla 59. Datos de Oxígeno disuelto, pH y Biomasa para la Fermentación VI
Datos de Biomasa

Muestra Ref. Tubo
1 A6 0,9029 0,9041 0,0012 1,2

A19 0,8945 0,8961 0,0016 1,6
2 A20 0,9048 0,9075 0,0027 2,7
A11 0,8973 0,8992 0,0019 1,9
3 A4 0,9344 0,9379 0,0035 3,5
A23 0,9092 0,9129 0,0037 3,7
4 A6 0,9031 0,9093 0,0062 6,2
A21 0,9455 0,952 0,0065 6,5
5 A4 0,9342 0,9404 0,0062 6,2
A24 0,9065 0,9131 0,0066 6,6
6 A13 0,8991 0,9064 0,0073 7,3
A9 0,9052 0,9128 0,0076 7,6
7 A19 0,8938 0,9039 0,0101 10,1
A10 0,8973 0,9078 0,0105 10,5
8 A1 0,9018 0,9135 0,0117 11,7
A7 0,9263 0,9385 0,0122 12,2
9 A5 0,9021 0,9169 0,0148 14,8
A21 0,9462 0,961 0,0148 14,8
98
IQ-2004-I-23

1 0,4342 9,1062564
2 0,0506 0,9961852
3 0,0325 0,613515
4 0,0276 0,5099192
5 0,0269 0,4951198
6 0,015 0,24353
7 0,0137 0,2160454
8 0,0135 0,211817
9 0,0134 0,2097028
Síntesis de datos
Biomasa Sustrato
(g/L) (g/L)
1 0 1,4 5,1062868 9,1062564

2 300 2,3 0,7668144 0,9961852
3 450 3,6 0,058092 0,613515
4 1380 6,35 4,5486036 0,5099192
5 1470 6,4 4,531176 0,4951198
6 1560 7,45 4,06644 0,24353
7 2790 10,3 0,7726236 0,2160454
8 2910 11,95 1,2373596 0,211817
9 3000 14,8 1,1792676 0,2097028
Tabla 62. Síntesis de datos para la Fermentación VI
Conteo de Esporas
1 2 3
-6
10 IND IND 19
-7
10 0 4 2
Tabla 63. Conteo de esporas para la Fermentación VI
99
IQ-2004-I-23
Séptima fermentación
Condiciones:

Tabla 64. Condiciones para la Fermentación VII
Biomasa
t OD
(min) (%)
(g/L)
0 78,1 4,5369852 6,5 0,8

30 78,4 4,5544128 6,5
60 77,3 4,4905116 6,5
90 75,4 4,3801368 6,5
120 65,4 3,7992168 6,5
150 60,2 3,4971384 6,5
180 41,2 2,3933904 6,5
210 34,2 1,9867464 6,5
240 33,3 1,9344636 6,5
270 33,6 1,9518912 6,5
300 32,2 1,8705624 6,5 1,25
330 32 1,858944 6,5
360 31,2 1,8124704 6,5
390 33,6 1,9518912 6,5
420 36,2 2,1029304 6,5 1,65
450 42,6 2,4747192 6,5
480 39,5 2,294634 6,5
510 28,6 1,6614312 6,5
540 14,3 0,8307156 6,5 2,75
570 9,5 0,551874 6,5
600 8,8 0,5112096 6,5
630 4,1 0,2381772 6,5
660 2,7 0,1568484 6,5 3,35
1590 5,6 0,3253152 6,93 5,9
100
IQ-2004-I-23
Biomasa
t OD
(min) (%)
(g/L)
1620 13,3 0,7726236 6,98

1650 10 0,58092 6,99
1680 13,1 0,7610052 7,02
1710 13,5 0,784242 7,05 7,4
1740 19,3 1,1211756 7,08
1770 41,3 2,3991996 7,11
1800 46,8 2,7187056 7,14
1830 35,3 2,0506476 7,15 7,55
1860 24,2 1,4058264 7,16
1890 20,7 1,2025044 7,17
1920 20,3 1,1792676 7,17
1950 18 1,045656 7,18 9,15
3000 4,7 0,2730324 7,99 19
Tabla 65. Datos de Oxígeno disuelto, pH y Biomasa para la Fermentación VII
Datos de Biomasa

Muestra Ref. Tubo
1 A1 0,9023 0,903 0,0007 0,7

A9 0,9056 0,9065 0,0009 0,9
2 A9 0,906 0,907 0,001 1
A18 0,932 0,9335 0,0015 1,5
3 A2 0,9137 0,9153 0,0016 1,6
A13 0,8991 0,9008 0,0017 1,7
4 A23 0,9103 0,9133 0,003 3
A10 0,8981 0,9006 0,0025 2,5
5 A13 0,9005 0,9036 0,0031 3,1
A12 0,9023 0,9059 0,0036 3,6
6 A5 0,903 0,9091 0,0061 6,1
A15 0,9039 0,9096 0,0057 5,7
7 A6 0,9029 0,9104 0,0075 7,5
A22 0,9373 0,9446 0,0073 7,3
8 A24 0,9064 0,9138 0,0074 7,4
A9 0,9054 0,9131 0,0077 7,7
9 A17 0,94 0,9495 0,0095 9,5
101
IQ-2004-I-23
A7 0,9266 0,9354 0,0088 8,8

10 A7 0,9266 0,9448 0,0182 18,2
A2 0,9142 0,934 0,0198 19,8
Tabla 66. Datos de la Biomasa para la Fermentación VII

1 0,3672 7,6897424
2 0,1092 2,2351064
3 0,0841 1,7044422
4 0,0445 0,867219
5 0,0365 0,698083
6 0,0342 0,6494564
7 0,029 0,539518
8 0,029 0,539518
9 0,0239 0,4316938
Tabla 67. Datos de la Biomasa para la Fermentación VII
Síntesis de datos
Biomasa Sustrato
(g/L) (g/L)
1 0 0,8 4,5369852 7,6897424

2 300 1,25 1,8705624 2,2351064
3 420 1,65 2,1029304 1,7044422
4 540 2,75 0,8307156 0,867219
5 660 3,35 0,1568484 0,698083
6 1590 5,9 0,3253152 0,6494564
7 1710 7,4 0,784242 0,539518
8 1830 7,55 2,0506476 0,539518
9 1950 9,15 1,045656 0,4316938
10 3000 19 0,2730324 0
Tabla 68. Síntesis de datos para la Fermentación VII
Conteo de Esporas
1 2 3
-6
10 103 IND IND
-7
10 45 48 39
Tabla 69. Conteo de esporas para la Fermentación VII
102
IQ-2004-I-23
Octava fermentación
Condiciones:

Tabla 70. Condiciones para la Fermentación VIII
Biomasa
t OD
(min) (%)
(g/L)
0 83,4 4,8448728 6,5 0,8

30 80,2 4,6589784 6,5
60 74,8 4,3452816 6,5
90 73,6 4,2755712 6,5
120 72,2 4,1942424 6,5
150 70,8 4,1129136 6,5
180 68,4 3,9734928 6,5
210 65,1 3,7817892 6,5
240 64,9 3,7701708 6,5
270 63,6 3,6946512 6,5
300 62,2 3,6133224 6,5 1,1
330 58,4 3,3925728 6,5
360 56 3,253152 6,5
390 44,5 2,585094 6,5
420 41,4 2,4050088 6,5 0,95
450 38,8 2,2539696 6,5
480 7,2 0,4182624 6,5
510 8,7 0,5054004 6,5
1470 1,7 0,0987564 6,72 3
1500 1,7 0,0987564 6,72
1530 2 0,116184 6,71
1560 2,2 0,1278024 6,75
1590 1,5 0,087138 6,8 2,85
1620 1,5 0,087138 6,83
103
IQ-2004-I-23
Biomasa
t OD
(min) (%)
(g/L)
1650 2,4 0,1394208 6,86

1680 1,6 0,0929472 6,88
1710 2 0,116184 6,94 3,6
1740 1,9 0,1103748 6,97
1770 1,8 0,1045656 7,02
1800 1,8 0,1045656 7,07
1830 1,1 0,0639012 7,11 4,55
2670 20,2 1,1734584 7,85 5,05
3000 18,2 1,0572744 7,98 5,05
Tabla 71. Datos de Oxígeno disuelto, pH y Biomasa para la Fermentación VIII
Datos de Biomasa

Muestra Ref. Tubo
1 A8 0,9398 0,9404 0,0006 0,6

A23 0,9066 0,9076 0,001 1
2 A5 0,8966 0,8976 0,001 1
A1 0,8985 0,8997 0,0012 1,2
3 A5 0,8968 0,8977 0,0009 0,9
A9 0,9018 0,9028 0,001 1
4 A13 0,8953 0,8985 0,0032 3,2
A15 0,8916 0,8944 0,0028 2,8
5 A21 0,9382 0,941 0,0028 2,8
A14 0,8929 0,8958 0,0029 2,9
6 A8 0,9298 0,9339 0,0041 4,1
A7 0,9237 0,9268 0,0031 3,1
7 A5 0,897 0,901 0,004 4
A12 0,8983 0,9034 0,0051 5,1
8 A15 0,8918 0,8965 0,0047 4,7
A21 0,9384 0,9438 0,0054 5,4
9 A1 0,8985 0,9041 0,0056 5,6
A20 0,8947 0,8992 0,0045 4,5
Tabla 72. Datos de la Biomasa para la Fermentación VIII
104
IQ-2004-I-23

1 0,4122 8,6411324
2 0,155 3,20341
3 0,08 1,61776
4 0,0738 1,4866796
5 0,0494 0,9708148
6 0,0383 0,7361386
7 0,0272 0,5014624
8 0,017 0,285814
9 0,0156 0,2562152
Tabla 73. Datos de la Biomasa para la Fermentación VIII
Síntesis de datos
Biomasa Sustrato
(g/L) (g/L)
1 0 0,8 4,8448728 8,6411324

2,00 300 1,1 3,6133224 3,20341
3,00 420 0,95 2,4050088 1,61776
4,00 1470 3 0,0987564 1,4866796
5,00 1590 2,85 0,087138 0,9708148
6,00 1710 3,6 0,116184 0,7361386
7,00 1830 4,55 0,0639012 0,5014624
8,00 2670 5,05 1,1734584 0,285814
9,00 3000 5,05 1,0572744 0,2562152
Tabla 74. Síntesis de datos para la Fermentación VIII
Conteo de Esporas
1 2 3
-6
10 22 11 0
-7
10 25 15 9
Tabla 75. Conteo de esporas para la Fermentación VIII
105
IQ-2004-I-23
Anexo F
TABLA DE DATOS DE LA SIMULACION
Datos para una fermentación Fed-Batch Escalonada (Fermentación (VII)
Tiempo S dS/dt X dX/dt Tiempo S dS/dt X dX/dt

0 7.62 0.8 1560 0.18 -0.01 11.14 0.33
60 6.27 -1.35 1.4 0.6 1620 0.17 -0.01 11.47 0.33
120 4.94 -1.33 1.98 0.59 1680 0.16 -0.01 11.81 0.33
180 3.65 -1.3 2.56 0.57 1740 0.16 -0.01 12.14 0.33
240 2.42 -1.23 3.1 0.54 1800 0.15 -0.01 12.47 0.33
300 1.33 -1.09 3.58 0.48 1860 0.15 0 12.81 0.33
360 0.76 -0.57 3.96 0.38 1920 0.14 0 13.14 0.33
420 0.63 -0.14 4.31 0.35 1980 0.14 0 13.47 0.33
480 0.52 -0.11 4.64 0.33 2040 0.14 0 13.8 0.33
540 0.44 -0.08 4.95 0.31 2100 0.13 0 14.14 0.33
600 0.38 -0.06 5.25 0.3 2160 0.13 0 14.47 0.33
660 0.34 -0.04 5.54 0.29 2220 0.13 0 14.8 0.33
720 0.46 0.11 5.86 0.32 2280 0.12 0 15.14 0.33
780 0.55 0.09 6.27 0.42 2340 0.12 0 15.47 0.33
840 0.52 -0.02 6.73 0.46 2400 0.12 0 15.8 0.33
900 0.47 -0.06 7.2 0.46 2460 0.11 0 16.13 0.33
960 0.41 -0.05 7.65 0.46 2520 0.11 0 16.47 0.33
1020 0.33 -0.08 8.09 0.44 2580 0.11 0 16.8 0.33
1080 0.26 -0.07 8.45 0.36 2640 0.11 0 17.13 0.33
1140 0.24 -0.02 8.79 0.34 2700 0.1 0 17.46 0.33
1200 0.23 -0.01 9.13 0.34 2760 0.1 0 17.79 0.33
1260 0.22 -0.01 9.46 0.34 2820 0.1 0 18.13 0.33
1320 0.21 -0.01 9.8 0.34 2880 0.1 0 18.46 0.33
1380 0.2 -0.01 10.13 0.33 2940 0.1 0 18.79 0.33
1440 0.19 -0.01 10.47 0.33 3000 0.09 0 19.12 0.33
1500 0.18 -0.01 10.8 0.33
Tabla 76. Datos para una fermentación Fed-Batch Escalonada (Fermentación (VII)
106
IQ-2004-I-23
Datos para una fermentación Fed-Batch Constante (Fermentación III)
Tiempo S dS/dt X dX/dt Tiempo S dS/dt X dX/dt

0 7.27 0.8 1560 0.09 0 6.81 0.11
60 5.97 -1.3 1.37 0.57 1620 0.09 0 6.92 0.11
120 4.7 -1.28 1.94 0.56 1680 0.08 0 7.03 0.11
180 3.46 -1.24 2.48 0.55 1740 0.08 0 7.14 0.11
240 2.29 -1.17 3 0.52 1800 0.08 0 7.26 0.11
300 1.26 -1.03 3.45 0.46 1860 0.08 0 7.37 0.11
360 0.64 -0.62 3.81 0.35 1920 0.08 0 7.48 0.11
420 0.41 -0.23 4.08 0.27 1980 0.08 0 7.59 0.11
480 0.3 -0.11 4.3 0.22 2040 0.08 0 7.7 0.11
540 0.25 -0.05 4.49 0.19 2100 0.08 0 7.81 0.11
600 0.22 -0.02 4.66 0.18 2160 0.07 0 7.92 0.11
660 0.21 -0.02 4.83 0.17 2220 0.07 0 8.03 0.11
720 0.19 -0.01 5 0.17 2280 0.07 0 8.14 0.11
780 0.18 -0.01 5.17 0.16 2340 0.07 0 8.25 0.11
840 0.17 -0.01 5.33 0.16 2400 0.07 0 8.36 0.11
900 0.17 -0.01 5.49 0.16 2460 0.07 0 8.48 0.11
960 0.16 -0.01 5.64 0.16 2520 0.07 0 8.59 0.11
1020 0.13 -0.02 5.8 0.15 2580 0.07 0 8.7 0.11
1080 0.11 -0.03 5.92 0.12 2640 0.07 0 8.81 0.11
1140 0.1 -0.01 6.03 0.11 2700 0.07 0 8.92 0.11
1200 0.1 0 6.14 0.11 2760 0.06 0 9.03 0.11
1260 0.1 0 6.26 0.11 2820 0.06 0 9.14 0.11
1320 0.09 0 6.37 0.11 2880 0.06 0 9.25 0.11
1380 0.09 0 6.48 0.11 2940 0.06 0 9.36 0.11
1440 0.09 0 6.59 0.11 3000 0.06 0 9.47 0.11
1500 0.09 0 6.7 0.11
Tabla 77. Datos para una fermentación Fed-Batch Constante (Fermentación III)
107
IQ-2004-I-23
Datos del Oxígeno Disuelto
OD SIMULADO OD SIMULADO OD SIMULADO

TIEMPO (min) TIEMPO (min) TIEMPO (min)
(ppm) (ppm) (ppm)
0 4.53 1080 0.58 2160 0.73

60 2.86 1140 0.7 2220 0.73
120 1.65 1200 0.71 2280 0.73
180 0.6 1260 0.72 2340 0.73
240 0 1320 0.72 2400 0.73
300 0.06 1380 0.72 2460 0.73
360 0.86 1440 0.72 2520 0.73
420 0.99 1500 0.72 2580 0.73
480 1.17 1560 0.72 2640 0.73
540 1.34 1620 0.72 2700 0.73
600 1.48 1680 0.72 2760 0.73
660 1.58 1740 0.72 2820 0.73
720 0.54 1800 0.73 2880 0.73
780 0 1860 0.73 2940 0.73
840 0 1920 0.73 3000 0.73
900 0 1980 0.73
960 0 2040 0.73
1020 0 2100 0.73
Tabla 78. Datos del Oxígeno Disuelto
108
IQ-2004-I-23
Anexo G
LENGUAJE DEL PROGRAMA
Programa
OD(t) = OD(t - dt) + (dOD__dt) * dt

INIT OD = 4.53
INFLOWS:
dOD__dt = Kla*(OD_Ref-OD)-(Y_o__s*CONVERTIDOR/Y_x_s)*X*Miu
S(t) = S(t - dt) + (dS_dt) * dt
INIT S = 7.62
INFLOWS:
dS_dt = if (time<5.25) or (time>16.75) then ((-1/Y_x_s)*dX__dt+Mantenimiento_de_glucosa) else ((-
1/Y_x_s)*(dX__dt)+(F/V)*(Si-S)+Mantenimiento_de_glucosa)
X(t) = X(t - dt) + (dX__dt) * dt
INIT X = 0.8
INFLOWS:
dX__dt = if (time<5.25) or (time>16.75)then (Miu*(X+(Y_x_s)*(S))) else (Miu*(X+(Y_x_s)*(S)+ ((F/V)*X)))
CONVERTIDOR = 1000
Kla = 13.75
Ks = 0.83
Ksi = 100
Mantenimiento_de_glucosa = if (time >16.75) then (0.75) else (0)
Miu = Miu_max*(1/(1+(Ks/Saux)+(Saux/Ksi)))
Miu_max = 0.17
OD_Ref = 5.82
Saux = S
Si = 50
Y_o__s = 0.095
Y_x_s = 0.4416
F = GRAPH(time)
(0.00, 0.00), (1.00, 0.00), (2.00, 0.00), (3.00, 0.00), (4.00, 0.00), (5.00, 0.00), (6.00, 0.04), (7.00, 0.04), (8.00, 0.04), (9.00,
0.04), (10.0, 0.04), (11.0, 0.04), (12.0, 0.07), (13.0, 0.07), (14.0, 0.07), (15.0, 0.07), (16.0, 0.07), (17.0, 0.07), (18.0, 0.00),
(19.0, 0.00), (20.0, 0.00), (21.0, 0.00), (22.0, 0.00), (23.0, 0.00), (24.0, 0.00), (25.0, 0.00), (26.0, 0.00), (27.0, 0.00), (28.0,
0.00), (29.0, 0.00), (30.0, 0.00), (31.0, 0.00), (32.0, 0.00), (33.0, 0.00), (34.0, 0.00), (35.0, 0.00), (36.0, 0.00), (37.0, 0.00),
(38.0, 0.00), (39.0, 0.00), (40.0, 0.00), (41.0, 0.00), (42.0, 0.00), (43.0, 0.00), (44.0, 0.00), (45.0, 0.00), (46.0, 0.00), (47.0,
0.00), (48.0, 0.00), (49.0, 0.00), (50.0, 0.00)
V = GRAPH(time)
(0.00, 3.00), (1.00, 3.00), (2.00, 3.00), (3.00, 3.00), (4.00, 3.00), (5.00, 3.00), (6.00, 3.04), (7.00, 3.08), (8.00, 3.12), (9.00,
3.16), (10.0, 3.20), (11.0, 3.24), (12.0, 3.31), (13.0, 3.38), (14.0, 3.45), (15.0, 3.52), (16.0, 3.59), (17.0, 3.66), (18.0, 3.66),
(19.0, 3.66), (20.0, 3.66), (21.0, 3.66), (22.0, 3.66), (23.0, 3.66), (24.0, 3.66), (25.0, 3.66), (26.0, 3.66), (27.0, 3.66), (28.0,
3.66), (29.0, 3.66), (30.0, 3.66), (31.0, 3.66), (32.0, 3.66), (33.0, 3.66), (34.0, 3.66), (35.0, 3.66), (36.0, 3.66), (37.0, 3.66),
(38.0, 3.66), (39.0, 3.66), (40.0, 3.66), (41.0, 3.66), (42.0, 3.66), (43.0, 3.66), (44.0, 3.66), (45.0, 3.66), (46.0, 3.66), (47.0,
3.66), (48.0, 3.66), (49.0, 3.66), (50.0, 3.66)
109
IQ-2004-I-23
Interaccion De Los Diferentes Elementos Del Modelo
Ilustración 40. Interacción de los diferentes dlementos del modelo
Definición del modelo
SECTOR X
Miu
Miu max
X
Ks
dX
dt
Ksi
Saux
S
Yxs
~ ~
V F
SECTOR S
dS
dt
Si
Mantenimiento de glucosa
CANTIDAD MANTENIDA
SECTOR OD
OD Ref
Yo Yxs
s OD
Miu
X
dOD
dt
Kla
CONVERTIDOR
Ilustración 41. Definición del Modelo
110

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IQ-2004-I-23

ANÁLISIS Y VALIDACIÓN DE UN MODELO MATEMÁTICO PARA EL

CAROLINA ANDREA ZERDA MÉNDEZ

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA

ANÁLISIS Y VALIDACIÓN DE UN MODELO MATEMÁTICO PARA EL

CAROLINA ANDREA ZERDA MÉNDEZ

Propuesta de Proyecto de Grado para optar el título en Ingeniero Químico

CARLOS ANDRÉS GARNICA VALENZUELA

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA

Bogotá, 23 de julio de 2004

A mis Padres y Hermanos,

Gracias por haberme brindado esta

Gracias por su apoyo y confianza en este largo

Carolina A. Zerda Méndez.

Y Carlos Garnica, Ingeniero Químico, gracias por su colaboración.

1. BACILLUS THURINGIENSIS: INSECTICIDA MICROBIAL 4

2. CRECIMIENTO DE BIOMASA DEL CULTIVO 10

5.2. EFECTOS DEL METABOLISMO ENDÓGENO 28

Ilustración 1. Ciclo de vida del BT 6

Ilustración 27. Comportamiento del coeficiente volumétrico de transferencia de masa KLa

Tabla 1. Aplicaciones de Bacillus thuringiensis (BT). 4

Tabla 39. Conteo de esporas para la Fermentación II 86

Anexo A. MEDIO DE CULTIVO 70

Tradicionalmente, el empleo de plaguicidas químicos ha solucionado estos problemas de

Los bioplaguicidas se producen y emplean con eficacia a partir de diferentes especies de

Buscar alternativas diferentes a la tradicional, tales como la operación con flujo de

En el futuro la industrialización del pesticida y el desarrollo de un producto basado en los

predecir el comportamiento de las variables que participan en el proceso de fabricación y

El presente documento tiene como objetivo sintetizar la investigación realizada para

Desarrollar y validar un modelo matemático que describa el comportamiento de un

• Estudiar que implicaciones tienen en el proceso de fermentación -

• Elaborar un adecuado diseño de experimentos que permita validar de manera

• Plantear un modelo matemático donde se incluyan variables del sistema

1. BACILLUS THURINGIENSIS: INSECTICIDA MICROBIAL

1.1. MARCO HISTÓRICO

A partir de este descubrimiento, se han realizado numerosos estudios acerca de la influencia

Insectos Cosechas y productos

Tabla 1. Aplicaciones de Bacillus thuringiensis (BT). 2

Las bacterias de la familia Bacillaceae se caracterizan porque todas forman esporas en su

1.3. CICLO DE VIDA

Los diversos componentes de la célula Bt y su ciclo de vida se esquematizan en la Figura 1.

Ilustración 1. Ciclo de vida del BT3

1.3.1. FISIOLOGÍA DE LA FERMENTACIÓN

Las investigaciones de la optimización-fermentación, envuelven tanto los nutrientes

1.3.1.1.Metabolismo del carbón

varios aminoácidos, ya que estos juegan un papel determinante en la producción de BT y de

1.3.2. ESPORULACIÓN Y FORMACIÓN DE PROTEÍNA TÓXICA

1.3.2.1.Toxinas Producidas por el BT y su modo de acción.

BT α - exotoxina: conocida como lecitinasa C, fosfolipasa C.

A continuación se discutirá separadamente los aspectos más importantes de cada una de

No se ha determinado con precisión la naturaleza de esta exotoxina. Se ha observado

Las larvas susceptibles tienen en su intestino la combinación necesaria de pH, sales y

presentes. La δ - endotoxina es insoluble en agua o solventes orgánicos y pierde su

1.4. PRODUCCIÓN COMERCIAL

La fermentación sumergida, es la más usada y consiste en permitir un crecimiento bacterial

Ilustración 2. Producción del Bacillus thruringiensis mediante el proceso de fermentación6.

2. CRECIMIENTO DE BIOMASA DEL CULTIVO

2.1. ETAPAS DEL CRECIMIENTO MICROBIAL

En el cultivo, después de proveer las sustancias nutritivas al fermentador, suministrar los

El desarrollo del cultivo, bajo condiciones fisicoquímicas adecuadas en un sustrato simple y

Ilustración 3. Etapas del crecimiento Microbial