Novoa Garcia, Heli Alonso

Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
Efecto de las concentraciones del extracto acuoso de
RM
harina de Glycine max “soya” sobre la producción de

FO
IN
biomasa de Bacillus thuringiensis var. israelensis.

DE
AS
EM
TESIS
ST
PARA OPTAR EL TÍTULO DE

SI
DE
BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO
N
IO
AUTOR: Br. HELÍ ALONSO NOVOA GARCÍA

CC
ASESOR: Dr. HEBER MAX ROBLES CASTILLO

RE
DI
TRUJILLO-PERÚ
2016
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE

TRUJILLO
N
IÓ
AC
IC
UN
Dr. ORLANDO GONZÁLES NIEVES
M
CO
RECTOR
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
Dr. RUBÉN VERA VÉLIZ

AS
VICE-RECTOR ACADÉMICO
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
Dr. STEBAN ALEJANDRO ILICH ZERPA

DI
PROFESOR SECRETARIO GENERAL
i
AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS
N
IÓ
AC
IC
UN
Dr. MARCO LEONCIO SALAZAR CASTILLO
M
DECANO (e)
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
Dr. ENRIQUE PADILLA SAGÁSTEGUI

AS
PROFESOR SECRETARIO
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
Dra. EVA VILLANUEVA TARAZONA

DI
DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO

PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
ii
DEL ASESOR
El que suscribe, Asesor de la presente Tesis titulada:
Efecto de las concentraciones del extracto acuoso de harina de Glycine max “soya” sobre
N
IÓ
la producción de biomasa de Bacillus thuringiensis var. israelensis.
AC
IC
UN
M
CERTIFICA
CO
Y
Que ésta Tesis ha sido ejecutada de conformidad con su correspondiente proyecto
A
y con las debidas orientaciones brindadas al tesista.
IC
ÁT
RM
Respecto al informe, éste ha sido revisado y acoge las observaciones y

FO
sugerencias pertinentes, por lo que autorizo al Br. Helí Alonso Novoa García
IN
continuar con los trámites correspondientes.

DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
____________________________________
RE
Dr. Heber Max Robles Castillo

DI
ASESOR
iii
PRESENTACIÓN
N
SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:
IÓ
AC
En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de
IC
UN
Grados y Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, ponemos a vuestra
M
consideración y criterio el trabajo de investigación titulado: “Efecto de las
CO
concentraciones del extracto acuoso de harina de Glycine max “soya” sobre la
Y
A
producción de biomasa de Bacillus thuringiensis var. israelensis”, con el propósito de
IC
ÁT
obtener el Título Profesional de Biólogo – Microbiólogo.
RM
Esperando que vuestro criterio sea de comprensión por errores u omisiones

FO
cometidos en la elaboración del presente trabajo, me someto a vuestro dictamen.

IN
DE
AS
EM
ST
Trujillo, Mayo 2016

SI
DE
N
IO
CC
____________________________________
RE
DI
Helí Alonso Novoa García

BACHILLER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
iv
MIEMBROS DEL JURADO
N
IÓ
AC
IC
________________________________________
UN
M
Ms.C. JULIO CÉSAR ARELLANO BARRAGÁN
CO
PRESIDENTE
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
_______________________________________
IN
DE
Dr. HEBER MAX ROBLES CASTILLO

AS
SECRETARIO
EM
ST
SI
DE
N
IO
____________________________________
CC
RE
Ms.C. ANIBAL QUINTANA DÍAZ

DI
VOCAL
v
APROBACIÓN
Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran
que la presente tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales,
N
IÓ
siendo aprobada por UNANIMIDAD.
AC
IC
UN
M
CO
Y
________________________________________
A
IC
Ms.C. JULIO CÉSAR ARELLANO BARRAGÁN ÁT
PRESIDENTE
RM
FO
IN
DE
AS
EM
_______________________________________
ST
Dr. HEBER MAX ROBLES CASTILLO

SI
DE
SECRETARIO
N
IO
CC
RE
DI
____________________________________
Ms.C. ANIBAL QUINTANA DÍAZ
VOCAL
vi
DEDICATORIA
N
IÓ
AC
A Dios. Por haberme permitido llegar hasta este punto y haberme dado
IC
UN
salud para lograr mis objetivos, además de su infinita bondad y amor.
M
CO
Y
A mis padres Jorge Alberto Novoa Abanto y María Rosa García
A
IC
ÁT
Torres. Por ser el pilar fundamental en todo lo que soy, en toda mi
RM
educación, tanto académica, como de la vida, por su incondicional

FO
IN
apoyo perfectamente mantenido a través del tiempo. Todo este trabajo

DE
ha sido posible gracias a ellos.

AS
EM
ST
A mis hermanos Jorge Alberto Novoa García, Mónica Novoa García y

SI
DE
Marco Antonio Novoa García. Por haberme apoyado en todo

N
IO
momento, por sus consejos, por la motivación constante que me ha

CC
RE
permitido ser una persona de bien, pero más que nada, por su amor.
DI
vii
AGRADECIMIENTOS
A mi asesor, el Dr. Heber Max Robles Castillo, mi más amplio
agradecimiento, por su paciencia ante mi inconsistencia, por su valiosa
N
IÓ
AC
dirección y por su gran apoyo en la elaboración de esta Tesis y llegar a
IC
la culminación de la misma.
UN
M
CO
A mis profesores y amigos Jaime Enrique Agreda Gaitán y Miguel
Y
Ángel Muños Ríos que me ayudaron en asesorías y dudas presentadas
A
IC
ÁT
en la elaboración de la tesis, que sin su ayuda desinteresada no hubiera
RM
culminado esta Tesis en el tiempo previsto.

FO
IN
Al personal responsable del Departamento técnico de la E.A.P de

DE
AS
Microbiología y Parasitología, Carlos Alberto Guzmán Delgado, Ana

EM
Rocío Zevallos Gonzales y Víctor Manuel Acosta Cadenillas. Por

ST
SI
acogerme en su ambiente de trabajo y facilitarme material y equipos

DE
necesarios para la realización de esta tesis.

N
IO
CC
A todos mis amigos y personas especiales que estuvieron conmigo día a

RE
DI
día dándome fuerza y motivación para alcanzar las metas trazadas.
Ustedes también forman parte importante en la realización de esta
Tesis.
viii
RESUMEN
La investigación tuvo como objetivo evaluar el efecto del extracto acuoso de
Glycine max “soya” sobre la producción de biomasa de Bacillus thuringiensis var.
N
IÓ
israelensis. Se desarrolló un modelo experimental basado en 3 concentraciones
AC
distintas de extracto acuoso de harina de Glycine max “soya” al 10, 30 y 50% y un
IC
grupo control (Luria Bertani). Se realizó un pre-tratamiento de la harina de soya
UN
M
sometiéndola a ebullición por unos minutos, seguido por un proceso de
CO
decantación y finalmente una filtración al vacío del sobrenadante de la muestra,
Y
obteniendo el medio de cultivo experimental. Tanto los cultivos experimentales
A
IC
como el grupo control fueron ajustados a pH 7 y suplementados con K2HPO4 (0.5
ÁT
RM
g/L), MgSO4 (0.3 g/L), MnSO4 (0.01 g/L), FeSO4 (0.01 g/L), ZnSO4 (0.005 g/L) y
FO
CaCO3 (1 g/L), este último se utilizó como estabilizador de pH. Cada sistema de
IN
fermentación contó con aireación constante y se mantuvo a temperatura ambiente

DE
(25 ± 3°C) durante las 72 horas que duró el ensayo. Cada 12 horas se realizaron
AS
tomas de muestra (5-10 ml) para monitorear el pH, recuento de células.

EM
Terminado el tiempo de incubación se extrajeron 100 ml de cada biorreactor y se

ST
SI
centrifugó a 2000 RPM/min, luego se desechó el sobrenadante. El sedimento se

DE
llevó a deshidratación en horno a 60 °C por 8 horas, obteniéndose biomasa seca

N
de Bacillus thuringiensis var. israelensis expresada en gramos por litro (g/L).

IO
CC
El peso seco de la biomasa celular (0.8020 g/L) del medio experimental al 50% de
RE
concentración a las 72 horas de incubación, fue significativamente mayor al

DI
medio referencial. Por lo tanto, la harina de soya es un sustrato adecuado y una
buena alternativa para la producción de Bacillus thuringiensis var. israelensis.
ix
INDICE
Pág.
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO………i
N
IÓ
AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS………...ii
AC
IC
DEL ASESOR……………………………………………………………………iii
UN
M
PRESENTACION………………………………………………………………...iv
CO
MIEMBROS DEL JURADO……………………………………………………...v
Y
A
IC
APROBACIÓN…………………………………………………………………...vi ÁT
RM
DEDICATORIA…………………………………………………………………vii
FO
AGRADECIMIENTO…………………………………………………………..viii
IN
DE
RESUMEN……………………………………………………………………….ix
AS
EM
INDICE……………………………………………………………………..…......x
ST
INTRODUCCIÓN……………………………………………………………….. 1
SI
DE
MATERIAL Y MÉTODO………………………………………...……………....5
N
IO
1. MATERIAL DE ESTUDIO…………………………………………….....5
CC
1.1.Material de estudio……………………...…………………………......5
RE
1.2. Material biológico.……………………………………………………5

DI
2. MÉTODOS.……………………………………………………………….5
2.1. Reactivación del cultivo de B. thuringiensis var. israelensis…...…….5
2.2. Diseño de biorreactores ……....……………………………….……..5
x
2.3. Acondicionamiento y esterilización de biorreactores ……………......6
2.4. Preparación de los medios de cultivo ………………………………...6
2.5. Estandarización del inóculo………………………………………......7
2.6. Inoculación de los biorreactores………………………………………7
N
IÓ
2.7. Monitoreo y control……....………………………………………..….7
AC
IC
2.8. Obtención de biomasa………………………………………………..8
UN
2.9. Evaluación estadística de resultados………………………………….8
M
CO
RESULTADOS……………………………………………………………………9
DISCUSIÓN……………………………………………………………………..13
Y
A
IC
CONCLUSIÓN…………………………………………………………………. 16 ÁT
RECOMENDACIONES…………………………………………………………17
RM
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS…………………………………………...18
FO
ANEXOS………………………………………………………………………....23
IN
DE
AS
ANEXO 1. Diseño de biorreactor tipo aireado de 2 litros de capacidad.

EM
ANEXO 2. Esterilización de los biorreactores empleando radiación UV.

ST
SI
ANEXO 3. Sistema de esterilización del aire empleando bombas de pecera y

DE
botellas de vidrio que contenían una solución saturada de NaCl al 23%.

N
IO
ANEXO 4. Extracto acuoso de harina de Glycine max “soya” al 10%, 30% y 50%
CC
después del decantado.

RE
ANEXO 5. Filtración al vacío del extracto acuoso de harina de Glycine max

DI
“soya” para su posterior uso como medio de cultivo de Bacillus thuringiensis var.
israelensis.
xi
ANEXO 6. Incubación de los medios de cultivo en los biorreactores durante 72
horas a temperatura ambiente y aireación constante.
ANEXO 7. Obtención de Biomasa de Bacillus thuringiensis var. israelensis
terminadas las 72 horas de incubación y posterior centrifugación a 2000 rpm por
N
IÓ
10 minutos.
AC
IC
ANEXO 8. Datos de biomasa seca de Bacillus thuringiensis var. Israelensis
UN
procesados mediante un Análisis de Varianza Unidireccional (ANOVA) y post
M
CO
ANOVA Tukey B.
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
xii
INTRODUCCIÓN
El uso a nivel mundial de insecticidas químicos para el control de plagas de
insectos y vectores de enfermedades ha causado contaminación medioambiental.
N
El uso de productos químicos es eficaz para controlar las plagas de insectos y
IÓ
AC
vectores, sin embargo, presentan algunas desventajas como por ejemplo matar a
IC
los organismos no objetivos y causar intoxicación humana. La creciente
UN
conciencia hacia los problemas ambientales causados por el uso de insecticidas
M
CO
químicos se ha traducido en una necesidad urgente de desarrollar nuevos
Y
productos ambientalmente aceptables1. Esto ha generado un gran interés en el uso
A
IC
de alternativas naturales para el control urbano, forestal y la agricultura. Varios
ÁT
RM
bioinsecticidas se han estudiado y aplicado comercialmente para el control de

FO
plagas y vectores2.
IN
Durante las últimas décadas, el uso de bioinsecticidas empleando Bacillus

DE
thuringiensis se hizo más preferible para gestiones de plagas que los químicos
AS
convencionales, debido a su menor contaminación. La formación de la espora de

EM
dicha bacteria produce inclusiones cristalinas que son muy eficaces y específicos
ST
para larvas de lepidópteros, coleópteros y dípteros3. Curiosamente, el uso de

SI
DE
esporas de B. thuringiensis, que es más ecológico, es una alternativa atractiva en

N
el manejo de plagas4.
IO
CC
Bacillus thuringiensis está estrechamente relacionada con otros dos bacilos,

RE
Bacillus cereus y Bacillus anthracis, formadoras de esporas importantes, y se

DI
diferencia en gran medida ya que contiene varios genes de protoxina codificadas
por plásmidos. Hay cientos de subespecies de Bacillus thuringiensis y la mayoría
producen, principalmente durante la esporulación, una o más inclusiones
1
paraesporales, cada una compuesto por una o varias protoxinas insecticidas
relacionados, los llamados δ -endotoxinas. Cada una de estas toxinas es activa en
un subconjunto de larvas de al menos tres órdenes de insectos5.
N
Cuando las larvas de los insectos ingieren las inclusiones (y las esporas, que
IÓ
AC
pueden ser sinérgico), las protoxinas se solubilizan y se procesan a las toxinas por
IC
las proteasas alcalinas del intestino medio. Sobre la base de estudios in vitro, lo
UN
más probable es que la toxina se una a los receptores en las células que recubren
M
CO
el intestino medio de las larvas, se inserte en la membrana celular y forme canales
Y
iónicos resultando en la pérdida del potencial de transmembrana que conduce a
A
IC
una lisis celular osmótica y muerte eventual del insecto6.
ÁT
RM
Aunque la estructura de las toxinas de Bacillus thuringiensis, sus mecanismos de

FO
acción, la biología molecular y la genética de la biosíntesis está bien

IN
documentada, hay relativamente pocos informes de la literatura acerca de su

DE
fermentación y la producción industrial. La importancia de los componentes del

AS
EM
medio y otras variables requeridas durante el proceso de fermentación es bien

ST
conocida7.
SI
El costo de producción de Bacillus thuringiensis depende de muchos factores; sin

DE
embargo, el costo de materia prima es uno de los criterios más importantes, que
N
IO
pueden comprender > 70% del coste de producción total8. Por lo tanto, la
CC
RE
selección de medio de crecimiento o materia prima es crítico para la producción

DI
comercial de estos bioplaguicidas. Con el fin de fomentar la producción comercial
de los bioplaguicidas, la utilización de la materia prima menos costosa es
aconsejable9. Diferentes materias primas (subproductos industriales y agrícolas)
2
se han probado con éxito usándolos como medio de cultivo alternativo para la
producción de Bacillus sphaericus y Bacillus thuringiensis 10,11.
Obeta y Okafor formularon cinco medios de cultivo (usando las semillas de
N
legumbres, de sangre seca de vaca y sales minerales) y evaluaron la producción
IÓ
AC
de las toxinas insecticidas de Bacillus thuringiensis que eran eficaces contra
IC
mosquitos de Aedes, Anopheles y Culex. Del mismo modo, otros medios que
UN
contienen harina de pescado, soja y licor de maíz de maceración para la
M
CO
producción de B. sphaericus y B. thuringiensis también han sido reportados12, 13,14.
Y
A
El medio de cultivo empleado para la fermentación de Bacillus thuringiensis debe
IC
ÁT
contener: Una fuente de carbono que suministra la energía para los procesos
RM
anabólicos15, una fuente de nitrógeno de origen inorgánico y otra de origen

FO
orgánico para el crecimiento y la esporulación de la bacteria y para la síntesis de

IN
las endotoxinas16.
DE
AS
Una alternativa a los medios de cultivo tradicionales ya estandarizados (puros y

EM
químicamente definidos) son los sustratos orgánicos, mayormente subproductos

ST
de otras industrias y en cuya composición se encuentran fuentes de C, N, P,

SI
microelementos y oligoelementos17.
DE
N
La harina de soya se considera un producto de alta calidad debido a su alta

IO
CC
digestibilidad, alto contenido energético, y consistencia. Es una fuente altamente

RE
concentrada de proteína con un excelente perfil de aminoácidos18.

DI
La proteína de soya es excepcional con respecto a otras de origen vegetal porque
su calidad es igual o equivalente a la de origen animal19. La cantidad de proteína
3
en la soja, de 38-44%, es mayor que el contenido de proteínas de otras legumbres,
20-30%, y mucho mayor que la de los cereales, 8-15%20.
Debido a la importancia de Bacillus thuringiensis var. israelensis en la producción
N
de bioinsecticida y a su elevado costo de producción se ha creído conveniente
IÓ
AC
desarrollar una nueva estrategia que permita incrementar la producción de la
IC
biomasa y esporulación de Bacillus thuringiensis var. israelensis en un medio
UN
fermentativo empleando materia prima de bajo costo y rico en nutrientes como la
M
CO
harina de soya, es por eso que el presente trabajo tuvo como objetivo general:
Y
A
- Determinar el efecto de las concentraciones del extracto acuoso de harina
IC
ÁT
de Glycine max “soya” sobre la producción de biomasa de Bacillus
RM
thuringiensis var. israelensis.

FO
IN
Los objetivos específicos fueron:

DE
- Obtener el extracto acuoso de harina de Glycine max “soya”

AS
- Determinar la curva de crecimiento de Bacillus thuringiensis var.

EM
ST
israelensis a las 72 horas de incubación en concentraciones de 10, 30 y

SI
50% de extracto de harina de Glycine max “soya”, así como también del
DE
medio de referencia Luria Bertani.

N
IO
- Cuantificar la biomasa producida por Bacillus thuringiensis var.

CC
israelensis a las 72 horas de incubación en concentraciones de 10, 30 y

RE
50% de extracto de harina de Glycine max “soya”, así como también del
DI
medio de referencia Luria Bertani.
4
MATERIAL Y MÉTODO
1. MATERIAL DE ESTUDIO
N
1.1. Material de estudio
IÓ
AC
 1.8 Kg de harina de soya procedente del mercado “La Hermelinda” de
IC
la ciudad de Trujillo – La Libertad.
UN
1.2. Material biológico
M
CO
 Un cultivo de Bacillus thuringiensis var. israelensis procedente del
Y
laboratorio Biotecnología de la Facultad de Ciencias Biológicas,
A
Universidad Nacional de Trujillo.
IC
ÁT
RM
FO
2. PROCEDIMIENTO
IN
2.1. Reactivación del cultivo de B. thuringiensis var. israelensis.

DE
Se realizó la suspensión de una colonia aislada del cultivo de

AS
B.thuringiensis var. israelensis refrigerado en 5 ml de caldo nutritivo y se

EM
incubó a 30 °C por 24 horas; después se procedió a sembrar en medio de

ST
SI
cultivo Agar Soya Tripticasa (TSA) y se incubó nuevamente a 30 °C por 24

DE
horas.
N
IO
2.2. Diseño de Biorreactores.

CC
Se construyeron 4 biorreactores modelo tanque aireado

RE
DI
modificándose el ingreso de la aireación por medio de un tubo en la parte
inferior del biorreactor. Se emplearon envases de vidrio de 2 L de
capacidad, las tapas tuvieron un orificio para la salida de CO2. En la zona
5
media del envase se hizo otro orificio para la toma de muestra con lo cual se
monitoreó el pH y recuento de células. (ANEXO 1)
2.3. Acondicionamiento y esterilización de Biorreactores.
Los biorreactores vacíos se esterilizaron utilizando luz UV a 30 cm
N
IÓ
por 15 minutos, previo tratamiento con hipoclorito de sodio al 20% por 24
AC
IC
horas (ANEXO 2). Para el insuflado de aire se emplearon bombas de
UN
aireación para peceras, el aire se distribuyó por medio de una piedra
M
CO
difusora ubicada en la base del biorreactor. El aire insuflado se esterilizó
Y
previo paso por 2 botellas de vidrio que contenían una solución saturada de
A
IC
NaCl al 23% (ANEXO 3). El vvm por biorreactor era igual a 1.
ÁT
2.4. Preparación de los medios de cultivo.
RM
2.4.1. Medio Luria Bertani:

FO
IN
El medio fermentativo control se preparó tomando como referencia el

DE
caldo Luria Bertani (10 gr/L peptona de caseína, 5g/L extracto de

AS
levadura y 5 gr/L de NaCl). Se ajustó el pH a 7.0 adicionando NaOH

EM
1,0 N antes de ser autoclavado a 121 °C por 15 minutos.

ST
SI
2.4.2. Extracto acuoso de harina de soya:

DE
Para la preparación de las diferentes concentraciones de extracto acuoso

N
IO
de harina de Glycine max “soya” se pesó 200, 600 y 1000 gr de harina

CC
RE
de soya y se solubilizó en 2 litros de agua destilada cada uno,

DI
sometiéndose a un tratamiento térmico a 80 °C por 10 minutos, luego se
decantó (ANEXO 4) y se filtró el sobrenadante mediante un equipo de
filtración al vacío empleando membranas de filtración bacteriológicas
para obtener un volumen final de 1 litro de extracto acuoso de harina de
6
Glycine max “soya” a una concentración de 10%, 30% y 50% (ANEXO
5). Se ajustó el pH a 7.0 adicionando NaOH 1,0 N antes de ser
autoclavado a 121 °C por 15 minutos.
N
Tanto los cultivos experimentales como el grupo control fueron
IÓ
AC
suplementados con K2HPO4 (0.5 g/L), MgSO4 (0.3 g/L), MnSO4 (0.01
IC
g/L), FeSO4 (0.01 g/L), ZnSO4 (0.005 g/L) y CaCO3 (1 g/L), este último
UN
como estabilizador de pH.
M
CO
2.5. Estandarización del inóculo
Y
A
IC
Los inóculos se prepararon de la siguiente manera: Un aislado de
ÁT
colonias a partir de un cultivo de 24-48 horas de incubación en agar soya
RM
tripticasa se suspendió en 10 ml de agua destilada estéril y se comparó con

FO
el tubo N° 3 de Mac Farland (9x108 cel/ml). De esta suspensión se hicieron

IN
DE
diluciones para obtener una concentración aproximada de 7x105 cel/ml.

AS
2.6. Inoculación de los biorreactores

EM
ST
Se utilizó un volumen de 10 ml de la suspensión bacteriana

SI
obtenida en el paso anterior para inocular a cada uno de los biorreactores

DE
conteniendo 1 litro de medio fermentativo. La incubación se llevó a cabo

N
IO
en aireación constante durante 72 horas a temperatura ambiente y pH 7.

CC
(ANEXO 6)
RE
DI
2.7. Monitoreo y control
Durante el proceso de experimentación, se realizaron muestreos
cada 12 horas, extrayéndose de 5 a 10 ml de cada medio experimental para
evaluaciones de pH y recuento de células. Se hicieron coloraciones con
7
Azul de Comassie para monitorear la formación del cristal bioinsecticida.
Así como también coloración Gram para garantizar que no hubo
contaminación durante las 72 horas de incubación.
2.8. Obtención de Biomasa
N
IÓ
Terminado el tiempo de producción, se tomaron 100 ml de cada
AC
IC
biorreactor y se centrifugaron a 2000 RPM por 10 minutos (ANEXO 7),
UN
eliminándose los sobrenadantes. El sedimento se resuspendió en 100 ml de
M
CO
agua destilada estéril y se volvió a centrifugar nuevamente. Este
Y
procedimiento se hizo 2 veces. Posteriormente el sedimento se llevó a
A
IC
deshidratación en horno a 60 °C durante un tiempo de 8 horas,
ÁT
obteniéndose biomasa seca de B. thuringiensis var. israelensis expresada
RM
en gramos por litro21.

FO
2.9. Evaluación estadística de resultados

IN
DE
La determinación del efecto de las concentraciones de extracto

AS
acuoso de harina de Glycine max “soya” sobre la producción de biomasa

EM
de Bacillus thuringiensis var. israelensis se realizó analizando el recuento

ST
del peso seco, procesando los datos mediante un Análisis de Varianza

SI
Unidireccional (ANOVA) y post ANOVA Tukey B. (ANEXO 8)

DE
N
IO
CC
RE
DI
8
RESULTADOS
N
IÓ
AC
 De las 3 concentraciones de extracto acuoso de harina de Glycine max
IC
“soya” empleadas, Bacillus thuringiensis var. israelensis tuvo un mayor
UN
M
crecimiento en la concentración al 30% y 50% con respecto al medio referencial
CO
Luria Bertani después de 72 horas de incubación. (Fig. 1)
Y
A
IC
ÁT
 El peso seco de la biomasa a las 72 horas de incubación en las
RM
FO
concentraciones al 10, 30 y 50% de extracto acuoso de harina de Glycine max

IN
“soya” fue de 0.2943, 0.6036 y 0.8020 g/L respectivamente. En el medio

DE
referencial Luria Bertani el peso seco fue de 0.4935 g/L. Existe diferencia
AS
significativa entre la biomasa producida en los 4 medios de cultivo. (Fig. 2)

EM
ST
SI
DE
 Coloración azul de comassie después de 72 horas de incubación. Se

N
observan los cristales bioplaguicidas de forma bipiramidal, esporas y células

IO
CC
vegetativas de Bacillus thuringiensis var. israelensis, que en conjunto conforman

RE
la biomasa. (Fig. 3)
DI
9
4.01E+07
cel/ml
N
3.51E+07
IÓ
AC
3.01E+07
MEDIOS DE
IC
CULTIVO
2.51E+07
UN
LB
M
2.01E+07
A
CO
1.51E+07 B
Y
C
A
1.01E+07
IC
ÁT
5.10E+06
RM
1.00E+05
FO
0 12 24 36 48 60 72
IN
Horas (h)
DE
AS
EM
Fig 1. Curva de crecimiento de Bacillus thuringiensis var. israelensis en 72 horas de incubación. Se observa mayor crecimiento en la
concentración al 30% (B) y 50% (C) de extracto acuoso de harina de Glycine max “soya” con respecto al crecimiento en el medio Luria
ST
Bertani (LB) y la concentración al 10% (A) de extracto acuoso de harina de Glycine max “soya”. Promedio de 3 repeticiones.
SI
DE
*LB= Luria Bertani

*A= Extracto acuoso de harina de Glycine max “soya” al 10%
N
O
*B= Extracto acuoso de harina de Glycine max “soya” al 30%

I
CC
*C= Extracto acuoso de harina de Glycine max “soya” al 50%

RE
DI
10
0.9000
0.8020
N
0.8000
IÓ
AC
0.7000
0.6036
IC
Biomasa (g/L) 0.6000
UN
0.4935
0.5000
M
CO
0.4000 a
0.2943
Y
0.3000 a
a
A
IC
0.2000
ÁT
a
0.1000
RM
FO
0.0000
LB A B C
IN
MEDIOS DE CULTIVO
DE
AS
a: p<0.05 EM
Fig 2. Biomasa producida por Bacillus thuringiensis var. israelensis en 72 horas de incubación. Se observa mayor producción de biomasa en
ST
la concentración al 30% (B) 50% (C) de extracto acuoso de harina de Glycine max “soya” con una producción de 0.6036 g/L y 0.8020 g/L
SI
respectivamente. Y una menor producción en el medio referencial Luria Bertani (LB) y la concentración al 10% (A) de extracto acuoso de
DE
harina de Glycine max “soya” cuya producción fue de 0.2943 g/L y 0.4935 g/L respectivamente. Promedio de 3 repeticiones.
N
*LB= Luria Bertani

I O
*A= Extracto acuoso de harina de Glycine max “soya” al 10%

CC
*B= Extracto acuoso de harina de Glycine max “soya” al 30%

RE
*C= Extracto acuoso de harina de Glycine max “soya” al 50%

DI
11
N
IÓ
AC
B
C
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
A
FO
IN
DE
AS
Fig 3. Observación microscópica a 1000 aumentos, coloración azul de comassie después de 72 horas de incubación en el medio con extracto
EM
acuoso de harina de Glycine max “soya” al 50%. Se observan los cristales bioplaguicidas de forma bipiramidal (A), esporas (B) y células
ST
vegetativas de Bacillus thuringiensis var. israelensis (C), que en su conjunto conforman la biomasa.
SI
DE
*A= Cristales bioplaguicidas de forma bipiramidal.

*B= Esporas de Bacillus thuringiensis var. israelensis.
N
O
*C= Células vegetativas de Bacillus thuringiensis var. israelensis.

I
CC
RE
DI
12
DISCUSIÓN
El costo de producción de formulaciones de B. thuringiensis var.
israelensis a través de la tecnología de fermentación existente (utilizando un
N
fermentador) es extremadamente alta. Por lo tanto, el uso de estos bioinsecticidas
IÓ
AC
tiene limitaciones. Para proteger la seguridad del medio ambiente, el uso de
IC
bioinsecticidas ha hecho hincapié en las últimas dos décadas. Esto justifica el
UN
desarrollo de medios más económicos para el cultivo de B. thuringiensis var.
M
CO
israelensis y facilitar así la producción de bioinsecticidas.
Y
En este estudio se observó que en todos los medios de cultivo la
A
fase exponencial de Bacillus thuringiensis
IC var. israelensis se inició
ÁT
RM
aproximadamente entre las 6 y 12 horas en adelante. Este crecimiento duró hasta

FO
las 48 horas, después de lo cual la bacteria entró en la fase estacionaria de

IN
crecimiento (48-72 h). La esporulación se inició en 48 h de crecimiento y la

DE
esporulación completa se logró a las 60 horas. A las 72 horas de incubación se

AS
encontró que las esporas habían sido liberadas de las células vegetativas junto a
EM
los cristales bioinsecticidas. (ANEXO 7).

ST
SI
Según muestran los resultados la bacteria fue capaz de digerir los

DE
nutrientes de todos los medios de cultivo por completo en 72 h. Se observó

N
IO
además que, el patrón de crecimiento de Bacillus thuringiensis var. israelensis de

CC
medios experimentales (30% y 50 %) fue mayor que el medio convencional (LB),

RE
DI
corroborando los resultados de la producción de biomasa en el presente estudio.
La biomasa de Bacillus thuringiensis var. israelensis producida en
los diferentes medios de cultivo varió. Como se resume en la Fig. 2, el medio de
cultivo al 50% de extracto acuoso de harina de Glycine max “soya” tuvo la mayor
13
producción de biomasa en comparación con todos los medios, incluyendo el
medio de cultivo de referencia (LB), siendo así la harina de Glycine max “soya”
una potencial alternativa en la producción a escala industrial de Bacillus
thuringiensis var. israelensis, dada la buena producción de biomasa y su bajo
N
IÓ
costo de adquisición a comparación de otros medios convencionales.
AC
IC
En el pasado, muchas otras formulaciones de Bacillus thuringiensis var.
UN
israelensis producido a partir de los medios convencionales estándar (Luria
M
CO
Bertani) se han probado. Obeta y Okafor11 cultivaron Bacillus thuringiensis var.
Y
israelensis en cinco medios de cultivo (semillas de legumbres, sangre de vaca
A
IC
seca y sales minerales) para estudiar la producción de Bacillus thuringiensis.
ÁT
Saalma et al. y Kuppuswamy12,13 también han utilizado con éxito harina de
RM
FO
pescado y licor macerado de maíz para la producción de Bacillus thuringiensis

IN
var. israelensis, pero no se determinó en campo su eficacia. El presente estudio

DE
también corrobora los informes anteriores de que Bacillus thuringiensis var.

AS
israelensis, como las bacterias potenciales para el control de mosquitos, también

EM
utiliza un producto agrícola como la soya para su producción.

ST
SI
La diferencia en el crecimiento de Bacillus thuringiensis en

DE
diferentes medios de cultivo puede ser debido a las diferencias en la

N
IO
disponibilidad de nutrientes de crecimiento. Es interesante observar que las

CC
diferencias obtenidas al final de la fermentación dependen del medio de cultivo y

RE
las condiciones de funcionamiento22.

DI
La harina de soja se considera un producto de alta calidad debido a
su alta digestibilidad, contenido de alta energía, y consistencia. Es una fuente
altamente concentrada de proteína con un perfil de aminoácidos excelente18.
14
El oxígeno disuelto es necesario durante el crecimiento vegetativo
de la bacteria para la regulación de la tasa de asimilación de fuentes de carbono.
Anteriormente, la optimización de la concentración adecuada de oxígeno disuelto
ha sido reportado como un factor importante en el cultivo discontinuo de B.
N
IÓ
thuringiensis23, 24. Aunque hubo varios estudios disponibles en relación con los
AC
IC
efectos del oxígeno sobre la concentración de biomasa25, había pocos trabajos
UN
relativos a los efectos del oxígeno sobre la síntesis de la toxina26. Por otra parte,
M
CO
las investigaciones se llevaron a cabo bajo condiciones de aireación constante, a lo
Y
largo de la fermentación. La disponibilidad de oxígeno al medio de cultivo es
A
IC
esencial para garantizar la producción óptima de B. thuringiensis. Sin embargo,
ÁT
este factor debe controlarse cuidadosamente ya que el exceso o la limitación de
RM
oxígeno puede afectar a las formas de ruta metabólicas, que participan en la

FO
producción de delta endotoxina26.

IN
DE
El pH es un parámetro importante y es necesario ajustar los medios de cultivo

AS
para mantener este parámetro en un valor mayor a 5.0. El crecimiento se favorece

EM
en un pH entre 5.6 y 8.526. Para este estudio se empleó CaCO3 (1gr/L) como
ST
SI
estabilizador de pH por lo que este parámetro no tuvo un cambio significativo

DE
durante el tiempo de incubación28.

N
En la elección de los materiales para la producción de medios de

IO
CC
cultivo para B. thuringiensis, deben considerarse tres factores: disponibilidad, el

RE
costo y lo bien que la bacteria podría utilizarlos28. La harina de soya podría

DI
representar un beneficio económico para la producción de bioinsecticidas, porque
permitió una máxima producción de biomasa superior a un menor costo, en
comparación con fuentes de nutrientes convencionales.
15
N
CONCLUSIONES
IÓ
AC
IC
UN
De acuerdo a los resultados obtenidos y en las condiciones trabajadas se concluye:
M
CO
Y

A
El efecto de las concentraciones del extracto acuoso de harina de Glycine max
IC
“soya” evidenció el incremento en la producción de biomasa de Bacillus
ÁT
RM
thuringiensis var. israelensis.

FO
IN
 La mayor producción de biomasa se dio al 50 % de concentración de extracto

DE
acuoso de harina de Glycine max “soya” con respecto al medio referencial

AS
Luria Bertani.
EM
ST
SI
 El extracto acuoso de harina de Glycine max “soya” al 30% y 50% favorece a

DE
un mayor crecimiento de Bacillus thuringiensis var. israelensis con respecto

N
IO
al medio referencial Luria Bertani.

CC
RE
DI
16
N
IÓ
AC
RECOMENDACIONES
IC
UN
M
CO
Y
 Utilizar otras materias primas de bajo costo además de la harina de soya
A
IC
para potenciar aún más los resultados obtenidos en esta investigación. Así
ÁT
como también disminuir el tiempo de producción de la toxina.
RM
FO
IN
DE
AS

EM
Evaluar la toxicidad de los cristales bioinsecticidas producidos por Bacillus

ST
thuringiensis var. israelensis frente a vectores y plagas, a partir de materias

SI
primas en posteriores investigaciones.

DE
N
IO
CC
RE
DI
17
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RE
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Microbiology and Biotechnology. 1991; 7: 231 – 236.
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
22
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
ANEXOS ÁT
IC
A
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
23
ANEXO 1. Diseño de biorreactor tipo aireado de 2 litros de capacidad.
Salida de CO2
N
IÓ
AC
Difusor
de aire
IC
Toma de
UN
muestra
M
CO
Ingreso de
aire estéril
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
ANEXO 2. Esterilización de los biorreactores empleando radiación UV

DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
24
ANEXO 3. Sistema de esterilización del aire empleando bombas de pecera y
botellas de vidrio que contenían una solución saturada de NaCl al 23%.
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
ANEXO 4. Extracto acuoso de harina de Glycine max “soya” al 10%, 30% y 50%
AS
después del decantado.

EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
25
ANEXO 5. Filtración al vacío del extracto acuoso de harina de Glycine max
“soya” para su posterior uso como medio de cultivo de Bacillus thuringiensis var.
israelensis.
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
ANEXO 6. Incubación de los medios de cultivo en los biorreactores durante 72

AS
horas a temperatura ambiente y aireación constante.

EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
26
ANEXO 7. Obtención de Biomasa de Bacillus thuringiensis var. israelensis a las
72 horas de incubación en extracto acuoso de harina de Glycine max “soya” al
50%, después de centrifugar a 2000 rpm por 10 minutos.
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
ANEXO 8. Datos de biomasa seca de Bacillus thuringiensis var. israelensis

AS
procesados mediante un Análisis de Varianza Unidireccional (ANOVA) y post

EM
ST
ANOVA Tukey B
SI
DE
ANOVA de un factor
N
Biomasa
IO
CC
Suma de gl Media F Sig.

RE
cuadrados cuadrática
Inter-
DI
,405 3 ,135 125,053 ,000

grupos
Intra-
,009 8 ,001
grupos
Total ,414 11
27
Pruebas post hoc
Subconjuntos homogéneos
Biomasa
N
IÓ
Tukey B
AC
Subconjunto para alfa = 0.05
IC
cc N
1 2 3 4
UN
10 3 ,294267
M
0 3 ,493533
CO
30 3 ,603600
50 3 ,802033
Y
Se muestran las medias para los grupos en los
A
IC
subconjuntos homogéneos. ÁT
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 3,000.
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
28

Novoa Garcia, Heli Alonso

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

harina de Glycine max “soya” sobre la producción de

biomasa de Bacillus thuringiensis var. israelensis.

PARA OPTAR EL TÍTULO DE

AUTOR: Br. HELÍ ALONSO NOVOA GARCÍA

ASESOR: Dr. HEBER MAX ROBLES CASTILLO

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE

Dr. RUBÉN VERA VÉLIZ

Dr. STEBAN ALEJANDRO ILICH ZERPA

PROFESOR SECRETARIO GENERAL

AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS

Dr. ENRIQUE PADILLA SAGÁSTEGUI

Dra. EVA VILLANUEVA TARAZONA

DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO

El que suscribe, Asesor de la presente Tesis titulada:

Respecto al informe, éste ha sido revisado y acoge las observaciones y

continuar con los trámites correspondientes.

Dr. Heber Max Robles Castillo

Esperando que vuestro criterio sea de comprensión por errores u omisiones

cometidos en la elaboración del presente trabajo, me someto a vuestro dictamen.

Trujillo, Mayo 2016

Helí Alonso Novoa García

MIEMBROS DEL JURADO

Dr. HEBER MAX ROBLES CASTILLO

Ms.C. ANIBAL QUINTANA DÍAZ

Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran

que la presente tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales,

Dr. HEBER MAX ROBLES CASTILLO

Ms.C. ANIBAL QUINTANA DÍAZ

educación, tanto académica, como de la vida, por su incondicional

apoyo perfectamente mantenido a través del tiempo. Todo este trabajo

ha sido posible gracias a ellos.

A mis hermanos Jorge Alberto Novoa García, Mónica Novoa García y

Marco Antonio Novoa García. Por haberme apoyado en todo

momento, por sus consejos, por la motivación constante que me ha

A mi asesor, el Dr. Heber Max Robles Castillo, mi más amplio

agradecimiento, por su paciencia ante mi inconsistencia, por su valiosa

culminado esta Tesis en el tiempo previsto.

Al personal responsable del Departamento técnico de la E.A.P de

Microbiología y Parasitología, Carlos Alberto Guzmán Delgado, Ana

Rocío Zevallos Gonzales y Víctor Manuel Acosta Cadenillas. Por

acogerme en su ambiente de trabajo y facilitarme material y equipos

necesarios para la realización de esta tesis.

A todos mis amigos y personas especiales que estuvieron conmigo día a

día dándome fuerza y motivación para alcanzar las metas trazadas.

Ustedes también forman parte importante en la realización de esta

La investigación tuvo como objetivo evaluar el efecto del extracto acuoso de

Glycine max “soya” sobre la producción de biomasa de Bacillus thuringiensis var.

fermentación contó con aireación constante y se mantuvo a temperatura ambiente

tomas de muestra (5-10 ml) para monitorear el pH, recuento de células.

Terminado el tiempo de incubación se extrajeron 100 ml de cada biorreactor y se

centrifugó a 2000 RPM/min, luego se desechó el sobrenadante. El sedimento se

llevó a deshidratación en horno a 60 °C por 8 horas, obteniéndose biomasa seca

de Bacillus thuringiensis var. israelensis expresada en gramos por litro (g/L).

concentración a las 72 horas de incubación, fue significativamente mayor al

medio referencial. Por lo tanto, la harina de soya es un sustrato adecuado y una

buena alternativa para la producción de Bacillus thuringiensis var. israelensis.

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO………i

1.2. Material biológico.……………………………………………………5

2.1. Reactivación del cultivo de B. thuringiensis var. israelensis…...…….5

2.2. Diseño de biorreactores ……....……………………………….……..5

2.3. Acondicionamiento y esterilización de biorreactores ……………......6

2.4. Preparación de los medios de cultivo ………………………………...6