CARACTERIZACIÓN DEL PROCESO DE CRECIMIENTO DE Bacillus

subtilis BAJO CONDICIONES ANAEROBIAS

II. MATERIALES Y METODOS:

1. DETERMINACIÓN DE BIOMASA:
Se tomó la densidad óptica de los cultivos a 600 nm y comparando con
una curva de calibración de peso seco de B. subtilis. Para la
determinación del peso seco se tomaron alícuotas de cultivos a diversas
edades y se pasaron a través de membranas de filtración con un tamaño
de poro de 0.22 micras, previamente secas y taradas. Se peso por
duplicado cada muestra y se utilizó el promedio de cada muestra, las
cuales previamente se secaron en estufa a 90 °C hasta obtener un peso
constante. Con los datos obtenidos se encontró un valor de conversión
de biomasa a densidad óptica de 0.35 g/l por unidad de densidad óptica
(r2 = 0.99).

2. CEPA, MEDIOS DE CULTIVO Y PREPARACION DE INÓCULOS:

Se usó la cepa de B. subtilis BSR6 (ΔnprE, Δamy, hisA, glyB,
aprE::lacZ, CmR); BSR6 es una derivada de la cepa 168 y tiene una
fusión transcripcional aprE-lacZ integrada en el locus amyE de B.
subtilis (amyE::pTTGACA cat). En algunos experimentos se utilizó una
cepa modificada de BSR6, la JJ1, en la cual a diferencia de BSR1 se le
cambiaron cuatro bases de la caja 35 de aprE y obtener la secuencia
TTGACA. La cepa se mantuvo en crioviales conteniendo glicerol al 12
% y congelados a una temperatura de –70 °C, provenientes de cultivos
jóvenes de una densidad óptica de 1.0 crecidos en medio de cultivo
líquido Luria (5 g de extracto de levadura, 10 g de triptona y 10 g de
NaCl por litro). Para los estudios en fermentadores se utilizó el medio
Schaeffer (conteniendo por litro: 8 g de caldo nutritivo, 1 g de KCl, 0.12
g de MgSO4.7H2O, 0.1 milimoles de MnCl2; 1 milimol de Na2SO4 y
0.001 milimoles de FeSO4; a pH 7). A este medio se le añadió glucosa,
nitrato o ambos según se describe en la sección de resultados. Para la
preparación de inóculos, se tomó una asada de un tubo de conservación
congelado y se transfirió a un criovial de ensayo conteniendo 3 mililitros
de caldo Luria. Después de 12 horas de incubación, un mililitro se
transfirió a su vez a un matraz Erlenmeyer de 125 ml conteniendo 25 ml
de caldo Luria y se dejó crecer en una agitadora hasta alcanzar una
densidad óptica de 1.0 (aproximadamente 2h) y se empleó una porción
de estas células para inocular los fermentadores. Tanto el tubo como el
matraz se incubaron a 37°C y 300 rpm.