PRÁCTICA NÚMERO 02 Y 03

CONSERVACIÓN Y ACTIVACIÓN DE
MICROORGANISMOS, METODO DE
CONGELACIÓN

𝐶𝑟𝑖𝑠𝑡𝑖𝑎𝑛 𝐷𝑎𝑣𝑖𝑑 𝑂𝑞𝑢𝑒𝑛𝑑𝑜 𝐶𝑜𝑟𝑟𝑒𝑎1, 𝑂𝑠𝑖𝑟𝑖𝑠 𝑍𝑢𝑙𝑒𝑖𝑚𝑎 𝐴𝑙𝑔𝑎𝑟𝑖𝑛 𝑀𝑜𝑟𝑒𝑛𝑜 2

RESUMEN

La conservación de microorganismos de interés industrial es una técnica

encaminada al mantenimiento de las cepas altamente productivas durante largos
períodos de tiempo sin que se produzcan cambios fenotípicos, especialmente en
las características relacionadas con la producción de los metabolitos de interés,
esto se logra mediante la reducción del ritmo metabólico de los organismos. En
esta práctica se empleó el método de congelación, utilizando como
criopreservante glicerol, para posteriormente activar los microorganismos
criopreservados.

Palabras claves: Conservación, Activación, Cámara de Neubauer.

INTRODUCCIÓN grados centígrados. Existe el riesgo de

Los microorganismos tienen una
tendencia inherente a mutar en cultivos
de laboratorio, por lo que es muy
importante el uso de procedimientos
para mantenerlos viables garantizando
su estabilidad microscópica,
macroscópica, bioquímica, fisiológica y
genética. Los métodos de conservación
consisten en reducir el ritmo metabólico
de los microorganismos por retención de
nutrientes, agua y oxígeno; por
reducción de la temperatura de
conservación; o por combinación de
ambos factores.
En la conservación por congelación, las
células se congelan en suspensión en un
líquido con un agente crioprotector y se
guardan a temperaturas inferiores a cero
que algún fallo del sistema produzca una
subida no deseada de la temperatura
durante el almacenamiento. Cuando se
quiere trabajar con las células así
conservadas, se recuperan subiendo la
temperatura; a esto se le conoce como la
activación de los microorganismos
criopreservados, lo cual se realiza para
garantizar la prevalencia de estos en el
tiempo.
Para que este método se considere viable
se debe garantizar la supervivencia de al
menos el 70-80% de las células, es
cuando se recurre a determinar el
porcentaje de supervivencia del
microorganismo conservado, con una
determinación de Biomasa por Cámara
de Neubauer, la cual está formada por
varios cuadrantes como se observa en la
imagen 1, estos cuadrantes nos permiten ACTIVACIÓN
hacer conteo de células y según el
Para determinar la concentración de las
cuadrante empleado para el conteo, se células por volumen de muestra se
puede usar una fórmula para determinar empleó el conteo del cuadrante 3
la concentración de las mismas por
volumen de muestra.

Concentración (b)= 7.550.00

% Supervivencia=
(Concentración (b) / Concentración
(a))

Imagen 1. cámara de Neubauer % Supervivencia= 0,392*100 = 39.2%

CÁLCULOS MATERIALES Y MÉTODOS

Para determinar la concentración de las
células por volumen de muestra se Para la conservación:
empleó el conteo del cuadrante 3 Selección de la cepa

Se seleccionó la cepa de la microalga

Nannochloropsis sp. con la que se llevó
a cabo el proceso de conservación.
Preparación de la muestra

Se agitó vigorosamente el cultivo en

donde se encontraba la microalga ya
crecida, y en un falcon de 15 mL se
depositaron 10 mL de la muestra.

Centrifugar

Concentración (a)= 19.250.000 Se centrifugó cada falcon a 6000

gravedades durante 15 minutos.
Resuspensión
Se descartó el sobrenadante y el
precipitado quedó la microalga
concentrada; a esta microalga, le fueron
adicionados 2 mL de medio y se
suspendió.
Congelación
Se le adicionaron 220,6μl del medio de
cultivo a 529 μl de glicerol al 85% para
tener 750 μl y una concentración del
glicerol al 60%, 75 μl de medio de
cultivo y 675 mL de la microalga
concentrada en cada eppendorf y la
muestra se colocó en un rack para
eppendorf y se llevo al congelador.
Conteo en Cámara de Neubauer
Se tomaron 15 μl de la muestra (El
contenido del sobrenadante en el falcon
de 15 mL), y se dispensan en la cámara,
la cual tiene puesto con anterioridad el
cubreobjetos, y la muestra llegó por
capilaridad.
Para este conteo, fue necesario enfocar
en el objetivo 40X y se siguió el
recorrido que indicó la docente.
Para la activación:
Descongelación
1. Tomar los criotubos y coloquelos
durante 3 horas en el congelador a
5-8oC.
2. Luego sométase al refrigerador
durante 3 horas.
3. Luego someterlos a condiciones
ambientales durante 3 horas.
Conteo en Cámara de Neubauer
Finalmente, se realizó el conteo de las
células viables en cámara de Neubauer,
las células viables son aquellas capaces
de emitir destello luminoso al mover la
perilla de entrada de luz del
microscopio.
Recuento en placa
Se realizó el conteo de colonias
obtenidas.
Porcentaje de supervivencia
Determinamos el porcentaje de
supervivencia del cultivo a partir del
cálculo de la concentración inicial y
final de la biomasa en Células/Ml.
SOLUCIÓN A PREGUNTAS DE LA
GUÍA.
Métodos de conservación.
En bacterias:
1. Criocongelación: La
sobrevivencia de los
microorganismos conservados
por congelamiento puede ser
aumentada usando temperaturas
ultrabajas, las que pueden ser
conseguidas con el uso de
nitrógeno en la fase de vapor (-
196°C) o en la fase líquida (-150
a -180°C). (7).
2. Liofilización: La liofilización o
criodesecación, es uno de los
métodos más utilizados para la
conservación de cepas
bacterianas. Fue introducido en
1903 cuando Vansteenberghe
liofilizó el virus de la rabia sobre
ácido sulfúrico bajo vacío. Su
principio básico consiste
fundamentalmente en extraer por
sublimación, bajo condiciones de
alto vacío, el agua de las células
 congeladas que pasan
directamente a un estado de vapor
debido a que no hay presión
molecular que lo impida. (7).
3. Congelación bacteriana: La
congelación bacteriana es un
método físico-químico que
permite conservar
microorganismos viables a con recursos limitados, hecho
temperaturas entre -20ºC y -80ºC
por un tiempo sin sufrir cambios
genotípicos. En este proceso se
involucra el agua como
microambiente y es ella la que
cambia su estado líquido a sólido.
Las bacterias inmersas en este
medio deben adaptarse a las
condiciones de este nuevo
ambiente, transformar la
velocidad de su metabolismo,
conservar su viabilidad y evitar
los daños ocasionados por la
aparición de cristales de hielo
formados por el cambio de
temperatura. (7).
En hongos:
1. Gel de sílice: El método de
conservación de gel de sílice, es
útil para la mayoría de los hongos
conidiales, permitiendo que estos
mantengan su viabilidad. Por este
método, en el caso de algunas
especies de HE, es posible
mantener su viabilidad por más de
10 años. La principal ventaja de
En microalgas:
este método reside en su sencillez
y bajo costo, ya que no requiere de
equipo sofisticado para su
procesamiento, y mantiene la
viabilidad y la pureza de los
cultivos, además de las
características morfológicas,
genéticas y de virulencia. (13).
2. Inmersión en agua destilada:
Garantiza porcentajes de
viabilidad, pureza y estabilidad de
las cepas, lo que se une a su bajo
costo y sencillez, usando el
mismo frasco hasta que se acabe
el líquido. Este método es una
herramienta útil para laboratorios
evidenciado en este experimento,
donde no se necesitó gran
cantidad de material o equipos
especializados.(7).
3. Aceite mineral: Este método de
conservación consiste en cubrir el
cultivo del hongo con aceite
mineral para impedir la
evaporación del agua contenida
en el medio de cultivo y evitar el
incremento de presión osmótica
por concentración de los solutos,
que produciría alteraciones
importantes en el hongo (Rico et
al. 2004), además limita la
presencia de oxígeno disponible.
Por este método los hongos
pueden mantenerse viables por
más de 25 años a intervalos de
temperatura de 4°C (Sharma y
Smith 1999). Este método es
comúnmente utilizado para
hongos que no toleran la
liofilización, que presentan
escasa esporulación y cuando la
ultracongelación no es una
opción, debido a su alto costo.
(13).
1. Congelación: Se congelan las
células en suspensión en un
líquido con un agente
crioprotector y se guardan a
temperaturas inferiores a cero
grados centígrados, con lo que el
agua se congela. De esta forma, al
 no disponer las células de agua en
forma líquida, no hay
crecimiento. Cuando se quiere
trabajar con las células así
conservadas, se recuperan
subiendo la temperatura.
2. Transferencia periódica:
Consiste en realizar repiques de la
cepa cuando ha pasado un tiempo
más o menos largo. El tiempo
entre dos repiques sucesivos para
obtener células activas y vitales
varía según los casos. A
temperatura óptima de desarrollo
la vida de un cultivo tiene una
duración variable entre varios días
y algunos meses según la cepa,
composición del medio.
3.
 ● Cuadro comparativo

Microorganismo Método Ventajas Desventajas

Bacterias Criocongelación Se puede preservar por mucho Requiere aparatos especiales

más tiempo a muy bajas y costosos. (12)
temperaturas. -195 °C a -
140°C. (12) Algún fallo en el sistema
puede producir una subida
El empleo de crioprotectores no deseadas en la
no iónicos como el glicerol el temperatura de
cual proviene del daño que se almacenamiento. (12)
puede producir en la célula
microbiana al momento de la Es el método más molesto
congelación. (12) para el envío de las cepas.
(12)
El mantenimiento de la
viabilidad y funcionalidad
celular a temperaturas bajas.
(12)

Liofilización Detiene el crecimiento de

células sin causar pérdida de Inversión inicial alta. (10)
viabilidad, limitan la aparición
de generaciones sucesivas y la
actividad celular durante años. Equipos tecnológicos muy
avanzados.
Permite recuperar las
propiedades del material Requiere de personal
conservado con sólo capacitado
rehidratarlo. (10).

Es un método cómodo para el

almacenamiento a largo plazo
y para el envío de las cepas,
pues una vez conseguidos los
liófilos pueden almacenarse a
temperatura ambiente (18-
20ºC), con lo cual su envío es
muy cómodo. (12)

Congelación bacteriana Permite conservar Estrés bacteriano que

microorganismos viables por condiciona cambios de
un tiempo, sin sufrir muchos adaptación de la bacteria que
cambios genotípicos. (12) pueden ser transitorios o
permanentes en su actividad
Preservación por largos enzimática o viabilidad. (12)
periodos de tiempo de entre 1 a
2 años a temperaturas de -5 a - Aumento en la viscosidad
 20°C. (12) del citoplasma generando
dificultad en el intercambio
metabólico de los procesos
vitales del microorganismo
(12)

El frío debilita los enlaces

hidrofóbicos de las proteínas
estos cambios en organismos
muy desarrollados pueden
significar daños irreparables
para la supervivencia. (12)

Hongos Gel de sílice Tecnología sencilla y El éxito de este método a

económica. (12). largo plazo depende de
cerrar correctamente los
La mayoría de los hongos viales. (12).
esporulantes se conservan
exitosamente. (12). Durante la recuperación se
corre el riesgo de introducir
De un vial se puede obtener contaminantes. (12).
inóculo varias veces. (12).

Se puede almacenar a
temperatura ambiente o a 4°C.
(12).

No hay contaminación por

ácaros, puesto que no
sobreviven a las condiciones
de baja humedad. (12).

Inmersión en agua Permiten tener un historial, o Requiere la cepa activa.

destilada punto de referencia para
investigaciones posteriores, o Se requiere verificar
facilitar la identificación de continuamente el nivel de
microorganismos. (11). agua requerido. (12).

Garantiza porcentajes de Algunos hongos pierden su

viabilidad, pureza y viabilidad en un lapso corto
estabilidad de las cepas, lo que de tiempo. (12).
se une a su bajo costo y
sencillez, usando el mismo Se deben controlar posibles
frasco hasta que se acabe el agentes contaminantes. (12).
líquido. Es un método que
utiliza muy pocos recursos.
(11).

Recomendable para preservar

microorganismos a mediano
plazo, de 2 a 5 años. (13).
 Aceite mineral Permite impedir la Se requiere considerar el
evaporación del agua espacio disponible, ya que
contenida en el medio de los tubos deben permanecer
cultivo y evitar el incremento en posición vertical. (12).
de presión osmótica por
concentración de los solutos, Aparición de contaminación
que produciría alteraciones por otros hongos. (12).
importantes en el hongo (Rico
et al. 2004), además limita la Retraso en el crecimiento de
presencia de oxígeno las cepas recuperadas. (12).
disponible. (11).

Los hongos pueden

mantenerse viables por
tiempos prolongados, en
especial aquellos que son
susceptibles a otros métodos
de conservación. Además,
estos presentan disminución de
contaminación por ácaros.
(11).

Económico, tecnológicamente
sencillo, este método es
recomendable para
laboratorios con recursos
limitados. (12).

Microalgas Congelación Es el mejor método de Existe el peligro de que

conservación en todos los algún fallo del sistema
sentidos. produzca una subida no
deseada de la temperatura
Los microorganismos están en durante el almacenamiento.
estado de congelación, (13).
conservan una alta actividad
metabólica para soportar Requiere aparatos
cambios metabólicos y activar especiales. (13).
mecanismos de reparación
relacionados con el En la viabilidad y estabilidad
mantenimiento de la integridad de este método, pueden
celular y de esa forma con la influir factores como: Edad
capacidad de ser cultivable. de las células, velocidad en
(12). la congelación y
descongelación, temperatura
de almacenamiento y empleo
de agentes
crioprotectores.(13).

Tecnología simple. (12). Este es el peor método para

Transferencia periódica conseguir la estabilidad
 Permite la observación genética, puesto que al estar
continua del fenotipo. (12). las células creciendo hay una
alternancia de generaciones,
Algunos microorganismos y al cabo del tiempo las
pueden mantener su viabilidad células que se están
por varios años, siempre y guardando serán
cuando sean manejados por un descendientes lejanas de las
especialista. (12). células iniciales y es posible
que ya no conserven algunas
Recomendable para colonias de sus características. (14).
pequeñas. (12).
La contaminación de los
La recuperación es sencilla. cultivos resulta más fácil al
(12). tener que manejar los tubos a
lo largo del tiempo y también
por la posibilidad de entrada
de ácaros en los mismos.
(13).

Utilización continua de
muchos materiales y mano
de obra. (12).

Hablamos de banco de cepas, cuando se Se tiene que el mantenimiento de cepas se da

tiene una colección de cultivos de
microorganismos, los bancos de cepas son
fuentes de recursos genéticos cuyo propósito
es la preservación de la diversidad biológica,
garantizando su disponibilidad para su
suministro en actividades como por ejemplo,
de docencia, investigación, comerciales y
aplicaciones biológicas. En los bancos de
cepas, no solo se tienen cepas de referencia,
sino que también se tienen cepas de
microorganismos aislados, caracterizados e
identificados a partir de muestras de origen
humano, obtenidas de investigaciones
realizadas en diferentes periodos de tiempo,
habilitando así su categoría como cepas de
referencia. La preservación de los
microorganismos de la colección debe
garantizar su viabilidad en estado inactivo,
puro y homogéneo, bajo condiciones.
con el fin de preservar los microorganismos
de la mejor manera posible, evitando así la
contaminación o los cambios fenotípicos que
estos puedan presentar, garantizando así la
viabilidad y estabilidad de los
microorganismos en un estado inactivo, puro
y homogéneo, bajo condiciones que aseguren
la estabilidad microscópica, macroscópica,
bioquímica, fisiológica y genética, como se
mencionó anteriormente, sin variaciones
fenotípicas ni mutaciones con respecto a las
condiciones originales. Según la literatura
consultada, el método más común empleado
para el mantenimiento de cepario es la
transferencia seriada, en la cual se utilizan
tubos con agar, en forma de pico de flauta,
que permiten conservar mejor el medio fresco
y la cepa libre de contaminantes por su boca
angosta y su cierre con tapa, esto en el caso
de los hongos. (18).
¿Qué podemos definir como cepa de
trabajo y cuál es el procedimiento para su
mantenimiento?
Podemos definir como cepa de trabajo a los
subcultivos primarios obtenidos de una cepa
de reserva con la cual se llevará a cabo un
estudio o una investigación.
El procedimiento para el mantenimiento de
cepas de trabajo debe ser:
● Un buen método de conservación de
modo de mantener los
microorganismos vivos, puros y la
cepa microbiana original.
● Tener los conocimientos básicos de
Microbiología (ej. tipo de
microorganismo, crecimiento, etc.).
● Proveer condiciones adecuadas para
cada tipo de microorganismo y tener
en cuenta que con cada subcultivo,
hay riesgo de cambio de la cepa.
¿Cómo se clasifican los agentes
crioprotectores por composición o tipo de
molécula y mecanismo de acción? Explique
detalladamente (dibujo y texto) los
mecanismos de acción por los que se ejerce
la protección de los constituyentes
celulares (son dos principalmente).
Bioquímicamente es posible distinguir tres
tipos de crioprotectores, los alcoholes
(metanol, etanol, propanol, 1-2 propanediol y
glicerol), azúcares (glucosa, lactosa, sucrosa,
sacarosa) y el dimetil sulfóxido, los
crioprotectores pueden clasificarse también
en agentes penetrantes y no penetrantes de
acuerdo a la permeabilidad celular.(18)
Los crioprotectores penetrantes:
Son de bajo peso molecular y permeables a
través de la membrana celular. Son utilizados:
el glicerol, el dimetilsulfoxido (DMSO) y
propanediol (PROH). El dimetil sulfóxido es
un solvente bipolar aprótico, hidrosoluble, de
bajo peso molecular; desde el descubrimiento
de sus propiedades crioprotectoras por
Lovelock en 1959, el DMSO se ha usado
como un crioprotector. Su acción
crioprotectora se atribuye principalmente a su
habilidad de prevenir acumulación excesiva
de electrolitos y otras sustancias durante el
proceso de congelamiento, y la formación de
cristales de hielo que rompen la estructura de
la membrana, su bajo peso molecular permite
la entrada rápida través de la membrana
celular, modula la estabilidad y fases de la
bicapa de los fosfolípidos, así como también
afecta los procesos de solvatación de agua. Se
han sugerido las interacciones electrostáticas
de DMSO con fosfolípidos lo cual parece ser
crítico para la crioprotección de la membrana.
El 1-2. propanediol ha sido utilizado
principalmente para congelación de
blastocistos y embriones en estado de
preimplantación de humanos y otras
especies.(14).
Agentes crioprotectores no-penetrantes:
Son sustancias de alto peso molecular,
efectivas a velocidades altas de congelación,
son importantes por ejercer su acción
crioprotectora promoviendo la rápida
deshidratación celular y suelen usarse
asociados a los agentes penetrantes. Los más
utilizados son: sacarosa, glucosa, dextrosa y
dextrano. Estos compuestos generalmente
son polímeros que forman puentes hidrógeno
con el agua, reduciendo la actividad de agua
a una magnitud mucho mayor que la que se
predeciría por su concentración molar (ellos
no obedecen la ley de Raoult). (14)

(16)
(15)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Si bien es cierto que, las microalgas
son difíciles de concentrar o separar
por su pequeño tamaño. (3). En la
búsqueda de cosechar y conservar
microalgas en el tiempo, se han
utilizado varios métodos de
concentración de microalgas. (4). El
empleado por nosotros fue el de
centrifugación a 6000 gravedades
durante 15 minutos. Sin embargo,
existen algunas limitaciones, en
primer lugar, el proceso consiste en
exponer las células a altas fuerzas
gravitacionales y cortantes que
dañan la estructura celular. (5). Esto
puede explicar algunas células con
figuras tipo media luna observadas
con el microscopio en la cámara de
Neubauer, lo cual reduce el
porcentaje de viabilidad celular.
Implementamos glicerol al 60%
como crioprotector. Este previene el
daño a las membranas celulares
causado por la formación de cristales
de hielo intracelulares, mejorando
así los beneficios de las temperaturas
de almacenamiento bajo cero, como
lo indica . (6). Algunos de los
factores que pueden influir o que
bajan el punto de conservación son
la edad de las células, la velocidad en
la congelación y descongelación, la
temperatura de almacenamiento y el
empleo de agentes crioprotectores.
(1). inducir variaciones extremas en
las propiedades químicas, térmicas y
eléctricas, las cuales pueden alterar
las membranas celulares, los
organelos y la delicada interacción
entre las células a criopreservar. Los
mejores crioconservantes son los
capaces de entrar a la célula sin
dañarla.
Después de hacer la activación
tuvimos un porcentaje de
supervivencia muy bajo, esto nos
llevó a pensar que tal vez el método
de concentración que
implementamos tuvo algo que ver
pues al momento de analizar los 15
μL del sobrenadante en el
microscopio como se especificó
anteriormente notamos lo que al
parecer eran células lastimadas, algo
por similar sucedido en una
investigación que indicaba que “no
se podía lograr una vida útil
aceptable, puesto que algunas
especies de microalgas quedaban
muy delicadas y no pudieron retener
más de unos pocos días después de la
cosecha, independientemente de la
técnica de almacenamiento o
conservación.” (6). Otro factor que
pudo afectar considerablemente fue
la velocidad de congelación y
descongelación. En general es mejor
que las variaciones de la temperatura
sean rápidas, tanto para la
congelación como para la
descongelación, por lo que para
descongelar conviene poner las
células a 37 °C. (8).
CONCLUSIONES
En este estudio se obtuvo una tasa de
conservación o un porcentaje de
conservación muy bajo. El método
utilizado fue el de congelación y el
porcentaje de supervivencia
obtenido fue de un 39.2% lo que
indica que no se alcanzaron los
objetivos de conservación, esto se
pudo dar por razones como, errores
humanos, el método de recolección
con centrifugación.
Los métodos de conservación
brindan la prolongación de un
microorganismo en el tiempo, estos
deben garantizar la viabilidad y
salvaguardar la pureza genética sin
perder ninguna de las propiedades
genéticas de los microorganismos.
Sin embargo, si un método de
conservación no es capaz de
mantener al menos el 70% de la
muestra o de las células vivas, este
no es un método viable.
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