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Obtención de bioetanol a partir de hojas de papel de reciclo utilizando dos diferentes microorganismos: aplicaciones

Obtención de bioetanol a partir de hojas de papel de reciclo utilizando dos diferentes microorganismos: aplicaciones de la biotecnología.

Obtention of bioethanol from recycled paper sheets using two different microorganisms:

applications of biotechnology.

Vladimir Allex Martínez-Rojas* Miguel A. Flores-Telona, Víctor F. Huerta-Valencia, Edgar Lopez-Rivera, Julio C. Molina-Delgado, Manuel Rodriguez-Castillo.

Licenciatura en Quimica Farmaceutica Biológica de la Universidad Autonoma Metropolitana Unidad Xochimilco. Primera publicación 08 abril del 2011.

Resumen

En el presente trabajo se implementó un proceso dividido en dos etapas: bioconversión de los carbohidartos contenidos en el papel a azúcares fermentables por medio de Cellulomonas sp y la utilización de estos azúcares mediante una sacarificación enzimática para la obtención de bioetanol por medio de Saccharomyces cerevisiae. Se utilizaron 3 medios como fuentes de carbono: hojas de papel, carboximetilcelulosa como inductores de la síntesis de enzimas celulíticas y glucosa como represor. En la primera etapa la bacteria se incubó a 37ºC/120 rpm, se tomaron muestras cada tres horas, las muestras fueron analizadas para medir de forma indirecta el crecimiento mediante la cuantificación de proteínas, y actividad enzimática de celulasas. La fermentación se detuvo a las 48 h. En la segunda etapa del proceso se utilizaron las enzimas para degradar papel de reciclo el cual se incubó con las enzimas durante 72 h a 50ºC obteniéndose azúcares fermentables, utilizados por la levadura Saccharomyces cerevisiae para la producción de bioetanol, dicha fermentación se llevó acabo a 72 h a 28ºC.

Palabras claves: papel reciclado, Cellulomonas sp. Saccharomyces cerevisiae. Bioetanol, fermentación.

Abstract.

In this work we implemented a two-stage process: bioconversion of carbohidartos contained in the paper to fermentable sugars by Cellulomonas sp and use of these sugars by enzymatic saccharification for bio-ethanol by Saccharomyces cerevisiae. Three media were used as sources of carbon sheets, carboxymethylcellulose as inducers of enzyme synthesis and glucose as a repressor cellulite. In the first stage, the bacteria were incubated at 37 ° C/120 rpm, samples were taken every three hours, the samples were analyzed for growth indirectly by quantifying protein and enzymatic activity of cellulases. Fermentation was stopped at 48 h. In the second stage of the process used enzymes to degrade paper recycling which was incubated with enzymes for 72 h at 50 ° C obtaining fermentable sugars, used by the yeast Saccharomyces cerevisiae to produce ethanol, said fermentation was carried out at 72 has 28 º C.

Keywords:

recycled

paper, Cellulomonas

sp.

Saccharomyces

cerevisiae.

Bioethanol,

fermentation.

1. Introducción

 

Desde mediados del siglo XX se impulsó el desarrollo de energías alternativas basadas en recursos naturales renovables y menos contaminantes; debido al alto costo del petróleo, la tendencia a que siga aumentando, así como la disminución de los reservas naturales ha afectado la seguridad energética mundial. Los países no productores de petróleo se han visto forzados a gastar una parte significativa de sus presupuestos en la importación de combustibles de origen fósil. Así

surgieron los llamados biocombustibles (combustibles de origen orgánico) provenientes de la biomasa, o materia orgánica que constituye a todos los seres vivos del planeta. Esta materia orgánica puede provenir de cultivos como caña de azúcar, maíz, sorgo, yuca y otros, usados para producir etanol, y, los aceites provenientes de palma africana, soya, higuerilla, jatropha curcas, colza y otras plantas, además de fuentes alternativas con alto contenido de celulosa como el papel de reciclo el cual es un desecho que se esta evaluando para producir biodiesel.

En el presente trabajo se implementó un diseño experimental para la obtención de bioetanol a partir de papel de reciclo. Se inoculo la bacteria Cellulomonas flavigena en un medio mineral que contenía el papel de reciclo como fuente de carbono para la producción de enzimas celulasas, posteriormente estas enzimas se utilizaron para sacarificar papel de reciclo y obtener azucares fermentables que fueron utilizados por la levadura Saccharomyces para la producción de bioetanol.

2. Material y métodos 2.1 Cepas y medios de cultivo

Cellulomona flavigena fue otorgada por la Dra. Angélica Gutiérrez (Departamento de Biotecnología de la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco) que fue cultivada en un medio mínimo compuesto por (g/l): NaCl 5.5; (NH 4 ) SO 4 2.5; CaCl 2 0.1; MgSO 4 0.1, extracto de levadura 2; fuente de carbono 2.5 que se empleo papel de reciclo como sustrato propuesto; carboximetilcelulosa como medio inductor y glucosa como medio represor los medios fueron incubados a 37° C a 150 rpm; tomando muestras cada tres

horas. Saccharomyces cerevisiae fue otorgada por la Dra. Angélica Gutiérrez (Departamento de Biotecnología de la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco) que fue cultivada en un medio YPD compuesto por (g/l):

glucosa 0.5; extracto de levadura 0.3; peptona 0.5; fosfato diamónico 0.025. Que fue incubada a 28 ° C a 150 rpm.

2.2 Tratamiento del papel

El tratamiento del papel se realizó por una

hidrolisis

ácida,

para

ello

se

pesó

el

equivalente a 50 g de papel, se cortó en

pequeños trozos

y

se

molieron en una

licuadora, enseguida la extracción de la tinta se llevó a cabo con 200 mL de una

mezcla

metanol-acetona

(40-60)

y

el

exceso de solventes se eliminó con agua

destilada,

posteriormente

la

pulpa

obtenida fue secada en una estufa a 50 °C durante 1 hora y nuevamente se molió en una licuadora, enseguida se coló el papel para obtener una muestra más homogénea, y se continuo con la hidrolisis que se realizó con 200 mL de

agua a pH 6

(ajustada con ácido cítrico)

durante 10 minutos a 900 rpm;

posteriormente

se

colocó

la

pulpa

de

papel hidrolizado en una charola para ser

secada en una estufa durante 24 h

a

50

°C; el papel hidrolizado una vez más fue molido para obtener un sustrato más fino y se pesaron 5 g para colocarlos en el medio de cultivo. Se determinó el crecimiento de C. flavigena en los medios de glucosa y papel empleando el método de densidad óptica leyendo las muestras a una longitud de onda a 550 nm.

Las muestras de carboximetilcelulosa y papel se centrifugaron a 10 000 rpm durante 10 minutos; tomando los sedimentos para después lavarlos y resuspenderlos en solución isotónica de cloruro de sodio al 0.9 %. A estas muestras se analizaran por el método de Bradford (Bradford, 1976) para medir el

crecimiento bacteriano

en

el

paquete

celular. Para determinar la cantidad de

azucares reductores liberados de la

actividad enzimática por medio

de

la

técnica del ácido dinitrosalicilico (DNS). (Miller, 1959)

2.3 Producción de bioetanol

En la segunda etapa del proceso para la producción de bioetanol se utilizaron las enzimas obtenidas en la primera etapa

para degradar papel de reciclo el cual se incubó con las enzimas durante 72 h a 50ºC obteniéndose azúcares fermentables, los cuales fueron utilizados por la levadura Saccharomyces cerevisiae para la producción de etanol, la levadura se incubó a 28ºC durante 72h, su crecimiento se monitoreó midiendo por densidad óptica y el consumo de azucares por el método del ácido dinitrosalicílico.

3. Resultados y discusión

Determinación de crecimiento de Cellulomonas flavigena mediante D. O.

4.00E+09 Glucosa CMC Tiempo (h) [] BACTERIANA (bacterias/ml) 60 40 20 0 4.50E+09 3.00E+09 3.50E+09 2.50E+09
4.00E+09
Glucosa
CMC
Tiempo (h)
[] BACTERIANA (bacterias/ml)
60
40
20
0
4.50E+09
3.00E+09
3.50E+09
2.50E+09
2.00E+09
1.50E+09
1.00E+09
5.00E+08
0.00E+00

Grafica

1.

Grafica

de

crecimiento

Cellulomonas flavigenas.

de

Determinación del crecimiento de Cellulomonas flavigena mediante la estimación de proteínas totales en el paquete celular

0.00 40 20 0 10 1.00 0.90 0.80 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 Glucosa 0.70
0.00
40
20
0 10
1.00
0.90
0.80
0.60
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
Glucosa
0.70
30
50
60
Tiempo (h)
Absorbancia (595 nm)
Papel
CMC

Gráfica

2.

Curva

de

crecimiento

de

Cellulomonas flavigena determinado mediante la técnica de Bradford, en los tres diferentes medios de cultivo.

Cuantificación

extracelulares

de

proteínas

totales

0 0.1 0.07 0.09 0.08 0.01 0.06 0.05 0.04 0.02 0.03 Absorbancia (595 nm) Tiempo (h)
0
0.1
0.07
0.09
0.08
0.01
0.06
0.05
0.04
0.02
0.03
Absorbancia (595 nm)
Tiempo (h)
60
50
40
30
20
0 10
Papel
CMC

Gráfica 3. Cuantificación de proteínas extracelulares de Cellulomonas flavigena al crecer en papel y CMC como fuentes de carbono, determinado mediante la técnica de Bradford.

Determinación de la actividad enzimática mediante la estimación de la concentración de azúcares reductores

Actividad enzimática UI (Mm/mL)/min Tiempo (h) 10000 0 10 20 30 40 50 60 9000 Papel
Actividad enzimática UI (Mm/mL)/min
Tiempo (h)
10000
0
10
20
30
40
50
60
9000
Papel
CMC
1000
0
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000

Grafica 4. Determinación de la actividad enzimática (UI). UI definida como la cantidad de enzima necesaria para liberar una µmol de azúcar reductor por mL en un minuto.

En la primer gráfica se observa un control

inmediato de las feses del crecimiento de

Cellulomonas flavigena mediante un

control inmediato por medio de D.O, el

cual confirmo la fase estacionaria de la

fermentación. En la determinación de

crecimiento bacteriano por la técnica de

Bradford mostrada en la gráfica dos los

datos confirman que hubo un buen

crecimiento en nuestro sustrato propuesto

comparado con el medio inductor y el medio represor.

La

gráfica

tres

muestra

los

valores

obtenidos

tras

la

cuantificación

de

proteínas totales

extracelulares, se

observa una mayor cantidad de proteínas en el medio con papel con respecto al medio inductor.

determinara por medio

de

una

cromatografía de gases (FID) con lo cual concluye el presente trabajo.

 

5. Referencias

 

En la determinación

de

la

actividad

 
 

1.

C.

Asha Poorna,

P.

Prema.

(2007)

enzimática los

valores

sugieren

una

mayor actividad (UI) en el medio inductor, y en cuanto al medio con papel se ve disminuida dicha actividad.

Production of cellulase-free endoxylanase from novel alkalophilic thermotolerent Bacillus pumilus by solid-state

4. Conclusiones

fermentation and its application in wastepaper recycling; Bioresource

El papel de reciclo fue una buena fuente

Technology 98, 485490.

de carbono

para

el crecimiento

 

Cellulomonas flavigena

y

así

la

2. Idania Valdez-Vazquez, Richard

producción

de

celulasas,

siempre

y

cuando exista un previo tratamiento de

Sparling, Derek Risbey, Noemi Rinderknecht-Seijas, He´ctor M. Poggi-

dicho papel. Con esto

se contribuye al

Varaldo. (2005) Hydrogen generation via

desarrollo

de

fuentes

alternativas

de

energía, así como a la conservación del medio ambiente.

anaerobic fermentation of paper mill wastes; Bioresource Technology 96,

19071913.

La primera etapa del proyecto se realizo satisfactoriamente obteniendo las enzimas celulolíticas necesarias para la de gradación del papel y posteriormente la obtención de azúcares fermentables.

3. Amtul Jamil Sami, M. Waheed Akhtar,* Nadeem Nawazish Malik and Bashir Ahmad Naz. (1988) Production of free and substrate-bound cellulases of

Esto

dio

pauta

a

la siguiente etapa del

Cellulomonas flavigen; Enzyme Microb.

trabajo

de

investigación

que

es

la

Technol, vol. 10.

producción

de

bioetanol

que

es

el

principal objetivo. Esta etapa sigue en

desarrollo, la presencia de bioetanol se

  • 4. Yuya Yamashita, Chizuru Sasaki,

Yoshitoshi Nakamura. (2010) Development of efficient system for

ethanol production from paper sludge pretreated by ball milling and phosphoric acid; Carbohydrate Polymers 79, 250

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improves

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