Biologia Celular

Curso Introductorio de Biologa Molecular
Construccin de Bibliotecas de ADN-Recombinante en el Bacterifago lambda para el aislamiento de clonos de genes
Patricia E !"le#$ Esperan#a Rodrgue# % Pedro A Moreno
P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno
Curso Introductorio de Biologa Molecular
Construccin de Bibliotecas de ADN-Recombinante en el Bacterifago lambda para el aislamiento de clonos de genes
Patricia E !"le#$ Esperan#a Rodrgue# % Pedro A Moreno
Curso Introductorio de Biologa Molecular Construccin de Bibliotecas de A !"Reco#binante en el Bacteri$ago la#bda. Pri#era edicin Car%tula& Bacterias de E. coli ' bacteri$ago la#bda Biblioteca del Congreso de la Re()blica de Colo#bia Inclu'e re$erencias bibliogr%$icas e ndice. I*B! +,-"..",/0-"1 2odos los derec3os reser4ados. Patricia E !"le# es 5icenciada en Biologa de la 6ni4ersidad del Cauca ' Maestra en 7entica 8u#ana de la 6ni4ersidad !acional de Colo#bia. Pro$esora del e(arta#ento de Biologa de la 6ni4ersidad del Cauca, Po(a'%n, Colo#bia. pvelez@atenea.ucauca.edu.co Pedro A Moreno es Bilogo de la 6ni4ersidad !acional de Colo#bia ' octorante en Biologa Celular ' Molecular del e(arta#ento de Biologa ' Bio9u#ica de la 6ni4ersidad de 8ouston, 8ouston, 2:. EE.66. pmoreno2@bayou.uh.edu Ninguna parte de este libro puede ser reproducida por ning&n proceso$ mec'nico$ fotogr'fico o electrnico o en la forma de registro fonogr'fico ni puede ser almacenado en un sistema de recuperacin$ transmitido o de otra parte copiado para uso p&blico o pri(ado$ sin el permiso del editor
Editorial 6ni4ersidad del Cauca
istribuido (or los Autores
A nuestras )i*as +ngela Patricia , Daniela !alentina$
Por su apo,o paciente en estos tiempos difciles de mane*ar P.E.V.V. & P.A.M.2.
A mi adorada -amilia
E. R.
Prlogo
la ense;anza de la biologa. Mu' (ocos bilogos (odran estar e<entos del entendi#iento de la biologa #olecular co#o 3erra#ienta (ara estudiar ' entender la clula 4i4a ' los organis#os. Esto 3a sido (osible gracias a la tecnologa del A !" Reco#binante. En e$ecto, este (e9ue;o libro se 3a escrito con el (ro(sito de di4ulgar as(ectos tericos b%sicos ' e<(eri#entales re$erentes a la #ani(ulacin de genes in vitro. 5a construccin de bibliotecas de A !"Reco#binante o genotecas es un #todo (r%ctico ' general desarrollado (or Paul Berg ' 8erbert Bo'er en /+0,, con el ob=eto de clonar $rag#entos de A !"Reco#binante. esde la regla#entacin de este ti(o de e<(eri#entos ' el desarrollo de los (ri#eros 3os(ederos ' 4ectores >seguros? esta estrategia 3a (er#itido incre#entar de #anera e<(onencial el n)#ero de las secuencias de A ! en las bases de datos. e a3 9ue a (artir de /+00 al (resente, se 3an al#acenado #%s de cuatro #il #illones de (ares de bases de di$erentes es(ecies biolgicas (ara consulta de >toda? la co#unidad cient$ica. Co#o resultado, la construccin de genotecas de las es(ecies #%s >re(resentati4as? de los @ilu# 9ue (ueblan la Bios$era 3a (er#itido dentro del #arco de (ro'ectos o$iciales Ahttp://www.ncbi.nlm.nih.govB ' (ri4ados Ahttp://www.tigr.incB, Ahttp://www.celeragenomics.incB de secuenciacin de geno#as el secuencia#iento de #%s de /.1 geno#as bacterianos A1., " 0.1 M(bB con #%s de C11 bacterias en (rogreso. el #is#o #odo, se 3a realizado el secuencia#iento de los (ri#eros geno#as eucariticos, tales co#o el (ri#er organis#o unicelular Saccharomyces cereviciae A/0 M(bB, el (ri#er organis#o #ulticelular, el ne#atodo Caenorhabditis elegans A++ M(bB, el (ri#er insecto, la rosophila melanogaster A/.0 M(bB ' (ara sor(resa de la co#unidad cient$ica, antes de lo (re4isto, la secuencia co#(leta del geno#a 3u#ano A .111 M(bB ' a la cual se 3an a;adido reciente#ente, la de la rata, el ratn, el (erro ' (r<i#a#ente la de la 4aca, el (ollo ' el c3i#(anc. Estos 3allazgos de#uestran 9ue las tcnicas de A !"Reco#binante aco(ladas a secuenciacin ' co#(utacin 3an (roducido una e<(losin de conoci#iento de los (rocesos $unda#entales de la 4ida org%nica sin (recedentes, generado e#(resas biotecnolgicas ' toda una re4olucin cient$ica ' tecnolgica en la biologa ' la sociedad. Adicional#ente, el descubri#iento de secuencias de A ! esta in$lu'endo la #anera de (racticar la #edicina, las ciencias $orenses, la antro(ologa, el #edio a#biente, la agrono#a, la industria ali#entaria ' el an%lisis co#(utacional, entre otros ca#(os. A ni4el do#stico, Colo#bia se 3a caracterizado (or ser unos de los (ases con #a'or biodi4ersidad del (laneta. 5a cantidad del recurso gentico ' de #icroorganis#os en4ueltos en esta red ecolgica es astron#ica, con un (otencial in#enso (or e<(lorar. esa$ortunada#ente, los (ases en 4as de desarrollo 3an (er#anecido a=enos a este ti(o de tecnologas (or causa de costos, es(ecialidad ' desinters (oltico ' cient$ico, subesti#ando as el e#(leo ' desarrollo 9ue estas tecnologas #oleculares (odran generar. Por otra (arte, este ti(o de in$or#acin se encuentra reducida a te<tos es(ecializados, tesis de grado, (ostgrado ' #anuales de (oca di$usin ' consulta.
En los )lti#os ,1 a;os la biologa #olecular 3a re4olucionado la in4estigacin '
Con todas estas razones, los autores 3e#os considerado 3acer un #odesto a(orte (ara #oti4ar a (ro$esionales ' estudiantes uni4ersitarios interesados, di$undiendo a ni4el introductorio un te<to b%sico de clona=e #olecular. 5os (rotocolos detallados a9u 3an sido (robados satis$actoria#ente en traba=os rutinarios de in4estigacin, traba=os de grado ' (ostgrado ' en cursos (r%cticos de biologa #olecular. Adicional#ente, el (resente te<to (uede ser e#(leado co#o re$erencia o co#(le#ento (ara la docencia 'Do la in4estigacin de 9uienes deseen abordar la construccin de genotecas de #icroorganis#os en 4ectores de clona=e ti(o la#bda. El te<to 3a sido el (roducto de los resultados ' e<(eriencias de los autores a lo largo del e=ercicio (ro$esional ' co#o reco(ilacin del #aterial de una obra #%s e<tensa AMoreno, Vlez ' Burgos, C11.B. En es(ecial, ' al (arecer, co#o resultado de la >(ri#era tesis de grado 9ue se 3izo en biologa #olecular en la 6ni4ersidad !acional de Colo#bia ' cree#os 9ue en el (as ARodrguez ' Moreno, /+-0B, (or lo cual, a (esar del tie#(o, se constitu'e en un docu#ento 3istrico de la ciencia en Colo#biana 9ue no 3a (erdido su 4igencia, (ues #uc3os de estos (rinci(ios ' (rotocolos se siguen usando actual#ente. @inal#ente, tene#os la es(eranza 9ue este es$uerzo de di$usin contribu'a de #anera i#(ortante en el bene$icio de los $uturos estudiosos, constructores ' ad#inistradores de los recursos biolgicos.
Agradecimientos
Euere#os e<(resar nuestros agradeci#ientos a la lingFista -ranci .ellen !"le# ' al Ingeniero /erm'n 0lanos (or las generosas correcciones ' reco#endaciones sugeridas. A Carlos Andr"s Prado ' Diana Milena Mu1o# , Adriana Arteaga (or su colaboracin en la eGaboraciHn de algunos gra$icos en este te<to . @inal#ente, 9uere#os brindar un 3o#ena=e (stu#o al r. 2scar 2ro#co Adel Instituto de Cancerologa, seccin de In#unologa, Bogot%, . C.B 9uien nos sugiri 3ace alg)n tie#(o la (ublicacin de este docu#ento co#o #anual ' testi#onio. Igual#ente agradece#os a las (ersonas re(resentadas en =e$es, (ro$esores, colegas, alu#nos 'Do (acientes 9uienes en su #o#ento tu4ieron 9ue 4er con el e=ercicio de la docencia e in4estigacin de los autores. Por esto da#os ta#bin crdito al Instituto del *eguro *ocial de Bogot%, . C.I al e(arta#ento de Biologa ' a la 6nidad de 7entica 8u#ana de la 6ni4ersidad !acionalI al Instituto de In#unologa del 8os(ital *an Juan de iosI al e(arta#ento de Biologa de la 6ni4ersidad Ja4erianaI al CI EIM, CaliI a CKRPK7E!I al e(arta#ento de Biologa ' Bio9u#ica de la 6ni4ersidad de 8ouston, 2e<as, 6*A ' a CK5CIE!CIA*. *in ellos ' estas instituciones, nuestra e<(eriencia no 3ubiera sido (osible. @inal#ente, la (resente obra 3a sido (re(arada co#o co#(le#ento de un curso intensi4o de biologa #olecular celebrado en la 6ni4ersidad del Cauca, (or lo 9ue ta#bin agradece#os a las directi4as, (ro$esores ' estudiantes de sta institucin (or su generoso a(o'o ' entusias#o #ostrado durante el curso. Igual#ente, al de(arta#ento de edicin e i#(resin 9ue 3izo (osible esta obra. A todos, nuestros agradeci#ientos, Patricia E. Vlez Es(eranza Rodriguez Pedro A. Moreno Ma'o, C11C
Acerca de la 2bra , Normas de Bioseguridad

5a obra esta di4idida en L ca(tulos. En el (ri#ero se da una introduccin acerca de 9ue es la biologa #olecular ' algunos conce(tos b%sicos de A !"Reco#binante, tales co#o la construccin de genotecas, los 4ectores la#bda de a#(lio uso ' los #todos de rastreos de clonos reco#binantes dentro de las genotecas, con el ob=eto de $a#iliarizar al lego con el !"C de esta disci(lina. 5os ca(tulos subsiguientes son cortos ' de utilidad (r%ctica. En el ca(tulo dos, dos genotecas de A ! gen#ico AgA !B, una bacteriana ' otra de eucariote in$erior son introducidas a $in de ilustrar las di4ersas #etodologas e#(leadas en la construccin de genotecas ' en la identi$icacin de secuencias de inters #ediante el uso de 4ectores la#bda en Escherichia coli. El tercer ca(tulo trata sobre la sntesis de oligonucletidos. *i bien estos 'a son co#ercializados (or di4ersas co#(a;as nacionales ' e<tran=eras es i#(ortante conocer los $unda#entos de su sntesis (ara su dise;o ' usos. El ca(tulo cuatro tiene 9ue 4er con la deter#inacin de la calidad de la genoteca. El ca(tulo cinco ilustra la b)s9ueda de clonos de genes o rastreo AscreeningB #ediante 3ibridizacin con sondas de A ! o #ediante in#unoreacti4idad con sondas de anticuer(os. El ca(tulo seis #uestra la e<(resin ' (uri$icacin de las (rotenas reco#binantes clonadas, usando las 4enta=as de los (l%s#idos de e<(resin (B* ' (Mal. @inal#ente, el ane<o trae in$or#acin rele4ante (ara el #ane=o a(ro(iado de conce(tos ' (rotocolos. ado 9ue la biologa #olecular usa ter#inologa anglosa=ona, nosotros 4e#os la necesidad de usar indistinta#ente la (alabra en es(a;ol o en ingls ' las cuales o$rece#os ta#bin en el glosario ' en el ndice. 5as @iguras ' iagra#as son originales (roducto de los resultados obtenidos (or los autores. 5a bibliogra$a es cl%sica A' al #is#o tie#(o actualizada en algunos (untosB la cual es(era#os sir4a de re$erencia (ara los lectores. Por otra (arte, debido a 9ue #uc3os agentes 9ue se #ane=an en un laboratorio de biologa #olecular son t<icos, 4enenosos, carcingenos e in$ecciosos, algunas reco#endaciones es(eciales de bioseguridad deben ser 3ec3as, tales co#o& /B uso de los ele#entos de (roteccin b%sica, co#o son la bata, los guantes, c3alecos de (lo#o, (antallas de (roteccin, ca#(anas de e<traccin, c%#aras de aire de $lu=o la#inar, uso de ga$as de (roteccin ' ta(a bocas seg)n los casos. CB A#inorar el tie#(o de e<(osicin ' #ani(ulacin de agentes 9u#icos ' $sicos (eligrosos Aluz 6.V., reacti4os 4ol%tiles, c%usticos, radioisto(os, etcB. .B Abstenerse de consu#ir ali#entos o bebidas en las %reas de laboratorios. MB is#inuir los riesgos de conta#inacin cuando se #ani(ulen agentes in$ecciosos. ,B 6bicar las $uentes de agua li#(ia, duc3as, $regaderos, e<tinguidores de $uego, etc. LB 5eer las eti9uetas ' el #ane=o de reacti4os noci4os ' conocer el #ane=o de e9ui(os. 0B 6tilizar los contenedores de sustancias radiacti4as, corrosi4as, $la#ables ' abstenerse de $u#ar. -B Acatar las rdenes del (ersonal con e<(eriencia del laboratorio. *i no se sabe, (reguntar es la solucinN +B 6na e<(osicin (re4ia del (ro'ecto o e<(eri#entos $rente a un Co#it o Conse=o de Biotica debe ser e$ectuado (ara discutir los alcances ' consecuencias de la #ani(ulacin de genes ' geno#as (ro(uestos. O /1B seguir las nor#as de bioseguridad internacional (ara laboratorios ' #ani(ulacin gentica A!silomar Con#erence, guidelines #or recombinant ! $ researchB.
Contenido
Prlogo Contenido del libro , normas de bioseguridad Captulo 5 6u" es la biologa molecular7 .itos en la )istoria de la biologa molecular Introduccin al ADN-Recombinante /./. Construccin de una biblioteca de A !"Reco#binante /././. A ! blanco de inters (ara clonar /./.C. Vector de clona=e /./... Endonucleasa de restriccin /./.M. A ! ligasa /./.,. 8os(edero /.C. *iste#as de rastreo e identi$icacin de clonos de A !"Reco#binante dentro de una genoteca /.C./. *ntesis 9u#ica de oligonucletidos o sondas /.C././. *o(orte slido /.C./.C. !ucletidos (rotegidos /.C./... 8ibridizacin de dos 3ebras de %cido nucleicos co#(le#entarias /.C./.M. @actores 9ue a$ectan la 3ibridizacin en los $iltros de nitrocelulosa /.C.C. Rastreo de genes con oligonucletidos sintticos /.C... Princi(ios in#unolgicos /.C.M. Rastreo de genes con antisueros (oliclonales /... Vectores /.../. El bacteri$ago la#bda /...C. Cascada ltica del $ago la#bda interconectada con el circuito (ara 5isogenia /..... *iste#a gentico de gt"/1.......................................................................... /...M. *iste#a gentico de gt"//.......................................................................... /..., Caracteristicas generales del siste#a........................................................... /...L. *iste#a genetico de PAP II....................................................................... /...0 B)s9ueda de genes con anticuer(os............................................................. /...-. @actores 9ue a$ectan la estabilidad de las (rotenas reco#binantes............. /...+. *iste#a gentico lactosa............................................................................... /.../1. Identi$icacin de clonos reco#binantes....................................................... /...//. *iste#a gentico del (l%s#ido Bluescri(t A(B*B.......................................... /.../C. *iste#a gentico del (l%s#ido (Mal............................................................ /.M. Reaccin en cadena de la (oli#erasa APCRB.................................................. Captulo : Construccin de bibliotecas de ADN-Recombinante C./. Pre(aracin del A ! gen#ico................................................................. C.C. Restriccin, ligazn ' e#(a9ueta#iento............................................... C... Culti4o e in$eccin del 3os(edero ' (lateo de la genoteca................... C.M. A#(li$icacin ' titulacin ' al#acena#iento de la biblioteca gen#ica... Captulo 8 <ntesis de sondas de oligonucletidos ../. E4aluacin de la e$iciencia de aco(le......................................................... ..C. 2rata#iento (ost"sntesis.............................................................................. .... esancla=e ' des(roteccin........................................................................... ..M. Aisla#iento de la sonda #ediante electro$oresis en gel de (oliacrila#ida.. ..,. Puri$icacin (or cro#atogra$a de $ase reser4a............................................. ..L. Radio#arca=e enzi#%tico, #ediacin de la radiacti4idad ' deter#inacin de la acti4idad es(ec$ica....................................................................................... Captulo ; Calidad de la biblioteca e identificacin del fragmento de
8
3 4 55 58 59 /L /0 /0 //+ C1 C1 C/ CC C. CM CM CL CL C0 C0 CC+ .1 ./ ./ .. .. .M .M .0 .+ .+ .+ ;: M. ML M0 M+ 35 ,. ,M ,M ,, ,0 ,-
ADN-Recombinante M./. E<traccin del A ! clonado del $ago............................................................ M.C. Restriccin ' electro$oresis............................................................................. M... 2rans$erencia del A ! digerido al (a(el de nitrocelulosa A*out3ern blottingB............................................................................................ M.M. 8ibridizacin >*out3ern? ' >dot blotting?...................................................... M.,. Autorradiogra$a............................................................................................. Captulo 3 Rastreo de clonos de protenas recombinante mediante el uso de sueros policlonales ,./. Antisuero (oliclonal ' adsorcin con e<tracto de E. coli............................ ,.C. Induccin de antgenos.................................................................................... ,... E<(osicin de los antgenos del #icroorganis#o a los antisueros.................. ,.M. Re4elado.......................................................................................................... Captulo 9 E>presin , purificacin de las protenas recombinantes clonadas L./. *ubclona=e en (l%s#idos (Blue*cri(t............................................................... L.C. Escisin in vivo usando el siste#a E<AssistD*K5R.......................................... L... E<(resin ' (uri$icacin de (rotenas reco#binantes en el 4ector (Mal......... Ane>o? Informacin &til para el mane*o de los protocolos " Algunas (ro(iedades de los %cidos nucleicos............................................................. " Reacti4os ' (re(aracin de soluciones........................................................................ " @r#ulas.................................................................................................................... " Caractersticas de los 4ectores ' ce(as....................................................................... " @ig.s....................................................................................................................... " 7losario...................................................................................................................... Corolario Bibliografa Andice Andice de Diagramas de flu*o iagra#a /. Ru(tura de los bacilos& trata#iento enzi#%tico......................................... iagra#a C. E<traccin ' (uri$icacin del A ! del bacilo........................................... iagra#a .. Restriccin, ligaz%n ' E#(a9ueta#iento del A ! del bacilo................... iagra#a M. Culti4o de las bacterias 3os(ederas E. coli O/1+1, O/1--....................... iagra#a ,. In$eccin del 3os(edero E. coli O/1+1, O/1--......................................... iagra#a L. A#(li$icacin ' titulacin de la genoteca gen#ica.................................. iagra#a 0. *ntesis auto#%tica de las sondas............................................................... iagra#a -. 2rata#iento (ost"sntesis de las sondas..................................................... iagra#a +. 2rata#iento (ost"sntesis de (uri$icacin de las sondas............................. iagra#a /1. Radio#arca=e ' #edicin de la radiacti4idad de las sondas..................... iagra#a //. Aisla#iento de $agos a (artir de la genoteca ' e<traccin de A ! reco#binado....................... ............................................................ iagra#a /C. Restriccin de A ! reco#binado ' trans$erencia ti(o *out3ern............. iagra#a /.. Rastreo del clon dentro de la genoteca con anticuer(os (oliclonales................................................................................................ iagra#a /M. Adsorcin de sueros anti"bacilo................................................................ iagra#a /,. Rastreo del clon dentro de la genoteca. Andice de Bablas 2abla /. Algunas enzi#as de restriccin 2abla C. Princi(ales #arcadores geneticos del bacterio$ago 5a#bda 2abla .. Princi(ales #arcadores del bacterio$ago 5a#bda 72// 2abla M. Princi(ales #arcadores geneticos co#unes a los 3os(ederos E. coli
9= L1 L/ L/ L. LM 93 L, LL+ L+ 45 0/ 0/ 0C 48 0. 0M 0, 00 /1a +C @5 @9 @4
MM M, ML M0 MM+ ,. ,M ,0 ,L1 L. LL L+ 0/
0+ -1 -/
O/1-- ' O/1+1 2abla ,. Princi(ales #arcadores geneticos del 3os(edero E. coli O/1-2abla L. Princi(ales #arcadores geneticos del 3os(edero E. coli O/1+1 Andice de -iguras @ig. /. 2i(os de genotecas @ig. C. Reacciones de la sntesis 9u#ica de sondas de oligonucleotidos @ig. .. Proteccin de nucleotidos #ediante un enlace ti(o eter @ig.M. Bases A7C son (rotegidas (or acilacin @ig.,. 7ru(os (rtectores de gru(os $os$atos @ig.L. Renaturacion de dos 3ebras de %cidos nucleicos @ig.0. 8ibridizacin en $ase solida de acidos nucleicos @ig.-. Ma(a gentico del $ago la#da sil4estre @ig.+. Estilos de 4ida del $ago la#bda @ig./1. Cascada ltica interconectada con el circuito (ara la lisogenia @ig.//. Ma(as de restriccin con 8indi de 5a#bda gt// @ig./C. Ma(a gen#ico de E. coli @ig. /.. El o(ern 5ac @ig./M. Regin controladora del o(ern 5ac @ig./,. Regulacin de la sntesis (roteica del o(eron 5ac @ig./L. Identi$icacin de reco#binantes en 5a#bda ct// @ig./0. *iste#a gentico del (las#ido Bluescri(t @ig./-. *iste#a gentico del (las#ido (Mal @ig./+. Variaciones de las te#(eraturas a lo largo de una PCR est%ndar @ig.C1. @or#a es9ue#atizada de una coleccin de $ago 5a#bda @ig.C/. Ciclo de aco(le de un nucleotido a una sntesis auto#atica de una sonda @ig.CC. 2rata#iento de (ost"sintesis de la sonda @ig.C.. E4aluacin de la calidad de la libreria @ig.CM. Bus9ueda de genes con antisueros (oliclonales @ig.C,. &tuberculosis te;ido con Piel3"!eelsen 4isto a #icrosco(io o(tico @ig.CL. 2e=ido (ul#onar a$ectado (or tuberculosis @ig.C0. Electro$oresis en gel de agarosa /Q @ig.C-. Electro$oresis del &tuberculosis con AR! digerido con enzi#as de restriccin @ig.C+. 5ibrera culti4ada en (resencia de IP27 ' :"7A5 @ig..1. 2itulo de M.1</1/1 u$(D#5 de la librera a#(li$icada @ig../. Aisla#iento de las ondas sintetizadas (or electro$oresis en (oliacrila#ida"urea @ig..C. Autorradiogra$ia de geles de (oliacrila#ida"urea 9ue #uestra los oligonucleotidos #arcados @ig....7radiente en CsCl @ig..M. An%lisis co#(arati4o entre A ! geno#ico ' A !r cortados con enzi#as de restriccin @ig..,. Autorradiogra$ias de A ! de 4ectores @ig..L. An%lisis de electro$oresis en agarosa al /Q @ig..0. Muestra del clon M1R (uro de &. tuberculosis
-/ -C -C
/L CC C. C. CM C, C, CC+ ./ .C .C ., ., .L ..+ .+ M1 M. ,C ,L LC LL -. -. -M -M -, -L -0 --+ -+ +1 +/ +/
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Captulo 5
CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC D6u" es la Biologa Molecular7
5a Biologa Molecular ABMB es la reduccin a ni4el #olecular de las estructuras ' (rocesos 9ue caracterizan la 4ida org%nica. Esta ciencia surge de la a(licacin de una serie de #todos interdisci(linarios enca#inados a de$inir lo 4i4iente. Para (ro(sitos (edaggicos (ode#os agru(ar dic3os #todos en #todos estructurales, #todos in$or#acionales ' #todos co#(utacionales. 5os (ri#eros se 4alen de la cristalogra$a, la resonancia nuclear #agntica AR!MB, la #icrosco(a electrnica AMICEB ' tunnel AMIC26B, entre otros. 5os segundos usan #todos deri4ados de la gentica ' la bio9u#ica ' cu'os resultados se des(renden de geles ' reacciones. Estos #todos dan $unda#ento a las tecnologas del A !"reco#binante. 5os #todos co#(utacionales son una consecuencia de los dos (ri#eros. Estos #todos i#(lican (or una (arte analizar bases de datos, dise;ar algorit#os ' (rogra#as con el (ro(sito de desci$rar las (ro(iedades sub'acentes 9ue las secuencias de A ! al#acenan ' (or otra, el dise;o de biointegrados con #)lti(les (ro(sitos. Biologa Molecular M"todos estructurales Cristalogra$a R!M MICE, MIC26 M"todos informacionales M"todos computacionales AIngeniera gentica, A !" Bases de datos Reco#binante ' PCRB Progra#as Algorit#os Biointegrados Estrategias -amilia /en Protena A7eno#aB AProteo#aB
El clona*e ocupa un lugar central /en Protena AClulaB /en AClulaB
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Adicional a esto, tres estrategias #etodolgicas (ueden ser (laneadas a $in de atacar los (roble#as biolgicos a ni4el #olecular& /B de la (rotena al genI CB del gen a la (rotena ' .B de la $a#ilia al gen. En cual9uier caso, el clona=e de %cidos nucleicos ocu(a un lugar central (ara (ro4eer #aterial (uro ' es(ec$ico (ara #)lti(les (ro(sitos. 5a e<(eri#entacin co#binada de estos #todos esta redundando en el estudio de estructuras ' $unciones de genes, (rotenas, geno#as ' (roteo#as. e$iniendo con estos los (rocesos $unda#entales 9ue caracterizan la clula 4i4a, co#o son el con=unto de reacciones del #etabolis#o celular, el ciclo celular, el creci#iento ' la di$erenciacin celular, el #o4i#iento ' la co#unicacin celular, el en4e=eci#iento ' la #uerte celular, entre otros. 2odos estos (rocesos se encuentran enraizados en el n)cleo central del $lu=o de la in$or#acin gentica intracelular o dog#a central de la BM, dados (or la re(licacin del A !, la re(aracin, la reco#binacin, la transcri(cin, la traduccin, la regulacin gnica, el trans(orte intracelular, entre otras (ro(iedades de los %cidos nucleicos. Igual#ente, los #todos de la BM 3an generado (oderosas biotecnologas o 3erra#ientas #oleculares las cuales est%n contribu'endo a la in4estigacin de di$erentes disci(linas cu'os ob=etos de estudio tienen 9ue 4er con lo biolgico. En un sentido estricto, la BM es una subdisci(lina de la biologa. Por ello, nosotros no (ode#os es(erar entender la estructura ' la $uncin de los genes si nosotros no esta#os (re(arados (ara entender la biologa ' la ecologa de los organis#os en los cuales esos genes ' organis#os se e<(resan. En el corazn de la BM se encuentra la Ingeniera 7entica, la cual (er#ite la #ani(ulacin de genes de (rocesos co#(le=os de la clula 4i4a. As, el entendi#iento de la estructura, $uncin ' regulacin de los genes ' sus (roductos es esencial (ara una a(reciacin de los siste#as biolgicos, lo 9ue i#(lica el conoci#iento de la organizacin de los %cidos nucleicos de los organis#os. Para analizar la estructura gentica ' los e4entos en sta situacin co#(le=a, se necesita de la ca(acidad (ara aislar ' estudiar un gru(o de genes o un si#(le gen en una $or#a (ura. 5a Ingeniera 7entica (er#ite 3acer esto, a tra4s de una #ani(ulacin deliberada de genes dentro o entre es(ecies, 'a sea con (ro(sitos de an%lisis gentico, #e=ora#iento de ce(as, re(aracin de genes de$ectuosos, entre otras. 5as 3erra#ientas 9ue utiliza la ingeniera gentica son la tecnologa del A !"Reco#binante ' la Reaccin en Cadena de la Poli#erasa Ao PCR (or sus siglas en InglsB. Con estas es (osible e$ectuar el reordena#iento in vitro de #aterial gentico ' la a#(li$icacin es(ec$ica de $rag#entos de A ! (or #ani(ulacin enzi#%tica. Con estas 3erra#ientas la cacera de genes cient$ica ' econ#ica#ente i#(ortantes se 3a con4ertido en el (rinci(al ob=eti4o de las ciencias biolgicas. As, la biologa 3a sido trans$or#ada (or la ca(acidad de re(licar ' e<(resar genes in vitro. 5a biologa del desarrollo busca (ri#ero un gen (ara es(eci$icar una $or#a en el e#brin. 5a biologa celular busca un gen 9ue es(eci$i9ue un ele#ento estructural. 5a #edicina busca genes (ara (roducir (rotenas del cuer(o o trazar las causas de las en$er#edades. 5as cuestiones e4oluti4as, desde el origen de la 4ida 3asta el origen de las es(ecies son "contro4ersial#ente" todas trazadas (or (atrones de #olculas de A !. 5a ecologa caracteriza las (oblaciones naturales (or a#(li$icacin de A !& los 3%bitats sociales de los ani#ales ' los (atrones de #igraciones de las (oblaciones 3u#anas se conducen sobre (atrones de A !. 5as cuestiones legales de 4ida o #uerte (ueden abordarse sobre (atrones de restriccin de A ! o >#ingerprinting? A7ilbert, S. /++/B. O a3ora, el (ro'ecto geno#a 3a co#enzado a desci$rar las secuencias de A ! co#(letas ' listar cada uno de los genes 9ue caracterizan todas las es(ecies #odelo 9ue (ueblan la tierra, incluida la nuestra.
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Co#o consecuencia de todo esto, alrededor de los genes se #ue4e una (oderosa biotecnologa cu'os bene$icios se est%n a(licando a todos los ca#(os de la salud, industrial, agrcola, energtico, ecolgico, analtico ' social. *in lugar a dudas, en Colo#bia e<isten #uc3as necesidades las cuales esta #oderna biotecnologa (er#itira buscar soluciones a (roble#as do#sticos ' uni4ersales. *eg)n Salter 7ilbert la BM 3a contribuido a resol4er tres grandes interrogantes& /B resol4i co#o la in$or#acin 3ereditaria es trans#ite de generacin en generacinI CB co#o dic3a in$or#acin es traducida a estructuras (roteicas Aobreros del #etabolis#oB ' (or consiguiente, a la de$inicin b%sica ' es(ecializada de las clulasI ' .B 9ue todos los organis#os co#(arti#os el #is#o ti(o de in$or#acin ' 9ue todos (ro4eni#os (or >e4olucin? Alas co#illas son nuestrasB de las secuencias de A ! AVer !otaB. Ktro reciente 3ec3o de trascendencia uni4ersal 3a sido el dado (or el consorcio Celera 'enomics liderado (or Craig Venter. Ellos lograron secuenciar (or co#(leto el geno#a 3u#ano. *eg)n Ja#es Satson se re9uerir%n (or lo #enos /111 a;os #%s (ara entender todos los .111 #illones de (ares de bases 9ue constitu'en el (atri#onio gentico 3u#ano. Algunos cient$icos o(inan 9ue durante ste #ilenio se es(era 9ue los bilogos #oleculares desci$ren (or 9ue so#os co#o so#os, derrote#os las en$er#edades ' las taras genticas 9ue nos a$ligen ' llegue#os a ser #enos seniles. TTTTTT
!ota& 5os e4olucionistas suelen a$ir#ar 9ue 9uien no entiende la teora de la e4olucin es (or 9ue no tiene la $unda#entacin #ate#%tica ' (oblacional AMainard"*#it3, /+-+B (ara digerirla. 8abiendo considerado este 3ec3o los autores ta#bin 3an obser4ado 9ue algunos e4olucionistas son conscientes de las li#itaciones e inconsistencias internas en la a(licacin del an%lisis #ate#%tico a los (rocesos de seleccin natural ' #utacin de las es(ecies. Igual#ente, a ni4el #olecular e<iste una gran contro4ersia con la teora del relo= #olecular, dada la di$icultad en reconciliar los ca#bios en los nucletidos con el tie#(o ' las e4idencias contradictorias con los registros (aleontolgicos. @inal#ente, a ni4el del origen de la 4ida 3a' #%s es(eculacin 9ue res(uestas $inales. Para$raseando a elbrFcG (odra#os decir& U'a no leer ning)n artculo sobre la e4olucin (rebitica 3asta 9ue alguien se (resente con una receta 9ue diga& 3aga esto ' a9uello, ' en tres #eses 4er% cosas arrastr%ndose allU A5uria, /+-LB. Ver e(logo.
.itos en la )istoria de la biologa molecular 5a era de la BM naci con la 4isin del $sico ErVin *c3rWdinger A5eVin, C111B 9uien en su $a#oso librito >V3at is li$eX?, (redi=o las (ro(iedades es(eradas (ara el gen A*3rWdinger, /+MMB. *u obra in$lu' sobre algunos $sicos de la (oca, co#o SilGins, CricG, *taudinger, 5uria a incursionar en la biologa, ' sobre otros, co#o el bio9u#ico C3arga$s ' el bilogo Satson 3a $ocalizar sus estudios sobre la estructura del cro#oso#a ' la 3erencia. Ellos re#e#oraron el i#(acto 9ue dic3a obra caus en sus 4idas A7ribbin, /+-LB. e a3 9ue la BM surge de la colaboracin entre bilogos ' $sicos A8a'nes & 8anaValt, /+L-I Satson, /+L-I 5uria, /+-LI Moreno & Vlez, C111B. Oa 9ue los grandes logros de la ciencia nacen en a#bientes acad#icos, cient$icos ' (ersonales alta#ente co#(etiti4os, una a(reciacin 3u#ana 4ale tener en cuenta. Al igual 9ue cual9uier otra acti4idad 3u#ana, la BM esta atada a los a4atares del (oder, la ps()uis ' los sue;os (ersonales de 9uienes traba=an en ciencias. Al recorrer la 3istoria de esta $ascinante disci(lina es $%cil encontrar todo ti(o de (ersonalidades, desde a9uellos 9ue encarnan la #odestia ' sabidura de los 3o#bres de ciencia, cada 4ez #%s escasa, 3asta a9uellos 9uienes rinden tributo al gla#our, la arrogancia ' la a#bicin (ersonal co#o )nicos #edios (ara #aterializar sus sue;os de $a#a. A#bos estilos (roducen resultados ' la 3istoria se encarga de =uzgar el i#(acto uni4ersal de sus descubri#ientos. 5a siguiente cronologa 3istrica (retende #oti4ar a los estudiosos a in4estigar 9ue 3a' detr%s de cada uno de estos (ersona=es ' a #edir el real i#(acto de sus 3allazgos sobre el conoci#iento ' la sociedad. *on ellos 9uienes con sus contribuciones 3an
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$unda#entado gran (arte de la biologa #oderna ' 3an (er#itido desci$rar los (rinci(ios ' a(licaciones 9ue sustentan la 4ida org%nica.
/-L,. 7regorio Mendel descubre la naturaleza estadstica de la trans#isin de los caracteres de la 3erencia o genes. Nace la gen"tica ' Mendel es considerado el (adre de sta. /-L,. Misc3er descubre la nuclena ' (osterior#ente esta es caracterizada (or Alt#an co#o %cido nucleico. /+C1. 23o#as Morgan establece los (ri#eros #a(as de liga#iento cro#os#ico #ediante uso de $or#as alternas o alelos (roducidos en el laboratorio (or ra'os :. /+M1. elbrFcG, 5uria ' 8ers3e' crean el gru(o del $ago (ara estudiar las (ro(iedades de >la #olcula de la 3erencia?. /+MM. ErVin *3rWdinger (ublica >V3at is li$eX?. Kbra 9ue in$lu' sobre #uc3os $sicos at#icos a e$ectuar alianzas con bilogos ' 9u#icos conte#(or%neos (ara estudiar la naturaleza del gen. Nace la era de la biologa molecular. /+MM. A4er', McCleod ' M. Cart3' descubren el >(rinci(io trans$or#ante? del (neu#ococo. /+,1. ErVin C3arga$$ deter#ina las (ro(orciones de las bases nitrogenadas en el A !. /+,1. 5inus Pauling deduce la estructura del enlace (e(tdico ' la 3lice de las (rotenas. /+,1. 7eorge Beadle, EdVard 2atu# ' Jos3ua 5ederberg descubrieron 9ue los genes act)an regulando e4entos 9u#icos de$inidos ' 9ue la clula bacteriana e<(eri#enta reordena#ientos ' trans$erencia de la in$or#acin gentica a otras clulas. /+,.. Satson, CricG, SilGins ' Rosalind descubren la estructura #olecular del A !. /+,L. @rancis CricG (ro(one el dog#a central de la biologa #olecular. /+,-. Perutz ' RendreV desci$ran la estructura tridi#ensional de la lisozi#a ' la #ioglobina. /+,-. Art3ur Rornberg asla la A ! (oli#erasa I, la (ri#era enzi#a 9ue 3ace A ! en el tubo de ensa'o. /+L1. escubri#iento del R!A #ensa=ero ' de#ostracin 9ue ste lle4a la in$or#acin 9ue ordena los a#ino%cidos en la (rotena. /+L,. Jac9ues Monod, Andr 5Vo$$ ' @ranYois Jacob $ueron galardonados con el (re#io !obel (or sus descubri#ientos acerca del control gentico de la sntesis de 4irus ' enzi#as. /+LL. !ire#berg ' R3orana deter#inan el cdigo gentico co#(leto. /+LL. 8olle' desci$ra la estructura tridi#ensional del tR!A. /+01. Aldber, !atans ' *#it3 descubren las (ri#eras enzi#as de restriccin, enzi#as 9ue cortan A ! en sitios es(ec$icos. /+0C. 5as (ri#eras #olculas de A !"reco#binantes son generadas #ediante la enzi#a A ! ligasa. /+0.. Paul Berg ' 8erbert Bo'er to#an $rag#entos de A ! e<tra;o los cuales son insertados en un (l%s#ido de A ! (ara crear los (ri#eros (l%s#idos 9ui#ricos. *e encontr 9ue estos (ueden ser $uncional#ente reinsertados en la bacteria E. coli. El (otencial a3ora e<iste (ara clonar en las bacterias cual9uier gen. Nace la ingeniera gen"tica. /+0,. Renato ulbecco, 8oVard 2e#in ' a4id Balti#ore (onen en re4ersa el dog#a central de la biologa #olecular #ediante la transcri(tasa re4ersa. /+00. *anger, Ma<a# ' 7ilbert desarrollan los #todos de secuenciacin del A !.
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/+00. Creacin de las (ri#eras #olculas de A ! reco#binante conteniendo A ! de #a#$ero ' descubri#iento de los genes interru#(idos (or P3illi(s and Ric3ards. /+0-. 5a so#atostatina llega a ser la (ri#era 3or#ona 3u#ana clonada (roducida #ediante el A !"Reco#binante. /+-M. Csar Milstein es galardonado con el (re#io !obel (or desarrollar un #todo (ara la (roduccin de grandes cantidades de anticuer(os #onoclonales. /+-L. Rar' Mullis desarrolla la reaccin en cadena de la (oli#erasa o PCR. cada de los -1. Pri#eras (lantas ' ani#ales transgnicos dise;ados ' (atentados e inicios de la tera(ia gnica. /++1. Arranca o$icial#ente el (ro'ecto geno#a. /++,. Pri#er geno#a bacteriano secuenciado. /+++. *ecuencia#iento del (ri#er organis#o #ulticelular eucaritico Ael C. elegansB. C111. Craig Venter ' su co#(a;a (ri4ada Celera 'enomics secuencian (or co#(leto el geno#a 3u#ano, adelant%ndose as (or tres a;os al (ro'ecto geno#a o$icial. !ue4as a4enidas (arecen dirigir los an%lisis de genes ' geno#as 3acia la geo#etra $ractal AMoreno et al. C111B, las #ate#%ticas, la $sica (tica ' cu%ntica, la 9u#ica co#binatoria ' el #ane=o co#(utacional 9ue encri(tan las secuencias o #ensa=es unidi#ensionales de genes ' geno#as. 5a gran co#(le=idad de los di$erentes ni4eles de resolucin en los cuales se autocontiene lo 4i4iente segura#ente re9uerir% de un en$o9ue #%s 3olstico 9ue de cuenta de las estructuras tridi#ensionales co#(le=as 9ue $or#an los organis#os 4i4os, tales co#o (rotenas, clulas ' organis#os #ulticelulares. e alcanzar esta #eta, se cu#(lira otra de las #%<i#as (redic3as (or *c3rWdinger 9uien se;al& >...las estructuras cromos%micas son al mismo tiempo los instrumentos )ue realizan el desarrollo )ue ellos mismos pronostican. Es decir, ....llevan una clave elaborada Ao encri(tadaB )ue contiene todo el desarrollo #uturo del organismo* A*c3rWdinger, /+MMB. Para un trans$ondo #%s co#(leto de los (ioneros, (rinci(ios ' tecnologas de la biologa #olecular sugeri#os otra obra de los autores lla#ada& Biologa Molecular, 7en#ica ' Post"7en#ica, C11C AMoreno et al., C11CB.
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TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT Introduccin al ADN-Recombinante

5 5 Construccin de una biblioteca de ADN-Recombinante En el (roceso de clona=e las #olculas de A ! blanco, ob=eto de estudio, se ligan a A ! autno#os co#o (l%s#idos o 4irus ' (osterior#ente se introducen dentro de clulas 3os(ederas. es(us de su re(licacin, las #olculas 3bridas son seleccionadas ' a#(li$icadas (ara (roducir su$iciente cantidad de un seg#ento deter#inado A,.B. Estos $rag#entos de A ! es(ec$icos (ueden ser caracterizados (or tcnicas tales co#o #a(eo de restriccin, induccin de e<(resin ' secuencia de nucletidos entre otros. 6n e<(eri#ento t(ico de clona=e re9uiere de dos (rocedi#ientos co#binados& la construccin de una genoteca de A ! reco#binante ' un siste#a de deteccin de clonos 9ue lle4en secuencias de un gen es(eci$ico o $rag#entos de este AMC, M., ML, ,.B. 6na genoteca es el con=unto de $rag#entos de A ! de un organis#o distribuidos en el 4ector, cu'a unin re(resenta el geno#a total del organis#o. En la (r%ctica, una genoteca contiene algunos o todos los genes de una es(ecie dada. Esta genoteca esta constituidas de una (oblacin de clonos bacteriales o de $agos, cada uno teniendo (e9ue;os seg#entos de in$or#acin gentica a (artir de la es(ecie en cuestin AVer 2abla (agina siguienteB 6na 4ez la genoteca 3a sido construida el (r<i#o (aso "' usual#ente el reto #%s grande" es rastrearla AscreeningB a $in de seleccionar el clon o los clonos los cuales contienen el gen de inters A4er ca(tulo ,B. E<isten dos (rinci(ales ti(os de genotecas, a (artir de las cuales los genes (ueden ser aislados& /B las gen#icas, las cuales se constru'en a (artir del A ! gen#ico del organis#o ' CB las de A ! co#(le#entario o A !c, construidas a (artir de AR!#, @ig. /.
2e=ido AR!# A !c A !db #etilado A ! clonable Restriccin A.B A ! ligado al 4ector AMB Introduccin del A ! blanco o 4ector ligado en E. coli Ae#(a9ueta#iento in vitro o trans$or#acinB A,B 2tulo ' caracterizacin de la genoteca Rastreo (ara el clon deseado A#(li$icacin (ara al#acena=e (or largo tr#ino A/B A ! A ! co#(leta o (arcial#ente digerido *e(aracin (or ta#a;o Vectores ACB Aeleccin de un 4ectorB
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-ig 5 Pasos implicados en la construccin de una genoteca de gADN o ADNc . 5a construccin de una genoteca i#(lica la con=ugacin de cinco as(ectos i#(ortantes& /B un A ! blanco o clonarI CB un 4ector de clona=eI .B endonucleasas de restriccinI MB una enzi#a A !"ligasa ' ,B un 3os(edero (rocariote o eucariote, donde se (ro(ague el 4ector A,.B. Para las es(ecies eucariotas es usual co#enzar con una genoteca de A !c. Esta es 3ec3a a (artir del aisla#iento del AR!# a (artir de clulas 9ue e<(resan el AlosB genAesB de inters, con4irtiendo el AR!# a A !c ' clonando el A !c. 6na 4enta=a i#(ortante de este en$o9ue es 9ue esta reduce el n)#ero de clonos los cuales se necesitan ser rastreados 'a 9ue la genoteca slo contiene A !cs corres(ondientes a los genes 9ue est%n siendo e<(resados ' lo cual (uede constituir el /Q o #enos del total de in$or#acin gentica (resente en la clula. 5 5 5 ADN blanco de inter"s para clonar Puede ser el de cual9uier organis#o, (or e=e#(lo el de &. tuberculosis. Este A ! es aislado del resto de co#(onentes de la clula (or di$erentes #todos, de(endiendo de las caractersticas intrnsecas del organis#o. Estos #todos b%sica#ente se agru(an en& #todos de ru(tura #ec%nica, #todos enzi#%ticos o co#binados. /. Ro#(i#iento #ec%nico de la clula. Puede 3acerse utilizando una c%#ara de (resin celular, en la cual se colocan las clulas en sus(ensin ' se congelan, luego se a(lica (resin (ara estallar las clulas. C. *onicado, #ediante el cual las clulas se so#eten a ultrasonido, (ro4ocando la ru(tura celular. .. Con (erlas de 4idrio. 5as clulas en sus(ensin se 3o#ogenizan ocasionando su ro#(i#iento total #ediante ca#bios bruscos de congela#iento ' descongela#iento. !o obstante, estos #todos son inadecuados (ara el aisla#iento de %cidos nucleicos, (ues causan $racturas indeseables en el A !. M. Mtodo enzi#%tico, el cual e$ect)a la lisis celular #ediante enzi#as 9ue atacan la (ared celular.
2rganismo Bama1o pb Mpb Bipo de ADN ADNmc ADNbl ADNbc ADNbl " " " " " " " No de cromosomas E)aploideF 1 1 1 17 4 21 20&1000 23 1 1 ,
FX174 5X103 0.005 Fago l 5X105 0.05 E. coli 4X106 4 Levadura 2X107 20 Mosca 3X107 30 a!"# 2X10$ 200 %la#!a 1X1077&10 100&10000 'uma#o 3X10( 3000 cro.1 2.6X10$ 263 cro.) 5X107 5( *aur+o 1X1010 10000
2abla /. 2a#a;o del geno#a de di$erentes organis#os. Co#o re$erencia se dan las di#ensiones del cro#oso#a / 3u#ano, el #%s grande ' el cro#oso#a O, el #%s (e9ue;o. #& #onocatenario, b&bicatenario, l& lineal, c& circular.
5 5 : !ector de clona*e Co#o su no#bre lo indica, es el 4e3culo 9ue trans(orta el A ! blanco de inters (ara clonar. El 4ector es un A ! 9ue se re(lica autno#a#ente. 5a eleccin del 4ector adecuado de(ende de los ob=eti4os trazadosI 4arias consideraciones in$lu'en en esta eleccin& las enzi#as de restriccin 9ue 3an de e#(learse, el ta#a;o de los $rag#entos de A ! blanco a ser insertados AM1B, ' el #todo de seleccin de genes a usar. Co#ercial#ente se dis(one de una coleccin de 4ectores bien caracterizados A+B, los
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cuales, en su gran #a'ora, tienen un #arcador seleccionable 9ue (er#ite distinguir las clulas trans$or#adas, es decir, (er#ite di$erenciar los $agos reco#binantesI $inal#ente, el 3os(edero debe estar bien caracterizado ' ser co#(atible con el 4ector A/-, ,.B. E<isten 4ectores (ara clulas (rocariotas ' 4ectores (ara clulas eucariotas. Entre los (ri#eros tene#os 4ectores (ara E. coli, los #%s nu#erosos, 4ectores (ara bacterias gra#(ositi4as ' bacterias gra#negati4as, 4ectores (ara stre(to#'ces ' le4aduras ' (ara #'cobacterias A./B, entre otros. @inal#ente, 3a' 4ectores (ara clulas 4egetales ' (ara clulas ani#ales. entro de cada uno de estos gru(os 3a' 4ectores de clona=e (ara (ro(sitos generales ' (ara (ro(sitos es(ecializados. 5os 4ectores #as utilizados (ertenecen al gru(o de los (l%s#idos, los bacteri$agos M"/. ' la#bda A+B. entro de los bacteri$agos la#bda e<isten 4ectores de insercin ' de substitucin. 5os 4ectores de insercin son a9uellos 9ue tienen un sitio )nico de restriccin en el cual el A ! blanco es insertado, (or e=e#(lo, el bacteri$ago la#bda gt"//. A9uellos 4ectores en los 9ue se ree#(laza (arte de #aterial gentico del 4ector no $unda#ental (or (arte del A ! blanco se conocen co#o 4ectores de substitucin, (or e=e#(lo, el bacteri$ago EMB5".. e otra (arte, los 4ectores de e<(resin lle4an ele#entos de control 9ue $a4orecen la e<(resin del %cido nucleico 3eterlogo insertado, (or e=e#(lo, el $ago la#bda gt"// A/L, M1B A4er nu#eral /...B. 5 5 8 Endonucleasa de restriccin Estas son enzi#as aisladas (rinci(al#ente de (rocariotes, 9ue reconocen secuencias es(ec$icas dentro del A ! de doble 3lice (ara cortar 'Do #odi$icar la #olcula. Estas (ueden clasi$icarse dentro de tres gru(os& las enzi#as ti(o I, ti(o II ' ti(o III A2abla CB. 5as enzi#as ti(o I ' ti(o III (roducen una #odi$icacin A#etilacinB ' al tie#(o tienen acti4idad de restriccin Acli4a=eB de(endiente del A2P. A#bos ti(os de enzi#as reconocen secuencias es(eci$icas no #etiladas en el A ! sustratoI sin e#bargo, las enzi#as ti(o I cli4an aleatoria#ente, #ientras 9ue las enzi#as ti(o III cortan el A ! en sitios es(ec$icos. El siste#a de #odi$icacin restriccin ti(o II esta constituido (or endonucleasas de restriccin ' #etilasas de #odi$icacin se(aradas. *e 3an aislado #%s de C11 endonucleasas de restriccin, #uc3as de las cuales son 4aliosas en el clona=e #olecular. Estas enzi#as cortan el A ! dentro o cerca de sus secuencias (articulares de reconoci#iento, las cuales t(ica#ente son de M a L nucletidos de longitudI estas secuencias son (alindr#icas ' (oseen un e=e doble de si#etra AC1, -/B. Ver 2abla (%gina siguiente. Algunas de estas enzi#as, co#o Eco +,, no cli4an e<acta#ente en el e=e de si#etra, sino en (osiciones se(aradas de M nucletidos en las dos bandas de A !, generando $rag#entos de A ! con e<tre#os ,Z salientes ' co3esi4os.
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Cual9uiera de estos e<tre#os co3esi4os (uede $or#ar a(area#iento de bases con cual9uier otro $rag#ento de A ! 9ue tenga e<tre#os co3esi4os co#(le#entarios, origin%ndose as una #olcula de A !"reco#binante. 2a#bin 3a' enzi#as 9ue generan $rag#entos co3esi4os .Z salientes, ' enzi#as 9ue cortan a#bas cadenas de A ! en el #is#o sitio generando e<tre#os ro#os AM.B. Babla : Caractersticas de las endonucleasas de restriccin
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& Bipo I Bipo II Bipo III &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& Ac!+v+dad de .#/+ma Me!+lasa 0 e#/+mas se1ara& res!r+cc+"# 0 mul!+2u#c+o#al e#do#ucleasa das co# u#a ac& mod+2+cac+"# s+m1le se1arada !+v+dad e# com3# .s!ruc!ura 1ro!e+ca de la . . e4uer+m+e#!os 1ara la res!r+cc+"# *ecue#c+a de los s+!+os es1ec>2+cos del ?os1edero *+!+os de cl+va@e 3 subu#+dades d+2ere#!es A5%6 Mg276 *&ade#os+lMe! *+m1le 2 subu#+dades d+2ere#!es A5%6 Mg726 *&ade#os+lme!+o& #+#a .co %19 A:A;; .co %159 ;A:;A:
Mg72
.co 89 5:AN$5:;5 <sualme#!e s+me& .co =9 AA;N6:5:; !r>a ro!ac+o#al
%os+bleme#!e alea!or+os6 al me#os 1000 1b desde el s+!+o es1ec>2+co No *+ *+!+o es1ec>2+co
.# o cerca al s+!+o es1ec>2+co
24&26 1b ?ac+a el eA!remo 3B del s+!+o es1e& c>2+co *+ No *+!+o es1ec>2+co
Ac!+vac+"# de la e#/+ma 5ra#slocac+"# del ADN *+!+o de me!+lac+"#
*+ No *+!+o es1ec>2+co
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! _ Cual9uier nucletido. 5 5 ; ADN ligasa 6na 4ez a(areados los sitios co3esi4os Ao e<tre#os ro#osB (resentes en el 4ector con los e<tre#os del A ! blanco, la estabilidad de estas #olculas reco#binantes de(ende de la ca(acidad de sellar co4alente#ente las ru(turas en cada banda o #uescas AnicGsB en el A !. Este (roceso es lle4ado a cabo tanto in vivo co#o in vitro (or las enzi#as de A ! (olinucletido ligasa. Esta enzi#a es un si#(le (oli((tido de L- G a de (eso #olecular, 9ue cataliza la $or#acin de enlaces $os$odiester entre el gru(o 3idro<ilo . ' el $os$ato , de los dos nucletidos ad'acentes de la #uesca, reestablecindose as la continuidad estructural de las bandas de A ! AM1, ,.B. Para lle4ar a cabo la reaccin de ligaz%n se consideran dos (ar%#etros& la relacin entre los brazos del bacteri$ago ' los insertos, ' la concentracin de las dos clases de
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A ! a ligar. Cada brazo del $ago lle4a dos clases de e<tre#os co3esi4os co#o se obser4a en el es9ue#a& uno es el e<tre#o Cos, 9ue es co#(atible sola#ente con la secuencia co#(le#entaria Cos del otro brazoI ' el otro es el e<tre#o Ct generado (or el corte de una endonucleasa de restriccin ' es co#(atible tanto con los e<tre#os del inserto co#o con el otro e<tre#o Ct del 4ector. Cos """""""""" Ct Ct """""""""" Ct Ct """""""""" Cos El sustrato o(ti#o de A ! (ara ser e#(a9uetado en el $ago es la #olcula concata#rica `Abrazo derec3o"inserto"brazo iz9uierdoBna. Para obtener el #a'or n)#ero de estas #olculas, la reaccin de ligaz%n debe contener concentraciones e9ui#oleculares de e<tre#os Ct en cada una de las tres clases de A ! Abrazos iz9uierdos, insertos ' brazos derec3osB. Puesto 9ue cada brazo contiene sola#ente un e<tre#o Ct, #ientras 9ue cada inserto contiene dos, entonces la relacin de #olculas en la reaccin debe ser C&/&C Abrazo iz9uierdo"inserto"brazo derec3oB. 5a concentracin de A ! a clonar debe ser su$iciente#ente alta (ara asegurar la ligaz%n inter#olecular, 9ue conduce a la $or#acin de concat%#eros ' no a la $or#acin de crculos #ono#ricos, los cuales no se e#(acan dentro de las c%(sides 4irales AM1B. 5 5 3 .ospedero 6na 4ez ligadas las #olculas de A !"reco#binante, son introducidas dentro de la clula 3os(edera (or trans$or#acin si son (l%s#idos. *i son $agos, los A !" reco#binantes =unto con las (rotenas de la c%(side ' la cola son autoensa#bladas in vitro co#o (artculas 4irales in$ecciosas, (ara 9ue in'ecten las #olculas de A ! dentro de la clula 3os(edera. 5os 3os(ederos (ueden ser (rocariotes o eucariotesI debe e<istir una co#(atibilidad gentica entre el A ! 4ector ' el A ! del 3os(edero. Por esto, el genoti(o ' el $enoti(o de a#bos deben estar bien de$inidos. Ade#%s de los siste#as de regulacin del gen, dos siste#as (rinci(ales deben conocerse bien& el siste#a de #odi$icacin"restriccin ' el siste#a de reco#binacin AC1, .1B. 2odos los 3os(ederos de E. coli son deri4ados de la ce(a sal4a=e E. coli R"/C, la cual nor#al#ente (roduce enzi#as de restriccin 9ue cli4an el A !. !atural#ente, la E. coli (roduce #etilasas de #odi$icacin 9ue (rotegen su (ro(io A ! del cli4a=e. Por lo tanto, los $agos no #odi$icados 9ue in$ecten E. coli son destruidos. Esto (uede e4itarse (ro(agando los $agos reco#binantes en un 3os(edero de$iciente de restriccin Ar"B. 5as ce(as hsdR" son de$icientes en restriccin (ero no en #odi$icacin Ar", #^B, #ientras 9ue las ce(as hsd*" son de$icientes en a#bas $unciones Ar", #"B. Por otro lado, E. coli R"/C tiene la ca(acidad de e<(eri#entar #%s o #enos reco#binacin 3o#loga e$iciente #ediante un n)#ero de 4as di$erentes. Por lo tanto, deben elegirse 3os(ederos +ec", adecuados (ara a#(li$icar o buscar genes en una genoteca A/LB. 6na 4ez construida la genoteca debe deter#inarse el (orcenta=e de reco#binantes, a#(li$icar ' conocer el ttulo, ' en lo (osible, e4aluar la calidad de la genoteca (ara e$ectuar con #a'or seguridad la b)s9ueda de clonos reco#binantes es(ec$icos. 5 : <istemas de rastreo e identificacin de clonos de ADN-Recombinante dentro de una genoteca E<isten dos estrategias (ara la b)s9ueda in situ de clonos (ortadores de genes es(ec$icos dentro de una genoteca& Con sondas de %cidos nucleicos sintticas o naturales #arcadas con isto(os o enzi#as, 'a sea (or 3ibridizacin o #ediante la PCR. O con anticuer(os (oliclonales 'Do anticuer(os #onoclonales, utilizados co#o sondas, #arcados con isto(os radiacti4os o con enzi#as A01B, entre otros #todos.
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Diagrama de flu*o general para el rastreo de genotecas 7enotecas en (l%s#idos, $agos, cs#idos OACs *e#brado de la genoteca Aconsiderar genoteca base ' ta#a;o de insertoB Rastreo de la genoteca #ediante& /B 3ibridizacin a sondas largas de A ! u oligonucletidos, CB in#unoreacti4idad .B seleccin de 3bridos de AR!# ' traduccin o MB PCRs con iniciadores es(ec$icos ,B Puri$icacin de (lacas o colonias. 5 : 5 <ntesis Gumica de oligonucletidos o sondas 5os dos #todos #%s a#(lia#ente usados (ara sintetizar 9u#ica#ente oligonucletidos son& el #todo $os$ito"triester ' el $os$odiester. El #todo $os$ito" triester usa $s$oro tri4alente #%s reacti4o, tiene una alta e$iciencia de sntesis, del +-Q, cortos (eriodos de tie#(o (or ciclo de aco(le ' dos (asos de reaccin (ara e$ectuar el (uente $os$odiester Aaco(le ' o<idacinB ACL, M0B. El #todo $os$otriester utiliza un solo (aso (ara e$ectuar el (uente $os$odiester Aaco(leB, $s$oro (enta4alente #enos reacti4o, tiene e$iciencias de aco(le del +,Q ' (eriodos de tie#(os largos A/+, CLB. Cada aco(le de un nucletido durante la sntesis de la sonda, seg)n el #todo $os$ito"triester, i#(lica la e=ecucin de un ciclo de cuatro (asos de reaccin A4er @ig. /.MB. DesbloGueo& consiste en re#o4er el gru(o (rotector M2r del )lti#o nucletido aco(lado, con Ac. dicloroactico en dicloro#etano, (ara de=ar libre el gru(o ,[K8. Acople& es la adicin de un nue4o nucletido (rotegido a la cadena creciente #ediante una reaccin de esteri$icacin entre el gru(o .[ $os$ato del nucletido entrante ' el gru(o ,[K8 del nucletido desblo9ueado. Esta reaccin es catalizada (or el tetrazol en acetonitrilo o (iridina. BloGueo de nucletidos no elongados& el so(orte es tratado con una #ezcla de an3drido actico AACC1B, M"di#etila#ino(iridina A MAPB ' C,M,L"colidina AColl.B, en acetonitrilo. Esta reaccin acetila los gru(os ,[K8 del az)car 9ue no 3an reaccionado durante el aco(le. 5a reaccin asegura 9ue sola#ente las cadenas con secuencias correctas (uedan crecer en los (asos siguientes.
2>idacin& el gru(o $os$ito"triester es luego o<idado a un $os$ato"triester #%s estable. 5a o<idacin se e=ecuta (or trata#iento del $os$ito con una #ezcla de 'odo, colidina ' agua en acetonitrilo.
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Para e$ectuar la sntesis 9u#ica de K!* en $ase slida son i#(ortantes el so(orte slido sobre el cual 4a anclada las cadenas de nucletidos 9ue se est%n sintetizando, ' los nucletidos debida#ente (rotegidos (ara e4itar reacciones laterales e ines(ec$icas.
@ig. C. Reacciones de la sntesis 9u#ica de sondas de oligonucletidos (or el #todo $os$ito triester A0, CLB.
5 : 5 5 <oporte slido Es la #atriz donde 4a unido el (ri#er nucletido (or el e<tre#o .[K8 ' a (artir del cual se elonga la sntesis de la cadena del oligonucletido. *e 3an elaborado di$erentes ti(os de so(ortesI sobre ste 4iene unido cual9uiera de los cuatro nucletidos (rotegidos. El so(orte slido (uede ser de slica, (erlas de 4idrio, (l%stico o (a(el de celulosa, ' se caracteriza (or& ser insoluble e inerte en todos los sol4entes ' reacti4os usados durante la sntesis. *er bastante rgido (ara resistir la (resin del sol4ente a(licado. Poseer gran %rea de su(er$icie ' (oros (ara dar acceso r%(ido a reacti4os ' sol4entes. Para #a'or accesibilidad de los sol4entes ' los reacti4os ' e4itar i#(edi#entos estricos durante la reaccin, sobre el so(orte deri4ado con una al9uila#ina, se une el (ri#er nucletido (or el e<tre#o .[ #ediante un gru(o succinato.
* b ] K
!8 D b D b D b D b D b D b !8C D
*& (erlas de (l%stico de /1 # con #acro(oros de M</1c a A-11dB B !

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] K TTTK M2r ]D b * !8 D b D b D b D b D b D b !8 b TT D b D b DbDbD b D ] ] ] K K K K ] 5 : 5 : Nucletidos protegidos El (aso cla4e en la sntesis de A ! es la $or#acin es(ec$ica ' secuencial del enlace $os$ato internucletido. Para lograr esto, gru(os $uncionales co#o los K8 .[ ' ,[, ' gru(os a#ino e<occlicos, deben ser (rotegidos. As, durante la sntesis se tienen dos clases de gru(os (rotegidos& 5os te#(orales, se colocan (ara obtener es(eci$icidad de una reaccin si#(le ' son re#o4idos des(us de sta. 5os (er#anentes, 9ue se 9uedan unidos al oligonucletido durante toda la sntesis ' son re#o4idos al $inal durante el desancla=e de la sonda del so(orte. entro del (ri#er gru(o tene#os& el gru(o 3idro<ilo en la (osicin ,[ del nucletido, se (rotege #ediante un enlace ti(o ter con el catin di#eto<itritil A M2rB, (ara e4itar 9ue los 3idro<ilos del nucletido entrante co#(ita con los 3idro<ilos de la cadena en creci#iento. Fig.3
B N OH C.82
K c K
5os gru(os a#ino (ri#arios e<occlicos de las bases nitrogenadas A,7,C son general#ente (rotegidos (or acilacin. Estos gru(os (rotecti4os son estables en todos los (asos de la reaccin ' los co#)n#ente utilizados son el benzoil (ara A ' C ' el isobutirilo (ara 7.
O
Fig.4 GUANINA
N N N
N NH2
NH
ISOBUTIRIL AMIDA
NH2
NH2 ADENINA N N N N
NH
O C N
BENZOYLAMIDA
CITOCINA
El gru(o $os$ato& la naturaleza del gru(o (rotector de(ende del #todo de aco(le elegido. 5os gru(os (rotectores del gru(o $os$ato son el cloro$enil desarrollado con la 9u#ica del $os$otriester ' con el cianoetil en la 9u#ica del $os$itotriester. Este gru(o (uede ser $%cil#ente re#o4ido (or trata#iento con a#onio concentrado A/+B. A@ig.,B
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@ig.,
B N
OH
O P CN O B CIANO!TIL
O
P
5 : 5 8 .ibridi#acin de dos )ebras de 'cido nucleicos complementarias El A ! es una #olcula de dos cadenas anti(aralelas cu'a 3lice es #antenida (rinci(al#ente #ediante enlaces de 8 entre los (ares A"2 ' 7"C A-/B. Cuando la doble cadena de A ! es so#etida a condiciones e<tre#as de te#(eratura o (8, los (uentes de 8 en la doble 3ebra se ro#(en ' el A ! se se(ara en dos cadenas sencillas, o sea, se desnaturaliza. *i se usa el calor co#o desnaturalizante, la te#(eratura a la cual se se(ara el ,1Q de las cadenas de A ! es conocida co#o -m o te#(eratura de $usin. *i las dos 3ebras son retornadas desde estas condiciones e<tre#as a su estado original Anor#alB, ellas (ueden reasociarse (ara $or#ar la doble 3ebra. Esta reasociacin es(ec$ica se deno#ina renaturalizacin #olecular, la cual (uede tener lugar entre bandas co#(le#entarias de A ! o R!A o entre 3ebras de R!A ' A ! A/.B. 5a (ro(orcin de renaturalizacin de dos 3ebras de %cido nucleico de(ende de la $recuencia de colisiones ' (osterior nucleacin Ainicio de la $or#acin de la doble 3liceB de las regiones co#(le#entariasI as, el grado de renaturalizacin 4a a estar deter#inado (or la naturaleza de la #uestra, ta#a;o de los $rag#entos del A !, ' condiciones de renaturalizacin tales co#o& te#(eratura, $uerza inica, concentracin del A ! ' te#(eratura (er#itida (ara la reasociacin AM,B. A@ig. LB E<isten 4arios #todos (ara detectar co#(le#entariedad de %cidos nucleicosI uno de estos es la in#o4ilizacin de un %cido nucleico en una $ase slida, co#o el (a(el de nitrocelulosa. 5uego el A ! se desnaturaliza ' se (one en contacto con la sonda #arcada, (osterior#ente se detectan las secuencias co#(le#entarias ' el sitio al cual se 3a unido la sonda A/., 01B. Este (rinci(io es su#a#ente )til (ara la biologa #olecular ' con base en ste se 3an desarrollado tcnicas co#o sout3ern blot, nort3ern blot e 3ibridizacin in situ, etc. A@ig. 0B 5 : 5 ; -actores Gue afectan la )ibridi#acin en los filtros de nitrocelulosa Muc3os son los $actores 9ue a$ectan la rata de 3ibridizacin ' la estabilidad de los 3bridos. 5a te#(eratura de $usin de un 3brido A-mB es a$ectada (or la $uerza inica, (8, la longitud de la sonda ' su co#(osicin de bases, as co#o (or la concentracin de agentes desestabilizantes de la 3lice, co#o $or#a#ida.
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-ig? 9 Renaturacin de dos )ebras de 'cido nucleico
A T T "
T A A B C
A T A C
T A T C "
C C A
" C " C " "
A. #$%i&i$'(& )%()*$+i)& ,( -)+(& ,( .)&(& )%()*$+i)& B. '/#%()#i0' C. +()&$#i)#i0' ,( .)',)&
-ig? 4 .ibridi#acin en fase slida de 'cidos nucleicos inmo(ili#ados con 2N< radiomarcados
5 : 5 3 <ondas menores de 3= nucletidos 5os e$ectos de co#(osicin de bases sobre el -m son #a'ores cuando las sondas son #enores de ,1 bases de longitud. Para las sondas de oligonucletidos de C1 nucletidos de longitud (uede calcularse un 4alor a(ro<i#ado (ara el -m, usando la siguiente $r#ula, cuando la 3ibridizacin se lle4a a cabo ba=o condiciones est%ndar Aa(ro<i#ada#ente 1.+ M !aClB&
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-m AeCB _ M A7^CB ^ C AA^2B onde 7, C, A, 2 son los n)#eros de bases res(ecti4as en el oligonucletido. En la 3ibridizacin en $iltros, usando sondas de K!*, debe e#(learse una te#(eratura de ,eC ba=o el -m, (ara una secuencia (er$ecta#ente co#(le#entaria. Por cada (ar de bases erradas, debe reducirse la te#(eratura de 3ibridizacin en ,eC ACB. Para #%s detalles del c%lculo de las te#(eraturas de 3ibridizacin (ara di$erentes ti(os de sondas consultar el ane<o. 5 : : Rastreo de genes con oligonucletidos sint"ticos 5os oligonucletidos sintticos AK!*B son $rag#entos de A ! o R!A de cadena sencilla o doble 9ue (ueden construirse 9u#ica#ente, #anual o auto#%tica#ente en el laboratorio. 5a secuencia del K!* (uede deri4arse bien sea a (artir de una (arte de la secuencia de un A ! o de un R!A# 'a conocido o (uede ser deducida a (artir de la secuencia de a#ino%cidos de la (rotena de inters. En la (ri#era a(ro<i#acin se genera un K!* de secuencia )nica, #ientras 9ue en la segunda a(ro<i#acin, debido a la degeneracin del cdigo gentico, se genera una sonda redundante o #ezcla de sondas, 9ue integra todas las co#binaciones (osibles de tri(letes (ara cada a#ino%cido. Esta sonda es (oco (r%ctica cuando su redundancia es ele4ada AM,B. Para ob4iar esta di$icultad, se (uede deducir a (artir de la secuencia de a#ino%cidos, una sonda )nica larga a tra4s del an%lisis del codn (re$erencia, o sea los codones #%s $recuente#ente utilizados en cada organis#o (ara buscar ' seleccionar genes dentro de una genoteca. 5 : 8 Principios inmunolgicos El siste#a in#une es uno de una serie de #ecanis#os (rotecti4os 9ue los 4ertebrados 3an desarrollado (ara de$enderse contra otros organis#os, es(ecial#ente #icrosc(icos. El tr#ino in#une signi$ica 9ue un ani#al $rente a un agente in$eccioso (er#anece libre de in$eccin (or ese agente A/.B. 5a base del siste#a in#une de un organis#o es el reconoci#iento, el (oder discernir entre lo (ro(io ' lo e<tra;o A/MB. Cuando un agente e<tra;o entra en el organis#o, contra ste se desencadena una res(uesta #ediada (or una red de interacciones coo(erati4as entre (oblaciones o re(ertorios de clulas es(ecializadas 9ue conlle4a a la destruccin o neutralizacin del agente e<tra;o. Esta interaccin sucede entre tres ti(os $unda#entales di$erentes de clulas& las clulas 2 Ati#o"de(endientesB, las clulas B ABursa"de(endientesB ' los #acr$agos. 5as (ri#eras son res(onsables de la in#unidad celular, la cual se basa en la reaccin de reconoci#iento del agente e<tra;o (or (arte de #olculas unidas co4alente#ente a la su(er$icie de la clula. 5as clulas B son las res(onsables de la in#unidad 3u#oral, causada (or #olculas lla#adas anticuer(os (roducidas (or las clulas B, 'a no unidas a estas sino en solucin. 5os anticuer(os son (rotenas colecti4a#ente deno#inadas in#unoglobulinas, de $or#a si#ilar a una V. Constitu'en el C1Q de las (rotenas en la sangre. 6na si#(le #olcula de estas se deno#ina anticuer(o. Este ti(o de #olculas 4a a reaccionar con (artes es(ec$icas del agente e<tra;o A//B. El antgeno es el agente e<tra;o esti#ulador de la (roduccin de anticuer(os o clulas in#unes, cuando es in'ectado dentro de un ani#al, ' reacciona es(ec$ica#ente con los anticuer(os o las clulas in#unes. Estudios con antgenos 3idrolizados de#ostraron 9ue sola#ente ciertas (orciones restringidas de las #acro#olculas est%n i#(licadas en la reaccin antgeno"anticuer(o 'Do antgeno"clula in#une. En otras (alabras, un antgeno lle4a (arte o regiones es(ec$icas 9ue deter#inan la es(eci$icidad de la reaccin in#uno9u#ica, deno#inadas deter#inantes antignicos o e(to(es. Cada antgeno (uede tener #uc3os e(to(es di$erentes ' (roducir una res(uesta in#une es(eci$ica, (or e=e#(lo& un clon de clulas B (roduce anticuer(os de sola#ente una
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es(eci$icidad, es decir, un clon de clulas B dirigido contra un #is#o e(to(e. 6n ani#al in#unizado (roduce general#ente un n)#ero aleatorio de clonos, ' su antisuero es (oliclonal. A(ro<i#ada#ente uno de cada #il clonos reconocen un deter#inado e(to(e. En contraste, los anticuer(os #onoclonales son (roducidos (or un si#(le clon de clulas B, ' consecuente#ente tienen la #is#a a$inidad ' es(eci$icidad A.CB. 6n antisuero es (oliclonal (olies(ec$ico si es (roducido contra el organis#o total, (or e=e#(lo el &. tuberculosisI o (uede ser (oliclonal #onoes(ec$ico si es (roducido contra un antgeno deter#inado, (or e=e#(lo la (rotena M2P"M1R de &. tuberculosis. 5 : ; Rastreo de genes con antisueros policlonales 5a b)s9ueda de genes dentro de una genoteca con antisueros Ao anticuer(osB slo es (osible si el gen buscado es transcrito ' traducido en (rotena. 5a (rotena e<(resada es as reconocida (or una reaccin antgeno"anticuer(o. Este (ri#er anticuer(o (uede estar radio#arcado o ser reconocido (or un segundo anticuer(o general#ente con=ugado a una enzi#a. 2ras la autorradiogra$a o el re4elado de color (or #edio de un sustrato cro#ognico se identi$ican los clonos A/LB. 5 8 !ectores Co#o obser4 en el !u#eral /./.C. e<isten 4arios ti(os de 4ectores de acuerdo a los (ro(sitos de clona=e. !o obstante, solo unas (ocas categoras son usadas en (ro'ectos de secuenciacin a gran escala, co#o los obser4ados en la 2abla siguiente !ector .ospedero Bama1o del inserto CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCEHbFCCCCCCCCC Pl%s#ido E. coli 1" /1 @ago E. coli 1" C, Cs#ido E. coli C1" M, @ago P/ E. coli 01" /11 PACs E. coli /11" .11 BACs E. coli .11 8AECc Clulas de #a#$eros .11 OACs S. Cerevisiae C11 " C111 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
2abla .. PAC*s& cro#oso#as arti$iciales deri4ados de P/. BACs& cro#oso#a arti$icial bacteria 8AECs& cro#oso#a e(is#ico arti$icial 3u#a OACs& cro#oso#a arti$icial de le4adura.
En este te<to, slo los 4ectores ti(o la#bda son utilizados en la construccin de genotecas ' los (l%s#idos en el subclona=e de insertos ' la e<(resin de (rotenas. Por lo cual, a continuacin se considerar% algunos as(ectos rele4antes de la biologa del bacteri$ago la#bda. 5 8 5 El bacterifago lambda El geno#a del bacteri$ago est% $or#ado (or un A ! lineal de doble cadena de ,1 G(b de longitud, el cual est% e#(a9uetado en una c%(side icosadrica de naturaleza (roteica. Este A ! est% en $or#a de una #olcula du(le< lineal, cu'os e<tre#os co3esi4os ACosB est%n $or#ados (or /C nucletidos de cadena sencilla. 5as (artculas de $agos se adsorben (or el e<tre#o de la cola a rece(tores en la #e#brana #%s e<terna de la clula. Esta adsorcin es #%s e$iciente si est% (resente la #altosa en el #edio de culti4o, 'a 9ue sta induce la e<(resin del o(ern de la #altosa, el cual contiene el gen 5a#b 9ue codi$ica (ara el rece(tor de la#bda.
27
es(us de entrar en la clula, el geno#a de la#bda se circulariza a tra4s de sus e<tre#os Cos ' la #olcula se une co4alente#ente. e esta #anera el A ! sustrato 9ueda listo (ara la re(licacin ' la transcri(cin del A ! de la#bda. *iendo un $ago te#(erado, (uede seguir 'a sea (or 4a (roducti4a AlticaB o (or 4a te#(erada AlisognicaB. En cual9uier caso, la transcri(cin es iniciada a (artir de dos (ro#otores >te#(ranos?, P5 ' PR. @ig. -. En una in$eccin (roducti4a AlticaB se logra la transicin de la transcri(cin te#(ranaI se sintetizan las (rotenas del 4irus, los geno#as 4irales se e#(a9uetan ' la lisis de la clula libera a(ro<i#ada#ente /11 (artculas in$ecti4as. En la res(uesta te#(erada, la #a'ora de $unciones del $ago la#bda son re(resadas, 'a sea directa o indirecta#ente, #ediante #olculas re(resoras del $ago unidas a las regiones o(eradas asociadas con P5 ' PR. *i la re(resin ocurre antes de 9ue se acti4en los genes tardos, la lisis se e4ita ' la lisogenia 9ueda asegurada. Para 9ue la lisogenia sea estable ' no aborti4a re9uiere la integracin del geno#a de la#bda dentro del cro#oso#a 3os(edero #ediante reco#binacin sitio es(ec$icoI de esta #anera el geno#a del $ago Ael (ro$agoB ser% re(licado co#o (arte del cro#oso#a de E. coli. *i el lisogeno Ala bacteriaB es sensibilizado con calor o luz 6V, el (ro$ago entra en 4a ltica A/L, ..B. @ig. +.
@ig. /.0. Ma(a gentico de la#bda #ostrando el agru(a#iento de las $unciones reguladoras.
OL PL CIII N nut
PM CI
PR OR Cro
PE CII
Regulador !o"iti#o
Antiter inador
Re!re"or
Antire!re"or
Regulador negati#o
@ig. -. Ma(a gentico del $ago la#bda sil4estre #ostrando el agru(a#iento de las $unciones reguladoras.
28
@ig. +. Estilos de 4ida del $ago la#bda.
5 8 : Cascada ltica del fago lambda interconectada con el circuito para lisogenia 2anto la 4a ltica co#o lisognica re9uieren la e<(resin de genes in#ediata#ente te#(ranos ' genes in#ediata#ente tardos. Pero luego estos di4ergenI el desarrollo ltico contin)a si se (ro#ue4e la sntesis de un re(resor. 5a#bda tiene )nica#ente dos genes in#ediata#ente te#(ranos, el gen cro ' el gen ! transcritos inde(endiente#ente (or la R!A (oli#erasa. El gen cro tiene una $uncin dual& i#(ide la sntesis del re(resor lisognico Auna accin necesaria si el ciclo ltico se iniciaB, ' a(aga la e<(resin de los genes >in#ediata#ente te#(ranos? Alos cuales 'a no son necesarios si entra en ciclo lticoB. El gen ! codi$ica un $actor antiter#inador cu'a accin en los sitios nut (er#ite 9ue la transcri(cin (rosiga 3acia los genes in#ediata#ente tardos. 5os genes >in#ediata#ente tardos? inclu'en genes de re(licacin AK ' PB necesarios (ara la in$eccin ltica ' genes de reco#binacin, algunos i#(licados durante la in$eccin ltica o durante la lisogeniaI ta#bin est%n incluidos los genes 9ue codi$ican los reguladores cII ' cIII necesarios (ara iniciar la sntesis del re(resor lisognico. El $actor de antiter#inacin E (er#ite 9ue la R!A (oli#erasa (rosiga a tra4s de los genes tardos. @ig. /.+. As, los genes in#ediata#ente tardos sir4en (ara controlar dos estilos de 4ida& algunos son necesarios (ara 9ue el $ago entre en lisogeniaI los otros aseguran 9ue el ciclo ltico siga su curso AC1, .., M1B. @ig. - ' /1. 5a transicin lisis"lisogenia de(ende de un intrincado balance entre un n)#ero de $actores del 3os(edero ' del $ago (resentes en la clula in$ectada.
29
1.3.3.
<istema gen"tico de gt-5=
El la#bda gt/1 es una 4ersin de $agos, (roducto de la ingeniera gentica del 4irus la#bda ti(o sil4estre. El 4ector la#bda gt/1 tiene M..- Rb ' (osee un sitio (ara reconoci#iento de la enzi#a EcoRI en el gen cI Agen re(resor de la#bdaB ' (uede ace(tar un $rag#ento de 0.L Rb antes de e#(a9uetarse en (artculas 4irales AMB. Este 3a tenido dos ca#bios i#(ortantes (ara 3acerlo #%s )til en las #ani(ulaciones biolgicas #oleculares. Pri#ero, se le re#o4i una gran (ieza de !A innecesario. Esto crea un siste#a a(ro(iado en el geno#a de ste (ara clonar un $rag#ento de !A e<tra;o Aun insertoB dentro del 4irus, el cual ser% luego re(licado =unto con el geno#a 4iral. Esto signi$ica 9ue (uede usarse al la#bda gt/1 (ara a#(li$icar $rag#entos de !A clonados ' obtener #uc3as co(ias del #is#o. *egundo, el la#bda gt/1 3a sido #odi$icado (ara utilizarse solo en su ciclo ltico, cuando crece en 3us(ed a(ro(iado. Por esta razn cuando se 3ace crecer el $ago en una ce(a a(ro(iada de E. coli, el $ago lisar% la bacteria, (odr% 4erse una #anc3a clara en la (elcula A$il#B del #edio de an%lisis de E. coli. 5os $agos se guardan general#ente a concentraciones #u' altas. Es i#(ortante tener una deter#inacin correcta del n)#ero de $agosD#l en el contenedor de de(sito (ara su uso (osterior. Para deter#inar el n)#ero, se debe diluir los $agos del contenedor de de(sito. *i 3a' #uc3os $agos en el (lato de (etri, las (lacas de sobrela(aran ' no se (odr%n contra los $agos correcta#ente. Para obtener una adecuada deter#inacin de estos se necesita 3acer diluciones seriadas del de(sito de $agos. 8a' una serie de di$erente ti(os de diluciones. 5a (ri#era dilucin se 3ace to#ando /1 ul de la solucin de de(sito ' se dilu'e /11 4eces coloc%ndola en 1.+++ #l de Bu$$er *M. ebido a 9ue se 3ace una dilucin en /11, sta se #arca co#o /1"C Aconcentracin /D/11 de la solucin original de de(sitoB" Posterior#ente se dilu'en /1 ul de esta solucin en /111 #l ' se #arca co#o /1"M. Posterior#ente, /1 #l se esta solucin se dilu'e /11 4eces, ' al $inal obtene#os una solucin de /1"L. !ote 9ue la (ri#era ' segunda dilucin se 3acen a (artir de la (ri#era dilucin. Esto signi$ica 9ue cual9uier error en la (ri#era dilucin ser% crtico (ar las subsecuentes diluciones. Por esta razn, se debe (i(etear cuidadosa#ente (ara obtener resultados correctos. es(us de diluir el de(sito de $agos en bu$$er *M, se incuba una #uestra con ER. Coli. *e adiciona agar sua4e a M,oC ' la #ezcla se (la9uea en (latos de agar 5B. Al da siguiente se (uede calcular el n)#ero de $agos del de(sito original contando el n)#ero de (lacas del (lato ' #ulti(licar este n)#ero (or la dilucin usada (ara 3acer la (laca.
30
1.3.4.
<istema gen"tico de gt-55
El siste#a gt"// es )til (ara la construccin de genotecas de A !c ' Do gen#icas, al igual 9ue (ara el aisla#iento de (rotenas de $usin a "galactosidasa usando anticuer(os contra "galactosidasa. El cro#oso#a del bacteri$ago la#bda es una #olcula lineal de A ! de M-.L Rb de longitud, con el M1Q del geno#a no esencial (ara la (ro(agacin del $ago. 5os ingenieros genticos, al retirar estas (artes e introducir otras, 3an construido una ga#a de 4ectores (ara di$erentes (ro(sitos de clona=e. 6no de estos es el 4ector de insercin ' e<(resin la#bda gt"//, un $ago te#(erado 9ue contiene el (ro#otor 5ac ' el gen estructural P (ara la galactosidasa, to#ados a (artir del o(ern 5ac de E. coli A/L, ,/, 0., 0MB.
In ediata ente te !rano Cro % antire!re"or

N % antiter inador
In/i(e la e0!re"i)n
CI % Re!re"or
In ediata ente tardio CII$CIII % reguladore"

& gene" de re'o (ina'i)n 2 gene" de re!li'a'i)n * % antiter inador
Pro ue#e la e0!re"i)n
Tardio
+, gene" de la 'a(e-a ++ gene" de la 'ola 2 gene" de l."i"
@ig. /.1. Cascada ltica interconectada con el circuito (ara la lisogenia AC1B. Ver tabla C.
5 8 3 Caractersticas generales del sistema 0ambda gt-55? 7enoti(o& lac,, cI-,0, nin,, sam/11. 2abla .. Ca(acidad de clona=e& 1 f 0.1 Rb. *itio de clona=e& Eco +,. @ig. //. Pro#otor& P 5ac. Reconoci#iento de reco#binantes& $enoti(o 5ac" sobre 3os(edero 5acP". Reconoci#iento de no reco#binantes& $enoti(o 5ac^ sobre 3os(edero 5acP". Pro(iedades de los $agos reco#binantes& cI ts, Int^, red^. .ospedero& ce(as& 4er @ig. /C ' 2ablas !os.M, ,, L. Ol1--& AsupE, sup@, metB, trpR, hsdR"GM"G, tonAC/, srtA, lac6/L+, proC& & tn/1 A(MC+BB. O/1+1& Alac6/L+, lon, ara /.+, strA, sup@, trpCCC& & tn/1, A(MC+BB. El sitio usado (ara la insercin del A ! blanco es un lugar )nico de cli4a=e Eco +, localizado dentro del gen 5ac P, ,. (b corriente arriba del codn de ter#inacin de la
31
transcri(cin de la galactosidasa. El cli4a=e de la#bda gt"// con Eco +, genera dos brazos de a(ro<i#ada#ente /+ ' CM Rb de longitud, los cuales $lan9uear%n los A ! blancos (ara clonar A+B. @ig. //.
10 20
I'*
Hi', III Hi', III
30
(2$
40
N
50 1 S R
3.
Hi', III
Hi', III
Hi', III
P L)#.
5ac P cI -,0
nin ,
EcoRI
"""""Brazo iz9uierdo"""""""""""""""""Brazo derec3o"""""""""""""""""""
@ig. //. Ma(a de restriccin con 8ind III de la#bda gt"//.
M111 Rb
7&,R M 5(* B A+) D
78% %)',)
T$' A & *+
% )
P+$ C66 T'5
3600 3. 5)%4%)
90
10040 5i'
1 0
400 3.
S/- ! A** %)',)
3200 3.
80
ADN de Escherichia coli
2 0
800 3.
*+ *66 T'10
5 )% ,) '
2800 3.
70 30 60
2400 3.
1200 3.
40 50
2000 3. 1600 3.
+( #
@ig. /C. Ma(a gen#ico de E. coli, #ostrando la localizacin de los #arcadores genticos i#(licados en el $unciona#iento del siste#a la#bda gt"//.
32
5 8 9 <istema gen"tico de IAP II? escisin in vivo del fag"mido pBluescript <JE-F a partir del (ector lambda IAP II El 4ector PAP II 3a sido dise;ado (ara (er#itir la escisin in vivo ' la recircularizacin de cual9uier inserto clonado contenido dentro del 4ector la#bda (ara $or#ar un $ag#ido 9ue contiene el inserto clonado. Esta escisin in vivo es de(endiente de las secuencias de A ! 9ue *tratagene2M 3a colocado en el geno#a del $ago la#bda ' sobre la (resencia de una 4ariedad de (rotenas, inclu'endo (rotenas deri4adas del bacteri$ago $/. 5as (rotenas del $ago $/ reconocen una regin del A !, el cual nor#al#ente sir4e co#o el >origen de re(licacin? del bacteri$ago $/ (ara la sntesis de la banda (ositi4a. *in e#bargo, el origen de la re(licacin de la banda A^B (uede ser di4idido en dos (artes trasla(adas& /B el sitio de iniciacin ' CB el sitio de ter#inacin (ara la sntesis del A !. Estas dos regiones del origen de la banda (ositi4a 3an sido subclonados se(arada#ente en el 4ector la#bda PAP II. El $ago la#bda AblancoB es accesible a las (rotenas deri4adas de $/ #ediante in$eccin si#ult%nea de una ce(a E. coli, tanto con el 4ector la#bda ' el bacteri$ago $/. entro de E. coli, las (rotenas a'udadoras Aes decir, las (rotenas del $ago M/. ' $/B reconocen el A ! iniciador 9ue esta dentro del 4ector la#bda. Estas (rotenas luego 3acen una #uesca AnicGB en una de las dos bandas del A !. En el sitio de esta #uesca, co#ienza la sntesis del A ! nue4o ' du(lica cual9uier A ! 9ue e<ista en el 4ector la#bda curso aba=o del sitio de la #uesca. 5a sntesis de A ! de una banda si#(le nue4a de A ! contin)a a tra4s del inserto clonado 3asta una se;al de ter#inacin (osicionada en .\ de la se;al iniciadora, la cual se encuentra dentro del 4ector la#bda construido. 5as #olculas de A ! de banda si#(le son circularizadas (or el (roducto del gen II del $ago $/ $or#ando una #olcula de A ! circular, la cual contiene cada cosa entre el iniciador ' el ter#inador. En el caso del 4ector la#bda PAP II, este inclu'e todas las secuencias del $ag#ido, ("luescript *RA"B ' el inserto, si alguno esta (resente. Esta con4ersin es el (aso de >subclona=e?, 'a 9ue todas las secuencias asociadas con los 4ectores la#bda nor#ales est%n (osicionadas $uera de las se;ales ter#inadoras e iniciadoras ' no est%n contenida dentro del A ! circularizado. Ade#%s, la circularizacin del A ! auto#%tica#ente recrea un origen $/ $uncional co#o el encontrado en el bacteri$ago $/ o los $ag#idos. 5as se;ales (ara el >e#(a9ueta#iento? de los $ag#idos creados nue4a#ente est%n contenidas dentro de la secuencia A ! origen"ter#inador de $/. Estas (er#iten 9ue la circularizacin del A ! sea >e#(acada? ' secretada a (artir de E. coli. 6na 4ez el $ag#ido es secretado, las clulas de E. coli usadas (ara la escisin in 4i4o del A ! clonado (uede ser re#o4ido a (artir del sobrenadante (or calenta#iento a 01eC. El calenta#iento #ata todas las clulas E. coli, #ientras 9ue los $ag#idos (er#anecen resistentes al trata#iento (or calor. Para la (roduccin del A ! de doble banda, el A ! del (B* >e#(acado? es #ezclado con clulas $rescas de E. coli ' son es(arcidas sobre (latos de 5B"a#(icilina (ara (roducir colonias. A ! a (artir de #ini(re(araciones de estas colonias (ueden ser usadas (ara el an%lisis de insertos de A ! 9ue inclu'en secuencia#iento de A !, subclona=e, #a(eo ' e<(resin. 5as colonias del (B* (ueden ta#bin ser usadas (ara la (roduccin subsecuente de A ! de banda si#(le adecuado (ara secuencia#iento dideo<' ' #utagnesis en sitio es(ec$ico. 5 8 4 Rastreo de genes con anticuerpos ebido a 9ue el sitio de insercin del A ! blanco en la#bda gt"// est% dentro del gen estructural (ara la galactosidasa, la secuencia del A ! blanco en este 4ector tiene el (otencial de e<(resarse a (artir del (ro#otor 5ac, co#o (rotena de $usin con la galactosidasa. Por lo tanto, en genotecas de A ! reco#binantes construidas en la#bda gt"//, se (uede e$ectuar la b)s9ueda de genes con anticuer(os contra antgenos (roducidos (or clonos reco#binantes es(ec$icos.
33
5 8 K -actores Gue afectan la estabilidad de las protenas recombinantes ebe tenerse en cuenta tres as(ectos (rinci(ales en la (roduccin de (rotenas e<tra;as en E. coli& Kbtencin de un adecuado ni4el de e<(resin de las secuencias de A ! blanco. 2eniendo la secuencia de A ! blanco $usionada a la secuencia del gen de la " galactosidasa se asegura 9ue el A ! e<tra;o se e<(rese e$iciente#ente en el 3os(edero, ba=o el control del o(ern 5ac. Control de la (roduccin de (rotenas codi$icadas (or la secuencia de A ! blanco. Esto es i#(ortante cuando la (rotena es t<ica (ara la clula 3os(edera. Este (roble#a se 3a #ini#izado usando clulas 3os(ederas 9ue (roducen grandes cantidades del re(resor del o(ern 5ac Ael (roducto del gen IB (ara i#(edir la e<(resin dirigida (or 5ac P de la (rotena durante las 3oras iniciales de creci#iento. Cuando el n)#ero de clulas es su$iciente, la e<(resin dirigida (or 5ac P es inducida inacti4ando el re(resor con IP27. e este #odo, (uede (roducirse cantidades detectables de antgeno e<tra;o, a)n si el antgeno es t<ico (ara las clulas. 5a estabilidad del antgeno (roducido se incre#enta (or su e<(resin co#o una (rotena de $usin "galactosidasa"antgeno ' (or la utilizacin de clulas 5on (roteasa de$icientes. 5a .on (roteasa es una de 4arias (roteasas res(onsables de generar una ba=a estabilidad de las (rotenas anor#ales o e<tra;as en E. coli. Esta (roteasa $recuente#ente 3ace di$cil acu#ular cantidades detectables de antgeno en clulas de ti(o sal4a=e. Por esta razn se usa un 3os(edero #utante .on (ara incre#entar la estabilidad de estas (rotenas de $usin durante el (roceso de la b)s9ueda de genes. Ade#%s, la estabilidad de las (rotenas de $usin (er#ite el aisla#iento de cantidades (re(arati4as de (rotena a (artir de un lisgeno (articular de la#bda gt"// reco#binado A/LB. 5 8 @ <istema gen"tico lactosa 5a sntesis de enzi#as inducibles es (uesta en #arc3a si ocurren ca#bios en el #edio a#biente 9ue inducen el re9ueri#iento de esta 4a #etablica. Por e=e#(lo, la sustitucin de la lactosa (or glucosa en el #edio de culti4o, (er#ite 9ue el #etabolis#o de la lactosa se acti4e, en consecuencia, la transcri(cin del o(ern ser% encendida, el R!A# ser% sintetizado ' la enzi#a sintetizada AL.B. 2odo o(ern tiene& genes estructurales, i#(licados en una 4a #etablica ' una regin de control 9ue regula la e<(resin de los genes estructurales. Para el #etabolis#o de la lactosa se re9uiere la sntesis de tres enzi#as& el gen P (ara la galactosidasa, la enzi#a 9ue 3idroliza la lactosa en glucosa ' galactosaI el gen O (ara la galacto(er#easa, la (rotena estructural de la #e#brana 9ue induce la lactosa a la celulosa, ' la transacetilasa, codi$icada (or el gen A, 9ue deto<i$ica la clula (or acetilacin de an%logos de lactosa no #etabolizables, co#o el iso(ro(iltiogalacto(iransido AIP27B AC1B. Ade#%s el o(ern tiene una regin de control de a(ro<i#ada#ente /C1 (ares de bases A(bB de longitud. @ig./..
34
Regi)n de Control Pi ADN +,4, ARN Poli!2!tido Prote.na a'ti#ada 3un'i)n 360 38.000 T(*+;5(+$ 152.000 R(-+(&$+ 52 lac I lac P lac O
Gene" E"tru'turale" lac Z lac Y lac A
67+,
&5,
527 !(
1021 116.000 T(*+;5(+$ 500.000 g)%)#*$&i,)&)
260 30.000 C$5-$'('*( ,( 5(5.+)') 30.000 P(+5()&)
275 30.000 D<5(+$ 60.000 T+)'& )#(*i%)&)
A;#& .D). !&*+. D).
@ig. /.. El o(ern 5ac, ocu(a a(ro<i#ada#ente L.111 (b AC1B.
Esta co#(rende el o(erador, el cual e=erce control sobre todo el o(ernI el (ro#otor trasla(ado con el o(eradorI ' un gen estructural I el cual codi$ica (ara la (rotena re(resora AL.B. @ig./M.
Pi ADN
lac I
lac P lac O
lac Z
lac Y
lac A
Pro otor
1itio uni)n al a'ti#ador CAP ATG 1itio de uni)n de la ARN !ol
O!erador
1itio de uni)n del re!re"or
ARN 84 72 52 35 10 1 91
P$%i-:-*i,$
@ig. /M. Regin controladora del o(ern lac.
35
En ausencia de lactosa, el o(ern no es transcrito, (or9ue la (rotena re(resora se une al o(erador en una regin alta#ente si#trica. El (ro#otor se encuentra ad'acente corriente arriba del o(erador ' (arcial#ente trasla(ado con steI (or lo tanto, esta regin es ta#bin blo9ueada cuando el re(resor se une al o(erador. e esta $or#a, la R!A (oli#erasa no (uede unirse al (ro#otor ' la transcri(cin no tiene lugar& el o(ern es re(resado. *i un inductor est% (resente, co#o la lactosa, o un inductor arti$icial de estructura si#ilar co#o el IP27, ste se une al re(resor ' lo inacti4a (ara unirse al o(eradorI as, el sitio es accesible a la R!A (oli#erasa. 5a enzi#a, unida al sitio (ro#otor transcribe el #ensa=e (ara todas las tres enzi#as. @ig./,. Mientras 9ue el re(resor e=erce control negati4o, la transcri(cin del o(ern 5ac ta#bin es so#etida a control (ositi4o (or otra (rotena reguladora& (rotena acti4ador del catabolito, CAPI el CAP en unin con el inductor cAMP acti4a la transcri(cin del o(ern.
A
Pi ADN lac I lac P lac O lac Z lac Y lac A
ARN
Re!re"or ono 2ri'o
Re!re"or tetra 2ri'o a'ti#o
B
Pi ADN lac I lac P lac O lac Z lac Y lac A
ARN
!ol pol
Re!re"or ina'ti#o
$Gala'to"ida"a Per ea"a

Indu'tor
Tran"$ a'etila"a
@ig. /,. Regulacin de la sntesis (roteica del o(ern lac. AB K(ern re(ri#ido o a(agado. BB K(ern inducido o encendido& la AR! (ol transcribe una #olcula de AR!# 9ue es traducida (or los riboso#as en tres cadenas (oli(e(tcas 9ue dan origen a los tres ti(os de enzi#as. 36
5a interaccin del co#(le=o CAP"cAMP con el (ro#otor, (roduce la transcri(cinI esto es lle4ado a cabo (or9ue el sitio (ara la R!A (oli#erasa 9ueda accesible a la unin con la enzi#a. *i la glucosa, una $uente #%s e$ecti4a de carbono, est% (resente en el #edio, no 3a' necesidad del #etabolis#o de la lactosa. Ba=o estas condiciones, se e4ita la re(resin (or catabolito, (ues los ni4eles de cAMP decrecen AL.B. 5 8 5= Identificacin de clonos recombinantes 5a distincin entre $agos no reco#binantes ' $agos reco#binantes en el siste#a la#bda gt"//, reside en la $or#acin de (lacas azules ' (lacas incoloras. Cuando los $agos no reco#binantes son cosec3ados en 3os(ederos 5ac" en (resencia del sustrato cro#ognico ,Br,MCl,.Indolil" "7alactsido, A:"galB, se (roducen (lacas azules. 5a razn es 9ue se induce (or control negati4o la e<(resin de una galactosidasa acti4a 9ue 3idroliza el sustrato :"gal ' libera un co#(uesto cro#ognico insoluble AndigoB. Por el contrario, si el $ago (orta un A ! reco#binado se induce la e<(resin de (rotenas $usionadas a la galactosidasa. En esta situacin 9ui#rica, la enzi#a no $or#a un tetr%#ero acti4o ' (or ende es inca(az de 3idrolizar el :"gal, (roduciendo (lacas incoloras en el #edio. El siste#a de induccin del o(ern 5ac est% gobernado desde un (l%s#ido A(MC+B, el cual (orta el (ro#otor I (ara e<(resar el gen regulador I. Por co#(le#entariedad gentica del (roducto di$usible Ael re(resorB se une a los o(eradores 5ac el A ! de E. coli ' al (ro#otor 5ac P del $ago la#bda gt"//. 5a (resencia del inductor IP27 dis(ara la e<(resin de los o(erones. Este (l%s#ido a la 4ez con$iere resistencia a su 3os(edero contra los antibiticos a#(icilina ' tetraciclina A/L, ,/B. @ig./L.
A8 Re!re"i)n
La (da g* 11 E. coli >1090 lacZ
Re!re"or a'ti#o Tran"'ri!'i)n L)# = lacZ
37
lacZ lacY lacA

PMC:
B8 Indu''i)n 'on 9ago no re'o (inado
IPTG ;Indu'tor< Re!re""or ina'ti#o $gala'to"ida"a Per ea"a Tran"a'etila"a =$Gal Color a-ul ;=$Gal /idroli-ado<
C8 Indu''i)n 'on 9ago re'o (inado
")%)#*$&i,)&)
@ig. /L. Identi$icacin de reco#binantes en el siste#a la#bda gt"//
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5 8 55 <istema gen"tico del pl'smido Bluescript @ig. /0.
5 8 5: <istema gen"tico del pl'smido pMal -ig 5K
5 ; 0a Reaccin en Cadena de la Polimerasa EPCRF 5a PCR es una 3erra#ienta desarrollada (or el bio9u#ico Rar' Mullis en /+-L con el ob=eto de a#(li$icar de #anera es(ec$ica un $rag#ento de A !. Esta tcnica se $unda#enta en el (rinci(io de la re(licacin (er#itiendo la generacin de $rag#entos general#ente #enores de /,11 (b #ediante el uso de dos iniciadores de secuencia es(ec$ica ' una A ! (oli#erasa. Para #ontar una PCR necesita#os b%sica#ente de 0 cosas& /B el A ! blanco a a#(li$icarI CB una A ! (oli#erasa ter#oestable Ao -a) (oli#erasaBI .B los cuatro d!2Ps AdA2P, d22P, d72P ' dC2PBI MB dos iniciadores secuencia es(ec$ica (or lo
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general entre /- ' C, nucletidos de longitudI ,B una solucin ta#(n a(ro(iada con Mg^CI LB agua estril ' 0B un ba;o Mara so$isticado o ter#ociclador. En #odelos antiguos de ter#ocicladores se re9uiere usar aceite #ineral sobre toda esta #ezcla de reaccin (ara e4itar la e4a(oracin. 5a a#(li$icacin del A ! se logra tras C, a M, ciclos de re(licacin obtenindose as CAn"CB co(ias del $rag#ento a#(li$icado siendo n el n)#ero de ciclos necesarios. 6n ciclo de a#(li$icacin esta dado (or tres $ases sucesi4as de reaccin 3ec3as (or lo general a di$erentes te#(eraturas. 5a (ri#era $ase de cada ciclo es la denaturacin del A ! en la cual las bandas de A ! son se(aradas generando A ! de banda si#(le AA !bsB, esto se 3ace a #%s de +CoC general#ente con un #inuto de duracin. 5a siguiente $ase es el >anneling? o )ibridi#acin de iniciadores al A !. A9u es i#(ortante conocer la te#(eratura de $usin o -m de los iniciadores, la cual general#ente se da (or deba=o de L,oC. 5a tercera $ase es la polimeri#acin o e<tensin de los iniciadores, donde la A ! (oli#erasa sintetiza las cadenas de A ! nacientes en la direccin ,\""g .\ a (artir de los e<tre#os .\K8 de los iniciadores. Esta se lle4a a cabo a 0CoC (or uno a dos #inutos. Cu#(lido el (ri#er ciclo, estas . $ases se re(iten n 4eces a $in de co#(letar el n)#ero de ciclos de a#(li$icacin (rogra#ados en el ter#ociclador. @lan9ueando estos n ciclos el A ! debe ser (re4ia#ente denaturado A iB (or , #inutos a $in de abrir todo el A ! blanco ' $inal#ente debe e<tenderse a 0C oC (or 0 a /1 #in (ara sellar todos los $rag#entos a#(li$icados AE$B. Para ter#inar debe ta#bin (rogra#arse una $ase a MoC (ara al#acenar en re$rigerador los (roductos a#(li$icados (ara su (osterior deteccin (or electro$oresis. Bemp AoCB +, 0C L, M Biempo A#inB Di ciclo 5 ciclo : ciclo n-5 ciclo n Ef A C B
@ig. /+. Variaciones de la te#(eratura a lo largo de una PCR est%ndar de n ciclos de a#(li$icacin. Cada $ase del ciclo tiene una duracin de un #inuto. AB denaturacin. BB >anneling? ' CB e<tensin.
Por e=e#(lo, a (artir de una sola #olcula de A ! blanco ' durante .1 ciclos de a#(li$icacin se (roducir%n CAn"CB $rag#entos de A !., es decir, C.L- : /1- #olculas de A !. A@ig. /+B ado este (otencial de a#(li$icar es(ec$ica#ente el A !, la tecnologa de la PCR se 3a con4ertido en una (oderosa 3erra#ienta en biologa #olecular con una ga#a de a(licaciones cada 4ez #%s nu#erosas. Entre algunas tene#os& /B la a#(li$icacin es(ecie es(ec$ica de (roductos #ediante iniciadores dise;ados a(ro(iada#ente (er#ite detectar genes ' sus (oli#or$is#os en una 4ariedad de es(ecies. CB 5a PCR (er#ite el clona=e de (roductos de a#(li$icacin a (artir de $uentes 9ue contienen A !c, A ! gen#ico, OAC, $agos, cs#idos ' (l%s#idos. .B 5a a#(li$icacin de A ! $lan9ueante desconocido #ediante iniciadores si#(les ' es(ec$icos. MB 5a PCR ta#bin es )til (ara
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la (roduccin de sondas de A ! isot(icas ' no isot(icas. ,B Para el rastreo directo de genotecas la#bda ' cs#idos. LB Con la PCR (ode#os generar #)lti(les #utaciones dirigidas si#(les in vitro. 0B 8acer #utagnesis #)lti(le. -B irigir el secuencia#iento de A ! auto#atizado de (roductos de PCR de banda si#(le o banda doble. +B 2a#bin es (osible la distincin entre secuencias de A ! casi idnticas ' la deteccin de #utaciones. /1B 5a generacin de (oli#or$is#os en $rag#entos a#(li$icados, entre otras #)lti(les a(licaciones. Para una re4isin detallada ' e<tensa de a(licaciones, reco#enda#os el libro PCR 2ec3nolog'& current inno4ations. En el ca(tulo 0 3are#os a(licacin de la PCR (ara la identi$icacin de insertos reco#binantes dentro de una genoteca. Adicional#ente, e<isten 4arios ti(os de PCR, entre estos& PCR si#trico (ara la a#(li$icacin est%ndar de $rag#entos de A !. PCR asi#trico (ara secuencia. PCR in4ertido (ara a#(li$icar seg#entos de A ! 9ue $lan9uean una regin de secuencia conocida. htil (ara ca#inar (or el gen. PCR anclado (ara e<tre#os ,Z o .Z desconocidos. Alteracin de secuencias ' #utagnesis (ara introducir #utaciones (untuales ' PCR"R!A (ara a#(li$icar AR!#, esta )lti#a es #e=or conocida co#o R2"PCR. Co#o en toda PCR el dise;o de los (ri#ers es un $actor crtico (ara la obtencin de un (roducto es(ec$ico. 5a #a'ora de las reglas (ara el dise;o de los iniciadores son e#(ricas. *in e#bargo algunas consideraciones (ueden seguirse a $in de reducir errores. 5a siguiente 2abla #uestra algunos (ar%#etros a obser4ar. Par'metro !alor ptimo
/. *ecuencia )nica del oligonucletido C. >7ra(a? 7C en el e<tre#o .\ /"C 7DC nucletidos .. !inguna autoco#(le#entaridad . bases contiguas M. !inguna autoco#(le#entaridad a la contra(arte antisentido . bases contiguas ,. Co#(osicin ' distribucin aleatoria de bases M,",,Q del contenido de 7C L. 5ongitud del cebador /- " C, (b 0. -m del cebador -. istancia ' co#(osicin de la secuencia intra(ri#ers /11 " L11 bases a(arte 2abla M. Reglas generales (ara el dise;o de iniciadores (ara la PCR. Ada(tado de PCR 2ec3nolog', /++M.
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Captulo : CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC Construccin de bibliotecas de ADN-Recombinante

Bibliotecas de ADN Recombinante e #odo general, (osde#os decir, 9ue las bibliotecas de A ! son colecciones de 4ectores reco#binantes, 9ue re(resentan secuencias de A ! e<tra;as o insertadas. Cuando la biblioteca es cro#oso#al, la biblioteca gen#ica (uede ser utilizada (ara clonar genesI cuando la biblioteca insertada es el A !c (roducto de la transcri(cin re4ersa del AR! #ensa=ero, la biblioteca de A !c (uede ser utilizada (ara clonar el A ! de A !c. 5a $igura C1 #uestra en $or#a es9ue#atizada, la construccin de una biblioteca de A !c en el 4ector la#bda gt/1. 5a biblioteca de A !c es una coleccin de $agos la#bda reco#binantes 9ue contienen #illones de co(ias de AR! #ensa=ero.Yi,// En la $igura C1 se (uede obser4ar co#o, #ediante A ! transcri(tasas, (oli#erasas o ligasas se constru'e un $rag#ento de A ! Ael de intersB ' se inserta en el $ago a utilizar A(arte A de la $igura C1I una 4ez obtenido el $ago se (rocede a in$ectar una colonia de E. coli en una ca=a de Petri. Cada in$eccin (roducir% una (laca caracterstica en la ca=a de Petri A,1 #il (lacas (ueden caber en una ca=a de Petri de /,1 ##B. 6na 4ez 9ue las (lacas se 3an $or#ado se coloca un $iltro de nitrocelulosa en contacto con las colonias de la ca=a de Petri. El A ! trans$erido al $iltro es desnaturalizado ' $i=ado en el $iltro #ediante el uso de luz ultra4ioleta. e esta $or#a el $iltro (uede ser 3ibridizado con una sonda radiacti4a de A !c de inters ' so#etido a autorradiogra$iaI una #anc3a en la autorradiogra$ia (er#itir% identi$icar la (laca de la ca=a de Petri 9ue contiene el $ago con el A ! de inters. El $ago (uede entonces ser e<trado del agar de la ca=a de Petri ' rein$ectar a E. coli. 5a re(eticin de este (roceso de se(aracin de un $ago reco#binante, (er#ite clonar el A ! del $ago. Este (roceso 3a (er#itido desarrollar bibliotecas de A ! de di$erentes te=idos 5os (asos seguidos en la construccin de una genoteca a (artir de bacilos son& el aisla#iento ' (uri$icacin de A ! bacilarI la e4aluacin de su calidadI la construccin de una genoteca gen#ica del bacilo en un 4ector la#bdaI a#(li$icacin ' e4aluacin de la calidad de la genoteca gen#icaI la sntesis 9u#ica de oligonucletidos sintticos redundantes, #ediante el #todo del $os$ito"triesterI la deter#inacin de las #e=ores condiciones de 3ibridizacin de sondas redundantes #ediante an%lisis dot"blot ' la b)s9ueda de los clonos (ara las (rotenas bacilares es(ec$icas, utilizando anticuer(os (oliclonales #onoes(ec$icos co#o sondas.
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El (roceso general de la construccin de la genoteca (uede 4erse en la @ig.C1. El (ri#er (aso en el estudio de genes 9ue codi$ican las (rotenas de la bacteria $ue el aisla#iento ' (uri$icacin del A !.
: 5 Preparacin del ADN genmico *i desea#os construir una genoteca de un #icroorganis#o bacteriano, culti4ado in vitro, (or e=e#(lo de una #'cobacteria, el A ! (uede aislarse a (artir de un gra#o de bacilo A(eso 3)#edoB, seg)n se describe en el iagra#a /. Cada ti(o bacteriano tendr% sus re9ueri#ientos enzi#%ticos ' solubles (ara su ro#(i#iento. 5a (ri#era $ase de ro#(i#iento de la (ared celular se 3izo #ediante trata#iento enzi#%tico, seg)n el #todo de 23ole ALMB el cual consiste en tratar las clulas con lisozi#a ' un agente 9uelante, el etilen dia#ino tetractico AE 2AB. 5a $uncin de la lisozi#a es 3idrolizar los enlaces glucosdicos BA/""gMB (resentes en el ((tido glucano de la (ared #icrobacterial. 6na 4ez escindida la (ared celular, la clula se 3inc3a, se ro#(e la #e#brana celular ' se libera el contenido celular. 5a lisis se co#(leta con la adicin de un detergente, el dodecilsul$ato de sodio A* *B (ara solubilizar los l(idos de la (ared, ' la enzi#a (roteinasa R 9ue 3idroliza los enlaces (e(tdicos de todo el siste#a de entra#ado de la (ared celular A,.B. urante todo el (roceso debe e4itarse la e<cesi4a agitacin (uesto 9ue las #olculas de A ! son e<tre#ada#ente susce(tibles a $uerzas #ec%nicas AML, .CB. Aislado el A !, se e<traen los residuos (roteicos con $enol saturado 'Do una #ezcla de $enol saturado ' cloro$or#o. 5a #a'or (arte de las (rotenas desnaturalizadas entran en la $ase org%nica o (reci(itan en la inter$ase org%nica acuosa, ' el A ! (er#anece en la $ase acuosa. 5a re#ocin del R!A se 3ace (or trata#iento de la #uestra con R!asa libre de !asa. @inal#ente, el A ! es (reci(itado adicionando acetato de sodio ' etanol al #edio AM1B. iagra#a C. 5a e4aluacin de la concentracin del A ! se e$ect)a #idiendo la absorbancia en un es(ectro$ot#etro entre C11 ' .11 n# de longitud de onda. 5os %cidos nucleicos absorben luz 6V a CL1 n# A4er ane<o (ara considerar (urezaB. @inal#ente, la calidad del A ! se analiza (or electro$oresis.
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DIA/RAMA No 5 RLPBLRA DE 02< BACI02<? tratamiento en#im'tico 5a4ar / gra#o de bacterias en bu$$er 2E A2RI* /#M E 2A /1#MB (8 -.1 resus(ender en /, #l de 2E
Centri$ugar a C,11 gD/1 #in Preci(itado AbacteriasB Resus(ender en 2E Adicionar lisozi#a AC #gD#lB Agitar a .0eCDC3 Adicionar (roteinasa R C,1 #gD#l, L,eCD/3 ' * * /Q Centri$ugar AC,11 r(#D/1 #inB *obrenadante 8acer alicuotas de M11 l 7uardar a MeC Preci(itado AdescartarB *obrenadante AdescartarB
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DIA/RAMA No : EMBRACCINN O PLRI-ICACINN DE0 ADN DE0 M. tuberculosis 2o#ar una alicuota de #uestra resus(endida en 2E A(8 -.1B ' adicionar en (ro(orcin /&/ cloro$or#o"$enol saturado Centri$ugar AC,11 r(#D, #inB @ase acuosa Aac. nucleicoB E<traer con ter . a M 4eces Adicionar acetato de !a .M /D/1 4ol ' C., 4ol de etanol $ro Inter$ase AdescartarB @ase org%nica AdescartarB
Preci(itar a fC1eC A2oda la noc3e& 2. !.B
*obrenadante AdescartarB
Preci(itado& %cidos nucleicos Resus(ender en2E Agregar R!asa /#gD#l. Incubar a .0eCD/3 Retirar R!asa con e<traccin $enlica ' ter Re(reci(itar con etanol (uro Resus(ender A ! (uro en 2E (8 -.1 7uardar a MeC ' leer absorbancias
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: : Restriccin$ liga#n , empaGuetamiento Restriccin& el A ! del bacilo 'a (uri$icado se 3idroliza con la endonucleasa Eco +, A2abla /B. 5a digestin se lle4a a cabo en las condiciones reco#endadas (or el $abricante A,-B. !u#eral /.../.. ' iagra#a .A. 5a digestin del A ! se #onitorea #ediante la tcnica de electro$oresis en gel de agarosa al /Q, la cual se basa en el 3ec3o de 9ue #olculas cargadas, co#o el A !, son ca(aces de #igrar cuando se colocan en un ca#(o elctrico A//B. 5a electro$oresis 3ec3a en gel de agarosa se usa (ara resol4er #olculas desde (ocos cientos de (ares de bases 3asta a(ro<i#ada#ente C1.111 (b. 5a 4elocidad de #igracin de una #uestra colocada en un gel de agarosa, est% deter#inada (or su (eso #olecular, la concentracin de la agarosa, la con$or#acin del A ! ' la concentracin del bro#uro de etidio AM1B. 0iga#n& los $rag#entos de A ! del bacilo obtenidos en el (roceso anterior se ligan a los brazos del A ! 4ector de e<(resin la#bda gt"// A+B, en (resencia de la enzi#a 2M ligasa, en (ro(orcin /&C ' /&M AM1B. 5a reaccin se lle4a a cabo a te#(eratura a#biente, durante toda una noc3eI los reacti4os utilizados en ella ' sus 4ol)#enes a(arecen en el iagra#a .B. EmpaGuetamiento& una 4ez ligados los brazos del 4ector el $ago la#bda gt"//, con los insertos de A ! del bacilo, se e$ect)a el e#(a9ueta#iento, #ediante autoensa#bla=e in vitro, seg)n el #todo 23ole ALMB, iagra#a .C. Para el e#(a9ueta#iento se #ezcla el A ! reco#binado con un e<tracto de (rotenas de la cabeza ' uno de (rotenas de la cola, en las concentraciones reco#endadas (or la casa distribuidora. Estos e<tractos de e#(a9ueta#iento 4ienen 'a listos (ara ser usados, ' son (re(arados a (artir de clulas de E. coli #utadas, 9ue contienen el $ago la#bda lisogenizado ' #utado AM1, M.B. DIA/RAMA No 8 RE<BRICCINN 0I/AINN O EMPA6LEBAMIENB2 DE0 ADN Mycobacterium tuberculosis A RE<BRICCINN
Agregar /6.E.D#l de Eco +, a l #g de A ! de &. tuberculosis Incubar a .0eCD/3 Electro$oresis en gel de agarosa al /Q Retirar la enzi#a con e<traccin @enlica ' ter
0I/AINN
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Bratamientos E Agua lF Muestras C2NBR20 EN<AO2 E5?;F EN<AO2 E5?:F

!ota&
Bampn ABP Bra#os de liga#n 5=mM 5=M =3 5= 5= 5= 5= 5= 5= 5= 5=
ADN B; ADN Inserto BBC 0igasa
33 89 89
-:3 :3
5= 5= 5=
5= ---
Concentracin de A ! de 2BC& 1.C #gD#l. Concentracin de brazos del 4ector& /gD#l
EMPA6LEBAMIENB2
Adicionar al e<tracto de cabezas el A ! ligado Adicionar el e<tracto de colas ' de=ar en re(oso (or C3
: 8 Culti(o e infeccin del )ospedero , plateo de la genoteca *e utiliza co#o 3os(edero bacterias de E. coli ce(as O/1-- ' O/1+1 APro#ega BiotecB A,/B, cu'os (rinci(ales #arcadores genticos a(arecen en las 2ablas M, , ' L A0M, /LB. 5os culti4os se realizan en condiciones de esterilidad, siguiendo el (rotocolo descrito en el iagra#a M. DIA/RAMA No ; CL0BI!2 DE 0A< BACBERIA< .2<PEDERA< E. coli O5=KK$ O5=@= *e#brar una colonia de bacterias en /11 #l de 5B"agar"A#( A,1#gD#lB, Mg*KM /#M, #altosa 1.CQ
Incubar a .0 eC. 2.!. Recu(erar (or centri$ugacin a .111 r(#D/1#in ' resus(ender /D/1 4ol. Mg*KM /1#M
7uardar a MeC
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En la construccin de la genoteca, la in$eccin se realiza adicionando /,1 l de solucin de bacterias E. coli O/1+1 A K. _ 1.LB, de $agos obtenidos en la reaccin de e#(a9ueta#ientoI se de=a en re(oso /, a C1 #inutos, tie#(o en el 9ue los 4irus se adsorben a la (ared celular de las bacterias. A la #ezcla de $agos ' de bacterias se a;aden ,1 l del sustrato cro#ognico :"gal ' C1 l del inductor IP27, en . #l del #edio 2o("agarosa al 1.0Q. 5a #ezcla anterior se sie#bra en C1 ca=as de (etri de 5 agar"A#(icilina ,1 gD#l, con un control de bacterias E. coli O/1+1. A (artir de las (lacas de lisis $or#adas se 3alla el (orcenta=e de reco#binantes, ' se deter#ina el n)#ero de unidades $or#adoras de (laca (or #l Au#pD#lB, utilizando la siguiente ecuacin& u#pD#l _ !)#ero de (lacas de lisis : dilucin : /D4ol se#brado.AM1B Consultar ane<o (ara detalles adicionales. Para cosec3ar los $agos, cu'o con=unto debe contener el geno#a del bacilo, se a;aden a cada ca=a , #l del ta#(n 2M7 A2ris" Magnesio"7elatinaB, se de=a en re(oso (or cinco 3oras ' se recolectan adicionando /11 l de cloro$or#o (uro (or #l. con el $in de e4itar la (resencia de conta#inantes. El iagra#a , (resenta el (rotocolo descrito. DIA/RAMA No 3 IN-ECCINN DE0 .2<PEDER2 E. coli O5=@= O C2<EC.A DE 02< -A/2< REC2MBINAD2< Culti4ar E. coli O/1+1 en 5B"a#(icilina Mezclar las bacterias, los $agos, el :"gal, el IP27 ' el >to(? agarosa *e#brar en ca=as con 5B"agar"A#( la #ezcla anterior e incubar a .0eC 2.!. 8allar (orcenta=e de reco#binantes ' u#pD#l Resus(ender los $agos en 2M7 ^ cloro$or#o 7uardar a MeC
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5a (robabilidad de tener una secuencia de inters re(resentada en la genoteca se deter#ina a(licando la siguiente $r#ula& $ / 0n102p3/0n102#3 onde p es la (robabilidad, # es la (ro(orcin $raccional de A ! de inters en un si#(le reco#binante, ' $ es el n)#ero necesario de reco#binantes (ara encontrar el inserto AM1, /LB. Ver el ane<o (ara una a(licacin (r%ctica del uso de $. : ; Amplificacin , titulacin , almacenamiento de la biblioteca genmica Para a#(li$icar la genoteca, es decir, au#entar el n)#ero de $agos reco#binantes, se culti4a la ce(a E. coli O/1--, iagra#a M. *e in$ectan /,1 l de bacterias con ,, /1 ' ,1 l de solucin de $agos reco#binados de la genoteca original, en L ca=as de 5agar" A#(icilina, (ara deter#inar la concentracin a la cual 3a' con$luencia de (lacas de lisis. 5uego se sie#bran en C1 ca=as de 5agar"A#(icilina, utilizando /1 l de la solucin de $agos reco#binados, siguiendo el (rocedi#iento del iagra#a ,. 6na 4ez $or#adas las (lacas de lisis se cosec3an los $agos en 2M7 ' cloro$or#o. Para titular la genoteca, es decir, deter#inar la concentracin (ti#a de $agos 9ue (roducen un n)#ero adecuado de (lacas de lisis en cada ca=a, se to#an /1 l de $agos ' se 3ace una dilucin /1"C en 2M7, a (artir de la cual se 3acen diluciones seriadas. Cada dilucin se sie#bra en una ca=a de 5agar"A#(icilina, se incuba /C 3oras a .0eC ' se calcula las u$(D#l. iagra#a L. DIA/RAMA No 9 AMP0I-ICACINN O BIBL0ACINN DE 0A /EN2BECA Culti4ar el 3os(edero E. coli O/1-In$ectar /,1 #l de bacterias con /1 #l de $agos. *e#brar C1 ca=as de 5B"Agar"A#( Recolectar los $agos en 2M7 ^ cloro$or#o 2o#ar ++1 l de 2M7 ' a;adir /1l de $agos Adilucin /1"CB A (artir de la dilucin /1"C 3acer diluciones de /1"M, /1"L, /1"-, /1"/1 en 2M7 *e#brar cada dilucin en un (lato de 5B"agar"A#( e incubar a .0eC 2.!. Contar las (lacas de lisis ' deter#inar u#pD#l.
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Es de anotar 9ue si el ob=eti4o de la construccin de la genoteca es buscar un gen es(ec$ico, no es aconse=able a#(li$icar la genoteca, 'a 9ue en el (roceso de a#(li$icacin (ueden (erderse algunos insertosI no obstante, la a#(li$icacin en el 3os(edero O/1-- reduce estos (roble#as (uesto 9ue su siste#a +ec est% #utado. 5as genotecas a#(li$icadas (ueden #antener un alto ttulo (or 4arios a;os, co#o $uente (ara la b)s9ueda de genes AM., ,.B.
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Captulo 8 CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC <ntesis de sondas de oligonucletidos
A (artir de las secuencias de a#ino%cidos, corres(ondientes a la (arte a#inoter#inal de las (rotenas M2P"/MR ' M2P"M1R, se (ro(onen secuencias de oligodeo<inucletidos del ti(o redundante, con (re$erencia en la tercera (osicin (or C7 Adado el codn (re$erencia del organis#oB, las cuelas son utilizadas (ara buscar la secuencia de inters dentro de la genoteca, !u#eral /...C././. 5a sntesis auto#%tica se realiza en un sintetizador de oligos. Para la sntesis se e#(lea el #todo 9u#ico en $ase slida de $os$ito"triester, seg)n ItaGura ' R3orana ACLB. 5as siguientes son algunos e=e#(los de secuencias de oligonucletidos sintetizadas en el laboratorio& <onda MBP-5;J? !8C"Ala"5's"Val"Asn"Ile"5's"Pro"... .[ fC77"22C"CA7"227"2A7"22C"77. C C !)#ero de bases 7C& /. A,,Q de la secuenciaB. !)#ero de bases A2& /1 AM,Q de la secuenciaB. Redundancia& M. 5ongitud& C1 #er. <onda MBP-;=J? !8C"Pro"2r("Ile"5eu"5's"7l'"5's"Ala"5's"... .[ f77C"ACC"2A7"7A7"22C"CC7"22C"7C2"2. 7 C C !)#ero de bases 7C& /, AL,QB. !)#ero de bases A2& /1 A.,QB. Redundancia& -. 5ongitud& C, #er. urante la sntesis auto#%tica de sondas, cada aco(le de un nucletido i#(lica la e=ecucin de un ciclo 9ue en4uel4e los (asos de desblo9ueo, aco(le, blo9ueo de nucletidos no elongados ' o<idacin AM0B. @ig. C/. iagra#a 0. Este (roceso se re(ite 3asta 9ue las secuencias totales re9ueridas sean sintetizadas.
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-ig :5 CIC02 DE AC2P0E DE LN NLC0E2BID2 EN LNA <INBE<I< ALB2MABICA DE LNA <2NDA
2B1 1
DMT+
D(&.%$?/($
Ci#%$ -$+ '/#%(0*i,$
A#$-%(
B%$?/($
O2i,)#i0' 2B1 1 A#20
2B1
2B2
2B3
2B4
2B5
2B6
2B7
2B8
2B9
DMT+
<
C$'@('#i$'(&6 B' '/#%(0*i,$ 2 g+/-$ ?/( -+$*(g( %) .)&( g+/-$ ?/( -+$*(g( (% 8$&8)*$ &$-$+*( #$' (&-)#i),$+ 1 g+/-$ DMT+ DMT+A A#20A g+/-$ )#(*)*$
52
DIA/RAMA No 4 <ANBE<I< ALB2M+BICA DE 0A< <2NDA< Adicionar /#l de A C, CQD/#in 5a4ar con /#l C8CC/C ^ /#l An3drido actico Adicionar C11l de nucletido ' C11l tetrazolD/1#in DE<B026LE2 0A!AD2
AC2P0E
5a4ar con /#l de acetonitrilo Adicionar /#l de CAPDC#in 5a4ar con /#l de acetonitrilo Adicionar /#l de OodoD/#in 5a4ar con an3drido actico M"L 4eces E*B5KE6EK O E*A!C5AJE E 5A *K! A
0A!AD2 B026LE2 0A!AD2 2MIDACINN 0A!AD2
8 5 E(aluacin de la eficiencia de acople urante la sntesis, ' una 4ez $inalizada sta, se e4al)a la e$iciencia de aco(le, #ediante un #todo indirecto, (or el cual se deter#ina la cantidad del catin M,M["di#eto<itritil 9ue se libera durante el trata#iento con A C en cada ciclo. 5a cantidad de catin M2r liberado durante la detritilacin es directa#ente (ro(orcional al %rea ba=o la cur4a dada (or la unidad de control del a(arato, des(us de cada detritilacin. El a(arato #onitorea la absorbancia de la solucin anaran=ada de detritilacin a una longitud de onda de M.L n# A/+B. 5as e$iciencias de aco(le se esti#an (or co#(aracin de las %reas ba=o la cur4a de la detritilacin de los #is#os nucletidos ' no de di$erentes nucletidos, debido a 9ue las $or#as de las cur4as Aestrec3as o a#(liasB di$ieren entre A, 2, 7 ' C. 5as (endientes de estas lneas se co#(aran con las (endientes de cuatro lneas (atrn, cada una de las cuales corres(onde a una base con su (orcenta=e de e$iciencia. Ktra #anera de 3acer el c%lculo es a(licando las siguientes $r#ulas&
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E$iciencia de ensa#ble _ /1"log E$iciencia de aco(le _ /1"logDn (asos _ /1(endiente A/+B. 8 : Bratamiento post-sntesis Cada sonda sintetizada se desancla del so(orte, luego se (uri$ica (ri#ero (or electro$oresis en gel de (oliacrila#ida, ' luego (or cro#atogra$a en $ase re4ersaI des(us de esto se concentra, resus(ende ' $inal#ente se e4al)a su concentracin. El (roceso general (uede 4erse en la @ig.CC. 8 8 Desancla*e , desproteccin Puesto 9ue el oligonucletido sintetizado 9ueda unido al so(orte slido #ediante un (uente succinato al gru(o .[K8 del (ri#er nuclesido, ste debe ro#(erse (ara liberar la sonda #ediante una 3idrlisis con a#onaco concentrado. *i#ult%nea#ente, en esta reaccin se re#ue4en los gru(os a#ido de los gru(os a#ino de las bases 9ue (ueden reaccionar, ' los gru(os (rotectores del $s$oro AcianoetilB A/+, M0B. El (rotocolo a seguir en esta eta(a se describe en el iagra#a -. DIA/RAMA No K BRABAMIENB2 P2<B-<ANBE<I< DE 0A< <2NDA<$ DE<ANC0APE O DE<PR2BECCINN Colocar la colu#na en un e(endor$$ ' centri$ugar a C111 r(#D/#in la4ar colu#na con M11l a#oniaco conc. a C111 r(#D/#in 5le4ar la colu#na a L,eCD/L3 Centri$ugar a C111 r(#D/#in 2o#ar sobrenadante Aa#oniaco ^ sondaB Agregar M11#l a#oniaco a la colu#na. Centri$ugar a C111 r(#D/#in Concentrar la sonda ' resus(enderla en ,1 l $or#a#ida iluir la sonda /&/111 con 2RI* ,1#M Medir concentracin ACL1n#B
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8 ; Aislamiento de la sonda mediante electroforesis en gel de poliacrilamida EPA/EF *e usa un gel de (oliacrila#ida (ara se(arar las sondas, con la siguiente co#(osicin& acrila#ida A.1QB, bisacrila#ida A1.-QB, urea A/C.L grB, 2BE /:, (ersul$ato de a#onio A1..QB ' 2EME A/, lB, (ara un 4olu#en $inal de .1 #l. *e sie#bran las sondas M2P"/MR ' M2P"M1R A .1. _ ,.1B, con un 4olu#en igual a . KDc# de longitud del diente de sie#bra, es decir, ,.1 l de sonda M2P"M1R. 5uego se corre a C11 4oltios durante cuatro 3oras. Para 4isualizar las bandas de las secuencias, colocar el gel sobre una l%#ina delgada de cro#atogra$a de slica i#(regnada con $luorescena ' a(licar luz 6VI las bandas a(arecen co#o so#bras oscuras contra el $ondo $luorescente de la l%#inaI estas %reas se aslan cortando el gel ' se di4iden en (e9ue;os trozos, los cuales se elu'en en ta#(n 2E A(8 -.1B ' se incuban toda la noc3e en agitacin continua. 5as sondas se recu(eran con centri$ugaciones a .,111 r(#D/1 #in. *e #ide la concentracin ' luego se so#eter a (uri$icacin #ediante cro#atogra$a en $ase re4ersa AMLB. iagra#a +.
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-ig :: BRABAMIENB2 P2<B-<INBE<I< DE 0A <2NDA B

B B B B B
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D(&.%$?/($ DCA
DMT+
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DMT+ D(&)'#%)B( C ,(&-+$*(##i0' #$' NH4OH
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Ai&%)5i('*$ -$+ PA"!
P/+i8i#)#i0' -$+ #+$5)*$g+)8<)
!@)%/)#i0' ,( #$'#('*+)#i0'
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DIA/RAMA No @ BRABAMIENB2 P2<B-<ANBE<I< DE PLRI-ICACINN DE 0A< <2NDA< *e#brar la sonda en gel de (olicrila#ida Correr electro$oresis a C11 4DC3 Aisla#iento (or PA7E Retirar la sonda del gel Resus(ender en 2E A(8 -.1B 5eer absorbancia a CL1n# 5a4ar colu#na de *EP"PAR con acetonitrilo. Acti4arla con #etanol (uro ' agua
@iltrar la #ezcla de sonda ' Pasarla (or la colu#na Cro#atogra$a en @ase re4ersa Recoger tres $racciones con #etanol L1Q
Concentrar ' resus(ender en 2E A(8 -.1B Medir concentracin
8 3 Purificacin por cromatografa de fase re(ersa 5a (uri$icacin de los K!* se e$ect)a 3aciendo (asar la #ezcla resultado del (roceso anterior a tra4s de una colu#na de *EP"PAR, la cual es un (e9ue;o cilindro 9ue contiene una slica gel C/- @ig. CC A//B. Cuando el oligonucletido sinttico, el cual se encuentra en una #ezcla electroltica acuosa, (asa a tra4s de la colu#na, el oligonucletido es retenido #ientras las sales acuosas (asan a tra4s de ella A.CB. Cuando se usan sol4entes (olares, los co#(onentes #enos (olares de la #ezcla se retienen (or absorcin sobre la #atriz de la colu#na #ientras 9ue los co#(onentes #%s (olares son eludos AMCB. El iagra#a + #uestra el (rotocolo seguido en esta $ase. 8 9 Radiomarca*e en#im'tico$ medicin de la radiacti(idad , determinacin de la acti(idad especfica de las sondas
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Radio#arca=e enzi#%tico& una 4ez (uri$icadas las sondas, estas son #arcadas utilizando `.CPa A2P ' la enzi#a 2M (olinucletido Ginasa A2M"P!RB, 9ue cataliza la trans$erencia del $s$oro .CP del A2P al gru(o ,[K8 del A ! o R!A. 5a reaccin general es& 2M"P!R A ! ,[K8 """""""""""""""""""""""""""g A ! ,[" .CP ^ A P `.CPa A2P, Mg^^ 22 Por e=e#(lo& ... (C"(7"(C",[K8 ^ A((.C( """""""""""g... (C"(7"(C".C( ^ A(( ^ (i AM1B. Para la reaccin de radio#arca=e se to#an /11 ng de sonda (or cada C11 Ci de A2P .C, los cuales se agregan a 0 l de ta#(n Ginasa, C l de la enzi#a 2M Ginasa, /1: ' M1 l de agua. 5a reaccin se lle4a a cabo durante una 3ora a .0eC. Medicin de la radiacti4idad de las sondas& la radiacti4idad de las sondas se deter#ina con un contador de centelleo l9uido A(or e=e#(lo& un BeG#an #odelo 5* 0111B, el cual #ide el n)#ero de (artculas Beta detectadas (or #inuto Ac(#B A//B. Esta #edicin se deter#ina (or di$erencia entre las c(# obtenidas a (artir de una #uestra de la sonda ' las c(# obtenidas des(us de (reci(itarla con %cido tricloroactico A2CAB AM1B. El (rotocolo (uede 4erse en el iagra#a /1. DIA/RAMA No 5= RADI2MARCAPE O MEDICINN DE 0A RADIACBI!IDAD DE 0A< <2NDA< Adicionar sonda, ta#(n Rinasa, 2M Rinasa /1:, A2P.C ' agua Incubar a .0eCD/3 iluir sonda #arcada en agua /&/111 2o#ar C1#l sonda diluida ^ .#l bio$luor 2o#ar C1#l sonda diluida ^ .#l 2CA Preci(itar en (a(el de nitrocelulosa Medir c(# en contador de centelleo Concentrar la sondaI resus(ender en 2E A(8 -.1B Medir concentracin CL1n#
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eter#inacin de la acti4idad es(ec$ica de las sondas& la acti4idad es(ec$ica de las sondas, de$inida co#o la cantidad de radiacti4idad (or #ol de co#(uesto.
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Captulo ; CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC Calidad de la genoteca e identificacin del fragmento de ADN-Recombinante
Para e4aluar la calidad de la genoteca gen#ica se asla el A ! clonado del 4ector ' se trata con 4arias enzi#as de restriccin, seg)n el #todo de *te(3en 5. AL1B. El A ! a3ora digerido se analiza en un gel de agarosa, se denatura ' se trans$iere a (a(el de nitrocelulosa con el $in de 3ibridizarlo con las sondas de K!*, (re4ia#ente radio#arcadasI $inal#ente, la identi$icacin de $rag#entos co#(le#entarios con las sondas se 3ace con la tcnica de autorradiogra$a AM1B. @ig.C.. ; 5 E>traccin del ADN clonado del fago 5a e<traccin del A ! clonado de los $agos reco#binantes se e$ect)a #ediante un lisado a gran escala de E. coli ce(a O/1+1. Este #todo consiste en 3acer un culti4o de las bacterias 3os(edero, in$ectarlas con los $agos de la genoteca, ' una 4ez #ulti(licado el n)#ero de ellos, e<traerlos #ediante sedi#entacin (or gradiente en cloruro de cesioI el A ! de los $agos se e<trae (or trata#iento con $or#a#ida. iagra#a //. DIA/RAMA No 55 AI<0AMIENB2 DE -A/2< A PARBIR DE 0A /EN2BECA O EMBRACCINN DE0 ADN REC2MBINANBE Culti4ar E. coli O/1+1 en 0,1#l de 5B"a#(. In$ectar las clulas con $agos de la genoteca en (ro(orcin /11&/ Ade clulas ' $agosB Agregar cloro$or#o 4D4 ' !aCl 1.,M 2.!.DMeC Agregar PE7"L111. Incubar 2.!.DMeC. Centri$ugar a ,111 r(#D/, #in. Resus(ender $agos en 2M7 8acer e<traccin cloro$or#o 4D4 8acer gradiente discontinuo de colc3ones de CsCl Adensidad /.., /.,, /.0 gD#lB Centri$ugar a .,111 r(#DC.,3DMeC Arotor *S,/B E<traer banda de $ago ' 3acer gradiente continuo /.,gD#l /C3DMeC escartar sobrenadante
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Retirar la banda de $agos ' agregar /D/1 de $or#a#ida C3D2 a#biente Agregar / 4olu#en de agua ' L 4ol)#enes de etanol. *edi#entar el A ! en #icrocentr$uga durante C#in. 5a4ar el (ellet con etanol al 01Q Resus(ender el (reci(itado en 2E (8 -.1. 7uardar el A ! reco#binado a MeC. ; : Restriccin , electroforesis El A ! reco#binado se 3idroliza con las enzi#as de restriccin Eco +,, 4ind ,,, ' 5st ,, utilizando las condiciones de reaccin obser4adas en la 2abla / A,0B. 5a digestin se #onitorea (or #edio de una electro$oresis en gel de agarosa. El A ! a(arece se(arado a lo largo del gel de agarosa de acuerdo con su (eso #olecular, lo cual nos (er#ite analizar el co#(orta#iento del A ! de &. tuberculosis clonado $rente a cada enzi#a ' deter#inar si la genoteca est% bien re(resentada. ; 8 Bransferencia del ADN digerido al papel de nitrocelulosa EQ<out)ern blottingRF Para identi$icar el $rag#ento de inters en la genoteca se usa la tcnica U*out3ern blotU, lla#ada as (or EdVard *out3ern, 9uien la desarroll en /+0,. 5a tcnica consiste en desnaturalizar el A ! en el gel ' trans$erirlo del gel a (a(el de nitrocelulosa, conser4ando las (osiciones relati4as de los $rag#entos (or accin de ca(ilaridad A/., ,+B. El (roceso se realiza so#etiendo el gel a una solucin desnaturalizante A!aK8 1.,M, !aCl 1.LMB una 3ora a te#(eratura a#bienteI luego, el gel se (asa a una solucin neutralizante A2ris /M, !aCl 1.LMB una 3ora a te#(eratura a#bienteI des(us se coloca sobre un 4idrio re4estido con (a(el absorbente 3u#edecido con solucin salina de citrato **C C1:I el con=unto se coloca sobre una cubeta con **C C1: ACB. *obre el gel se coloca un (a(el de nitrocelulosa, (a(el absorbente ' (esoI la trans$erencia dura entre /L a CM 3oras, des(us de la cual se $i=a el A ! al $iltro con incubacin a -1eC, dos 3oras al 4aco. iagra#a /C.
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-ig :8 E!A0LACINN DE 0A CA0IDAD DE 0A 0IBRERIA
B)#*(+i)&
Li.+(+<)
Li&),$ ,( %) %i.+(+<)
"+),i('*( (' C&C%
F)g$& +(#)5.i)'*(& ,( L) %i.+(+<)
!2*+)##i0' ,( ADN > +(&*+i##i0'
A';%i&i& -$+ (%(#*+$8$+(&i& > ,(&')*/+)%iD)#i0' ,(% DNA
T+)'&8(+('#i) ,( ADN ) -)-(% N.C. E*i-$ &$/*7(+'F
FiB)#i0' ,(% DNA )% -)-(% ,( N.C.
Hi.+i,iD)#i0'
S$',) R),i$5)+#),)
L)@),$& C )/*$++),i$g+)8i)
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DIA/RAMA No 5: RE<BRICCINN DE0 ADN REC2MBINAD2 O BRAN<-ERENCIA Qtipo <out)ernR igerir el A ! reco#binado con Eco +,, 4ind ,,,, "am 4, ' 5st , *e(arar $rag#entos #ediante electro$oresis en gel de agarosa esnaturalizar el A ! A1.,M, !aCl 1.LMB 2. A.D/3 !eutralizar el A ! A2RI* /M, !aCl 1.LMB 2. A.D/3 8acer el #onta=e del gel (ara trans$erencia >ti(o *out3ern? 2rans$erirDCM3. e=ar el $iltro de nitrocelulosa a -1eCDC3 Colocar el $iltro en solucin (re3ibridizadora MCeCD/3 Colocar el $iltro en solucin 3ibridizadora en un rango de te#(eratura de MC a L,eCD/C a /L3 5a4ar en las condiciones descritas 8acer #onta=e de autorradiogra$a. Colocar (elcula en casete a fC1eCDM"M-3 ; ; .ibridi#acin Q<out)ernR , Qdot blottingR El $iltro de nitrocelulosa con el A ! #onocatenario $i=o a l, se e<(one al oligonucletido sinttico radio#arcado en solucin. En esta eta(a los $rag#entos del A ! de inters, co#(le#entarios con el oligonucletido sinttico colisionan ' se a(arean $or#ando un $rag#ento bicatenario 3brido. !u#eral /...C./.C. Para lle4ar a cabo la 3ibridizacin, el $iltro se coloca en una solucin (re3ibridizadora A**C L:, (iro$os$ato de sodio 1.1,Q, solucin en3artZs ,:, solucin A ! es(er#a de sal#n 1./Q, ' * * ,QB a MCeC durante una 3ora. es(us, se lle4a el $iltro a solucin 3ibridizadora A**C L:, (iro$os$ato de sodio 1.1,Q, solucin en3artZs /1:, ' una concentracin de C ng de sondaD#l de solucin 3ibridizadoraBI se ensa'an condiciones de te#(eratura ' duracin de 3ibridizacin, to#ando (ri#ero una te#(eratura de MCeC ' /C 3oras de duracin de reaccinI luego se to#a un rango de te#(eratura entre MC ' L,eC durante /C a /L 3oras AM,B, iagra#a /C. Para re#o4er la sonda unida ines(ec$ica#ente ' otros arte$actos, se so#ete el $iltro a la4ados cu'as condiciones ser%n ensa'adas 4ariando te#(eratura ' astringenciaI (ara deter#inar las
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#e=ores condiciones de la4ado se obser4a el e$ecto de las concentraciones de la **C ' la te#(eratura 3aciendo cinco la4ados de #a'or a #enor astringencia Adis#inu'endo la concentracin de salB durante /, #inutos cada uno ' al 1./Q de * *. 5as concentraciones de la solucin **C ' las te#(eraturas ensa'adas (ueden 4ariar de(endiendo del -m de la sonda utilizada. & **C C: a /,eC **C /: a /,eC **C /: a .0eC **C /: a .0eC **C 1.,: a A-m " ,eCB Para el >dot blot? se sie#bran >gotas? de los A ! a di$erentes concentraciones directa#ente sobre (a(el de nitrocelulosa, ' se e$ect)a el trata#iento de (re3ibridizacin e 3ibridizacin con las sondas radio#arcadas, siguiendo la #is#a #etodologa citada en el nu#eral anterior. *e 3acen dos ti(os de trata#iento& en uno se to#a C.1 g, /.1 g ' 1., g de A ! de los (l%s#idos (6C"/-, (7EM. ' (BR.CCI ' las #is#as concentraciones (ara A ! de la#bda gt"//, gen#ico ' de A ! control. En el otro trata#iento se to#a A ! gen#ico del bacilo usando las siguientes concentraciones en gs& ..1, /.,, 1.0, 1.., 1./ ' 1.10. ; 3 Autorradiografa @inal#ente, (ara detectar las se;ales (ositi4as de los $rag#entos co#(le#entarios con las sondas de K!*, se 3ace la autorradiogra$a, la cual se basa en 9ue una e#isin radiacti4a es detectada (or una #olcula sensible, dando una se;al de (lata (reci(itada. Para este (rocedi#iento se sigue el #todo de Maniatis AM1B ' se usan tie#(os de e<(osicin entre M ' M- 3oras seg)n el caso.
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Captulo 3 CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC Rastreo de clonos de protenas recombinantes mediante el uso de sueros policlonales
Con el ob=eto de encontrar el clon de inters es necesario contar con un suero rico en sondas de anticuer(os (oliclonales dirigidas contra la (rotena de inters. Estos sueros son (roducidos en cone=os (re4io aisla#iento de la (rotena #ediante #todos electro$orticos o cro#atogr%$icos. 6na 4ez construida la genoteca en un 4ector de e<(resin, la (rotena o antgeno de inters debe ser inducida en la genoteca gen#ica o de A !c (ara luego e$ectuar la seleccin con los sueros de cone=o Anti (rotena : G a, (re(arados en cone=os. !u#eral /...C.C ' @ig. CM. 3 5 Antisuero policlonal , adsorcin con e>tracto de E. coli 5os anticuer(os (oliclonales se 3an utilizado (ara aislar genes usando genotecas con A !c o A ! gen#ico de organis#os con geno#as 9ue 4an en co#(le=idad desde bacterias a #a#$eros. 5os anticuer(os (oliclonales (ueden tener una 4enta=a sobre los anticuer(os #onoclonales cuando son usados co#o sondas, debido a 9ue la (oblacin #ulticlonal es rara#ente restringida al reconoci#iento de una si#(le e(to(e A0CB. Co#o es de es(erar, altos ttulos de anticuer(os (roducen #e=ores se;ales 9ue ba=os ttulos de anticuer(os. Es razonable asu#ir 9ue anticuer(os 9ue (roducen buenas se;ales en una trans$erencia ti(o >Sestern? Ao Sestern blotB (roducir%n buenas se;ales en los (rocedi#ientos de b)s9ueda de genes en la#bda gt"//. 5os anticuer(os (oliclonales contienen a #enudo co#(onentes los cuales se unen a antgenos (roducidos (or E. coli. A $in de e4itar el alto ruido de $ondo Ao bacGgroundB de se;ales ines(ec$icas (roducidas (or la acti4idad de unin, deben absorberse los sueros (ara re#o4er los anticuer(os ines(ec$icos. Esto se lle4a a cabo incubando el suero con e<tractos o roncados de E. coliI as, los anticuer(os anti"E. coli son re#o4idos A/LB. *e culti4a el 3os(edero E. coli O/1+1 en /11 #l de 5a#(icilina, ba=o las condiciones consideradas anterior#ente A4er iagra#a /.B. 5as clulas crecidas AK . 1.LB se lle4an a /1 litros de 5a#(icilina ' se crecen toda la noc3eI se recu(eran (or centri$ugacin a ,111 r(# durante M1 #in. El (reci(itado de clulas obtenidas del culti4o se resus(ende en /11 #l de aguaI la #ezcla se 3ier4e seg)n las condiciones 9ue se #uestran en el iagra#a /C. 5a solucin de e<tracto de (rotenas de E. coli obtenida se alicuota en 4ol)#enes de C #l ' se guard a fC1eC. A cada uno de los sueros de cone=o Anti"M2P /MR. Anti"M2P .MG, Anti"M2P M1R ' Anti"M2P /0-R se adiciona una solucin concentrada de (rotenas de E. coli, con el $in de re#o4er anticuer(os es(ec$icos Anti"E. coli. iagra#a /..
-ig :;
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DIA/RAMA No 5: RE<BRICCINN DE0 ADN REC2MBINAD2 O BRAN<-ERENCIA Qtipo <out)ernR igerir el A ! reco#binado con Eco +,, 4ind ,,,, "am 4, ' 5st , *e(arar $rag#entos #ediante electro$oresis en gel de agarosa esnaturalizar el A ! A1.,M, !aCl 1.LMB 2. A.D/3 !eutralizar el A ! A2RI* /M, !aCl 1.LMB 2. A.D/3 8acer el #onta=e del gel (ara trans$erencia >ti(o *out3ern? 2rans$erirDCM3. e=ar el $iltro de nitrocelulosa a -1eCDC3 Colocar el $iltro en solucin (re3ibridizadora MCeCD/3 Colocar el $iltro en solucin 3ibridizadora en un rango de te#(eratura de MC a L,eCD/C a /L3 5a4ar en las condiciones descritas 8acer #onta=e de autorradiogra$a. Colocar (elcula en casete a fC1eCDM"M-3
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DIA/RAMA No 58 RA<BRE2 DE0 C02N DENBR2 DE 0A /EN2BECA C2N ANBICLERP2< P20IC02NA0E< AD<2RCINN DE <LER2< ANBI-Mycobacterium sp Culti4ar el 3os(edero E. coli O/1+1 en /11 #l de 5B a#(. ,1 #gD#l. Maltosa 1.CQ ' Mg*KM /#M. .0eC 2.!. Agregar clulas crecidas a /1 5 de 5B. Culti4ar a .0eC 2. !. ' cosec3ar clulas con centri$ugacin a ,111 r(#DM1 #in. Resus(ender el (ellet en /11 #l de agua. 8er4ir D.1 #in. Alicuotar en 4ol)#enes de C #l. 7uardar a fC1eC. 2o#ar cada alicuota de (rotenas de E. coli ^ C #l suero anti"M2P Adilucin /&,1B ^ +- #5 bu$$er B*A A2RI*"8C/ ,1#M. (8 0.,, !aCl /,1 #M ^ B*A .Q (D4B E<(oner suero ^ C #l de (rotena E. coli /3DMeC Centri$ugar ,111 r(#DC1 #in. *obrenadante 5le4ar el suero a MeC 3 : Induccin de antgenos 5a (roduccin de antgenos de los $agos reco#binantes se induce #ediante la accin del Iso(ro(il tiogalacto(iransido AIP27B, (ara lo cual se in$ecta el 3os(edero E. coli O/1+1 en (lacas de agar utilizando ,11 (lacas de lisis (or ca=a. *e incuban las (lacas a MCeC con el $in de #antener inacti4o el re(resor ter#osensible CI -,0 del 4ector ' acelerar la $ase ltica. !u#eral C.M.C. A las cuatro 3oras a(ro<i#ada#ente, cada (laca de culti4o se cubre con un $iltro de nitrocelulosa (re4ia#ente 3u#edecido con IP27 ' se incuba a .0eC, con el $in de inducir la (roduccin de los antgenos 9ue nos interesan ' acti4ar el re(resor CI -,0 (ara retardar la $ase ltica, con lo 9ue se (rolonga la re(roduccin del antgeno 9ue nos interesa. iagra#a /M. !o obstante (ara la induccin de (rotenas se reco#ienda subclonar el $rag#ento en un (l%s#ido de e<(resin (ara inducir la sntesis de (rotena A4er ane<oB. Pellet descartar
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DIA/RAMA No 5; RA<BRE2 DE0 C02N DENBR2 DE 0A /EN2BECA C2N ANBICLERP2< P20IC02NA0E< INDLCCINN DE EMPRE<INN DE ANBA/EN2< *e#brar el 3os(edero E. coli O/1+1 en ,11 (lacasDca=a de 5B"agar"a#(. a(ro<. Incubar a MCeCDM3 Colocar sobre cada (lato un $iltro de nitrocelulosa (re4ia#ente 3u#edecido con IP27 A/1 #MB. Incubar a .0eCD,3 Retirar los $iltros del (lato, la4ar A2B*"2Veen 1.1,QBD/, #in. E<(oner cada $iltro a solucin blo9ueadora& 2B*"gelatina /Q A2B*& 2RI* C1 #M, !aCl 1.,0 MB E<(oner cada $iltro a cada suero adsorbido /3DMeC. 5a4ar en cada (aso con 2B*2 1.1,Q E<(oner cada $iltro a Ig7"$os$atasa alcalina de cone=o Adil. /&/111B C3 2. A. 5a4ar con 2B*2 M 4ecesD/, #in. E<(oner a solucin re4eladora (8 +.MD.0eCD, #in. etectar ' aislar (osibles clonos. Re(etir el (roceso, so#etiendo cada clon a un suero (or se(arado 3 8 E>posicin de los antgenos del microorganismo a los antisueros Cada uno de los $iltros se la4a con 2B*2 al 1.1,Q ' se blo9uea con gelatina (ara e4itar reacciones ines(ec$icas. 5os $iltros 'a blo9ueados se tratan con cada antisuero durante una 3oras (ara $a4orecer la reaccin antgeno"anticuer(o. Posterior#ente, los $iltros se e<(onen al con=ugado Anti"Ig7 $os$atasa alcalina en una dilucin de /&/111 en 2B*2 al 1.1,Q durante una 3ora ' a te#(eratura a#biente. iagra#a /M. 3 ; Re(elado @inal#ente, los $iltros se e<(onen a un bu$$er de re4elado A2ris 1.1C M, !aCl 1.1C M, MgClC , #MB (8 de +.M ' a .0eC. Kbtenidas las se;ales, se aislan las (osibles (ositi4as del (lato de agar ' se re(ite el ciclo, 3asta encontrar el clon 4erdadero ' (uro. iagra#a /M.
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Captulo 9 CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC E>presin , purificacin de las protenas recombinantes clonadas
9 5 <ubclona*e en pl'smidos pBlue<cript El (l%s#ido (B* es un 4ector de e<(resin, )til (ara transcri(cin, e<(resin ' secuenciacin de $rag#entos de A ! subclonados. 9 : Escisin in vivo usando el sistema E>AssistS<20R El siste#a E<AssistD*K5R esta dise;ado (ara (er#itir la escisin e$iciente del $ag#ido (B* *RA"B a (artir del 4ector la#bda PAP II, e4itando los (roble#as asociados con la co"in$eccin del $ago a'udador. El $ago a'udador E<Assist contiene una #utacin %#bar 9ue i#(ide la re(licacin del geno#a del $ago en una ce(a E. coli no su(resora tal co#o las clulas *K5R. Esto (er#ite slo la escisin del $ag#ido (ara re(licarse en el 3os(edero, re#o4iendo la (osibilidad de coin$eccin del $ago a'udador E<Assist. El $ago a'udador E<Assist no (uede re(licarse en la ce(a *K5R ' no es reco#endado (ara el (rocedi#iento de recu(eracin de banda si#(le. iagra#a /,. DIA/RAMA No 53 A (artir de una genoteca a#(li$icada, (i9ue una (laca de inters. 2rans$erir a ,11 l de ta#(n *M ^ C1 l de cloro$or#o. Vorte< e incubar / " C 3 D 2. A. o 2. !.DMeC AEste stocG de $agos es estable (or un a;o a MeCB Co#binar en un tubo cnico de ,1 #l& C11 l de clulas :5/"Blue MR@\a K L11 _ /.1 100 l del stocG de $agos (conteniendo g /1, (artculas de $agosB 1 l de $ago a'udador E<Assist Ag/:/1L ($uD#lB Incubar esta #ezcla a .0eCD/,#in.
Adicionar . #l de #edio C: O2 e incubarDC"C., 3D.0eCDagitacin
Calentar el tubo a 01eCDC1 #in, luego agitarloD/, #inDM111 < g
ecantar el sobrenadante en un tubo estril. Este stocG contiene el (l%s#ido e#(acado co#o una (artcula de $ago $ila#entosa ' (uede ser al#acenadoDMeCD/"C #eses.
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*e#brar el $ag#ido rescatado. Adicionar C11l de clulas *KR5 AK L11 _ /.1B a dos tubos de /.5 l. Adicionar /.1 l de stocG de $agos del (aso , sobre un tubo ' ,1l del stocG de $agos a otro tubo. Incubar los tubos a .0eCD/,#in.
*e#brar /11 l de cada tubo en (latos de 5B"a#( A,1gD#lB e incubar a .0eC 2. !. 5as colonias a(arecen sobre los (latos 9ue contienen el $ag#ido de doble banda (B* *RA"B con el inserto de A ! clonado. 5as bacterias in$ectadas con $ago a'udador slo no crecer%n (or causa de 9ue estos no contienen genes de resistencia a a#(icilina. 9 8 E>presin , purificacin de protenas recombinantes en el (ector pMal 5os $rag#entos clonados en (B* (ueden ser escindidos con enzi#as de restriccin ' religados en el (l%s#ido (MA5"cC. 5as clulas trans$or#adas de E. coli con los $ag#idos trans$or#ados son incubadas con IP27 (ara e<(resar (rotenas de $usin conteniendo los antgeno del organis#o clonado $usionado a un ((tido de MG a a (artir del !"ter#inal del $rag#ento de la galactosidasa.
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Ane>o CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC Informacin &til para el mane*o de los protocolos

- Algunas propiedades &tiles de los 'cidos nucleicos Peso #olecular de un oligonucletido AAA : ./C.CB ^ A7 : .C-.CB ^ A2 : .1C.CB ^ AC : C--.CBB @actores de con4ersin / densidad (tica AK B a CL1 n# _ ,1 g de A ! gen#ico / K a CL1 n# _ M1 g de R!A / K a CL1 n# _ .1 g de oligonucletido / n#ol de oligonucletido _ K a C L1 n# : +1 longitud del oligonucletido Condiciones de al#acena#iento (ara oligonucletidos& 5io$ilizados a "C1oC& seis #eses a 4arios a;os. 5io$ilizados a ^C,oC& dos #eses a un a;o. isueltos en agua a "C1oC& un #es a seis #eses. isueltos en agua a ^C1oC& una se#ana a tres #eses. Condiciones de al#acena#iento (ara el gA !& isuelto en alicuotas con 2E /: a "C1oC& 4arios a;os. Caractersticas de la #o4ilidad del A ! durante la electro$oresis en el gel de agarosa Agarosa Rango de se(aracin :ilencianol Azul de bro#o$enol Q (D4 A(bB A(bB A(bB TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 1., /111 " .1111 +111 /,11 /.1 .,1 " 0111 L,11 /111 /., C11 " M111 .111 M,1 C.1 /11 " C111 /,11 CM1 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT Caractersticas de la #o4ilidad del A ! durante la electro$oresis en el gel de acrila#ida
Acrila#ida Rango de se(aracin :ilencianol Azul de bro#o$enol Q (D4 A(bB A(bB A(bB TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT .., /111 " C111 ML1 /11 ,.1 -1 " ,11 CL1 L, -.1 L1 " M11 /L1 M, /C.1 ,1 " C11 01 C1 /,.1 C, " /,1 L1 /, C1.1 , " /11 M, /C
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
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- Reacti(os , preparacin de soluciones Pre(aracin de A ! gen#ico Bampn BE 5=M Bampn BE< ,1 #M 2ris (8 -.1 /11 #M !aCl / #M E 2A -enol$ p. K = E9uilibrado en 1./ 2ris 8Cl ' Cloro$or#o. RNAsa Elibre de ADNsaB /1 #M 2ris 8Cl (8 0.1 , #M CaClC ,1Q 7l'cerol -enol? Cloroformo Mezcla /&/ de $enol cloro$or#o Cloroformo Mezcla CM&/ de Cloro$or#o& Alco3ol isoa#lico Na2Ac 8M$ p. 4 = A=ustar (8 a -.1 con %cido actico Etanol Etanol absoluto A/11QB Etanol al 4=T 01Q Etanol .1Q agua estril Proteinasa J stocG C1 #gD#l 0iso#ima stocG /1 #gD#l Isopropanol Agua est"ril
igestin Eco +,
Enzi#a Eco +, ' ta#(n /1 : Eco +,

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Electro$oresis en gel de agarosa Bampn BAE 3=M Epor litroF CMC g 2ris Base ACM $inalB ,0 #l jcido actico glacial A/M $inalB /11 #l de 1., M E 2A A,1 #M $inalB Bromuro de etidio stocG de /1 #gD#l en agua estril Bampn de carga 9M para gel 1.C,Q de azul de bro#o$enol Marcadores de peso molecular A ! de :/0M con 8ae III ' A ! de digerido con 4ind ,,, Pre(arar un stocG de A ! co#o sigue& /11 g A ! /11 l de ta#(n de enzi#a de restriccin Acual9uier ta#(n 9ue contiene ,1 #M de !aClB C11 l 2a#(n de carga L : (ara gel -11 l agua estril Al#acenar alcuotas a "C1oC. 5a solucin de traba=o (uede guardarse a MoC. 6sar L lD1., g de A !, /C l (ara / g o /- l (ara /., g de(endiendo del ta#a;o del (eine.
5igazn del inserto de A ! al 4ector PAP II
Mezclas reco#endadas (ara se#brar bibliotecas de $agos TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 2a#a;o del (lato Plato 5B TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT Ingrediente -C ## /,1 ## CM, : CM, ## GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG Bacteria A#lB 1.C 1., C @ago, p#u ,111 C1111 " .1111 /,1111 2o( agarosa, #l . 0 .1 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT - -rmulas Pure#a del ADN Para deter#inar la concentracin ' (roduccin de A !, to#ar una alicuota de la #uestra ' diluirla /&, en ta#(n de al#acena#iento. Calibrar el es(ectro$ot#etro usando la #uestra ta#(n ' #edir la (ro(orcin de absorbancia A CL1DAC-1 o escanear la #uestra de CC1 a .C1n#. Para un A ! (uro,
C'lculo del Tm para sondas de oligonucletidos menores de 3= nucletidos
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2# _ CAA ^ 2B ^ M A7 ^ CB Cuantificacin del gADN , liga#n a lambda IAP II digerido con Eco RI El geno#a de PAP II es de M1-C1 (b de longitud. El ta#a;o (ro#edio de inserto des(us de digestin con Eco +, es de a(ro<. M111 (b de longitud. Por lo tanto, si
Mi _ #asa del A ! inserto. M _ #asa del A ! la#bda. PMi _ (ro#edio del (eso #olecular del inserto. PM _ PM del PAP II ' nosotros tene#os& entonces AMiDPMiB _ AMDPMB, M _ Mi : PMDPMi _ Mi : /1
(ara /.1 g de A ! de la#bda necesita#os 1./ g de inserto de A !. Determinacin del porcenta*e de recombinantes 5os 4ectores la#bda ' los (l%s#idos de e<(resin (er#iten discri#inar los reco#binantes de los no reco#binantes sobre la base del color claro o azul res(ecti4a#ente. 6na 4ez se#brada la genoteca, se debe deter#inar el (orcenta=e de reco#binantes en la genoteca. Para su e$ecto se debe calcular la (ro(orcin del n)#ero de (lacas o colonias reco#binantes di4idido (or el n)#ero total de (lacas o colonias Areco#binantes ' no reco#binantesB #ulti(licado (or /11. As, una genoteca con #%s del -1Q de reco#binantes signi$ica 9ue es )til (ara la b)s9ueda de clonas de genes de inters.
Btulo de una genoteca El ttulo de una genoteca da la concentracin de $agos o bacterias en la solucin de la genoteca cosec3ada. Este se #ide en unidades $or#adoras de (laca Ap#u& (late $or#ed unitB (ara los $agos o en c#u (ara las colonias bacterianas #ediante la relacin& n _ y D v6, donde n es el ttulo en p#u D #l, y el n)#ero de (lacas (roducidas (or el se#brado de un 4olu#en v de una dilucin 6. El ttulo (er#ite ade#%s conocer la dilucin (ti#a a la cual se debe se#brar la genoteca de #anera se#icon$luente (ara e$ectuar el ta#iza=e. Esto se logra #ediante diluciones seriadas de /1 en /1 o /11 en /11. Por e=e#(lo, 1./ #l de una dilucin /&/1, da un (ro#edio de /,11 (lacas (or (latoI el ttulo es /,11 D A1./ : /1 ",B _ /., : /1+ p#uD#l. 6n ttulo #a'or de /10 o de /1/1 son (ti#os (ara genotecas (ri#arias bien construidas o genotecas bien a#(li$icadas, res(ecti4a#ente. Proporcin de clonos recombinantes a rastrear A $in de encontrar un clon deter#inado de un gen deseado a una (robabilidad deter#inada, es i#(ortante calcular el n)#ero de reco#binantes A!B. Para esto 3ace#os uso de la siguiente ecuacin& ! _ lnA/"pB D lnA/"A6DyBB, donde p es la (robabilidad de 3allar un $rag#ento (articular, diga#os con un ++Q de >certeza?. 6 es el ta#a;o de insertos (ro#edio clonados en la genoteca o la distancia (ro#edio a la cual la enzi#a de restriccin utilizada corta. Por e=e#(lo, (ara un geno#a
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con ,1Q 7C una genoteca Eco +, dar% $rag#entos de a(ro<. M111 (b. y es el ta#a;o del geno#a clonado. Por e=e#(lo, (ara el &ycobacterium leprae los 4alores ser%n& ! _ lnA/" 1.++B D lnA/"A,111 (b D C.L:/1L (bBB ! _ C..+0. Esto signi$ica 9ue debera#os ta#izar (or 3ibridizacin a(ro<. .111 (lacas o colonias (ara tener el c3ance de encontrar el clon deseado. Oa 9ue una ca=a de Petri est%ndar (uede alo=ar cerca de C111 (lacas o colonias se#icon$luentes, entonces necesitare#os de dos ca=as de Petri (ara e$ectuar el ta#iza=e. !o obstante, (ara este caso, se reco#ienda ta#izar #%s de , a /1 ca=as de Petri, a $in de au#entar la (robabilidad de 3allar 4arias co(ias del #is#o clon. Para un geno#a eucariote co#o .eishmania los (ar%#etros seran& ! _ lnA/" 1.++B D lnA/"A,111 (b D ..0:/10 (bBB ! _ .M.1-/. En este caso se ta#izaran al #enos /- ca=as de Petri. !o obstante, en bibliotecas de e<(resin ta#izadas con anticuer(os (oliclonales o #onoclonales, la (robabilidad 9ue un clon sea e<(resado es pDL. Por lo 9ue se deben ta#izar #%s (latos de Petri o alternati4a#ente construir una genoteca #%s grande. - Pl'smidos o fagos 7 Para genotecas de A !c& 5a e$iciencia de e#(a9ueta#iento del A ! del $ago es 3asta el /1Q. 5a e$iciencia en la $or#acin de (lacas de $agos e#(a9uetados& /11Q. 5a e$iciencia de la trans$or#acin de las clulas E. coli& /", : /1- tran$.Dg _ 1./ " 1., Q. Por lo tanto, los 4ectores $agos son e$icientes (ara las bibliotecas A !c. Para alcanzar sobre<(resin ' (roduccin co#(arable a los (l%s#idos se reco#ienda crecer lisognica#ente los $agos. Ade#%s, los lisgenos son inestables (or razones desconocidas. Co#o conclusin, los (l%s#idos 4ector son e$icientes (ara sobree<(resin ' (uri$icacin. - Caractersticas de los (ectores , cepas - Bacterifago sil(estre El $ago la#bda sil4estre tiene cinco gru(o de genes (rinci(ales& /B gru(o #or$ogentico el cual codi$ica (ara las (rotenas de la cabeza, la cola ' el cuelloI CB el gru(o de in#unidad ' reco#binacin los cuales #edian la (roteccin del $ago $rente a otros $agos co#(etidores ' la reco#binacin sitio es(ec$ico durante la lisogeniaI .B el gru(o regulador o controlador, con 0 genes i#(licados en el control del estilo de 4ida del $agoI MB los genes de re(licacin del A ! 4iral ' ,B los genes codi$icante (ara enzi#as lticas Alisozi#asB (ara e$ecto de ro#(er la (ared celular bacteriana durante la $ase ltica. Ade#%s, el geno#a del $ago contiene A ! conector, el cual una 4ez retirado (arece no a$ectar el estilo de 4ida del $ago. gt-5= 5os brazos Eco +, del 4ector est%n de$os$orilados (ara obtener un ba=o tras$ondo AbacGgroundB de los no reco#binantes.
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6na alta e$iciencia de clona=e #a'or de , : /1L p#u/g de brazos con inserto control. 5a identi$icacin de $agos reco#binantes de los no reco#binantes es (osible usando la ce(a 3os(edera CL11h#lI los $agos reco#binantes son lticos, (roduciendo (lacas claras ' los $agos (arentales son lisognicos, (roduciendo (lacas turbias. 5a ce(a CL11h#l re(resa el creci#iento del $ago (arental. Ca(acidad de clona=e 3asta 0.L Gb.

- gt-55 5os brazos Eco +, del 4ector est%n de$os$orilados (ara obtener un ba=o tras$ondo AbacGgroundB de los no reco#binantes. 6na alta e$iciencia de clona=e #a'or de , : /1L p#u/g de brazos con inserto control. 5as (lacas del $ago reco#binante son claras ' las (lacas de los $agos no reco#binantes son azules sobre 3os(ederos lac2 en (resencia de IP27 ' :"gal. 5os insertos de A ! (ueden ser e<(resados co#o (rotenas de $usin ba=o el control del (ro#otor lacP. 5as (lacas (ueden ser rastreadas con anticuer(os contra las (rotenas clonadas ' e<(resadas. 5a e<(resin de grandes cantidades de (rotenas de $usin (ara el estudio de an%lisis de (rotenas o (roduccin de anticuer(os #ediante induccin con IP27. 5as genotecas (ueden ser rastreadas con sondas de %cidos nucleicos o anticuer(os. Ca(acidad de clona=e 3asta 0.C Gb APro#ega, /++MB. - IAP II 6n (olilinGer con seis sitios de clona=e ASacI, $otI, 7baI, SpeI, EcoRI ' 7hoIB 9ue deber% aco#odar insertos de 3asta /1 Gb de longitud. 5os clonos en el 4ector PAP II (ueden ser ta#izados con sondas de A ! o sondas de anticuer(os. El sitio (olilinGer es (arte de la (orcin a#ino ter#inal A$rag#ento del gen lacP. El gen lacP co#(leto, constituido (or la seccin !"ter#inal 9ue codi$ica (ara el $rag#ento #%s la seccin C"ter#inal 9ue lo 3ace (ara el $rag#ento , 9ue codi$ica (ara la enzi#a "galactosidasa. El 3os(edero E. coli usado con PAP II, lla#ado :5/"Blue MR@\, contiene el e(iso#a @\, el cual codi$ica (ara el $rag#ento necesario (ara co#(le#entar el $rag#ento ' generar la "galactosidasa $uncional. Este ta#bin contiene el gen lacI9, el cual codi$ica (ara el re(resor del gen lac. Cuando un inserto esta (resente dentro del (olilinGer, la e<(resin del $rag#ento es interru#(ida ' las clulas :5/"Blue MR@\ in$ectadas con el $ago reco#binante no es ca(az de 3idrolizar el substrato :"gal. :"gal se torna azul des(us de la 3idrlisis con "galactosidasa, de a3 9ue, las (lacas debidas a $agos reco#binantes son blancas, #ientras 9ue las (lacas debidas a $agos ti(o sil4estre son azules. 5a e<(resin de (rotenas reco#binantes (ueden ser t<icas (ara la clula 3os(edera o dis#inuir la re(licacin del $ago. e a3 9ue, es (osible crecer el $ago PAP II ba=o condiciones donde la e<(resin de la (rotena reco#binante es su(ri#ida. Esta es la razn (or la 9ue el gene lacI9 es incluido en el 4ector Aas co#o ta#bin en #uc3os otros 4ectores induciblesB. 5a e<(resin a (artir del (ro#otor lacP es inducida (or el IP27 el cual, cuando se une al re(resor lac, blo9uea su unin al o(erador lac. - Mapas
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- Pl'smido pB< <J EUS-F? Escisin in vivo de insertos de ADN del organismo en cuestin clonados en el fago lambda IAP II , el pl'smido de rescate pB<
5as clulas 3os(ederas de E. coli, A:5/"BlueB son in$ectadas si#ult%nea#ente con el $ago reco#binante PAP II ' el $ago $ila#entosos $/ A$ago a'udador o 3el(erB. El $ago $/ co#ienza a re(licar ' las (rotenas @/ i#(licadas en el (roceso de re(licacin ta#bin unidas a el iniciador $/ en el PAP II. Co#o consecuencia, todas las secuencias contenidas en el $rag#ento I ' 2 son re(licados ' e#(a9uetados co#o un >$ago? de banda si#(le A^B, un $ag#ido, el cual es secretado a (artir de las clulas :5/"Blue ' acu#ula en el sobrenadante. Esta #ezcla es (recalentada A01eCB (ara #atar las clulas :5/"Blue. 5os $ag#idos sobre4i4en al trata#iento del calor.
- Pl'smido pMal - -igs Babla No 5 Algunas en#imas de Restriccin Enzi#a 2e#(. e *ecuencia Reaccin 9ue reconoce TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT Eco RI E. coli RO/. C, .0eC ,\7AA22C.\ .\C22AA7,\ TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT "am 8I "acillus amyloly /1"C1 .0eC ,\77A2CC.\ )ue#aciens .\CC2A77,\ TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 4ind III 4aemophilus /1"C1 .0eC ,\AA7C22.\ in#luenzae Rd .\22C7AA,\ TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 5st I 5rovidencia .0eC ,\C27CA7.\ stuartii .\7AC72C.\ @uente Concentracin
Babla No : Principales marcadores gen"ticos del bacterifago lambda /enes Cos !u, A S B C -uncin E<tre#o co3esi4o de cadena sencilla de /C nucletidos Inter4ienen en el e#(a9ueta#iento& co#(onentes de la ter#inasa 9ue cli4a los sitios Cos. Co#(leta la cabeza Pri#er inter#ediario en la iniciacin del ensa#ble de cabeza. Inter4iene en la iniciacin del ensa#ble de la cabeza
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!u . E @I @ II P 6 V 2 8 7, M, 5, R, I J att int, <is e<o, bet ga# C III ral
Protena de ar#azn 9ue $or#a core, (rocabeza. Protena estructural 9ue da estabilidad a la cabeza. Protena estructural de la cabeza. Inter4iene en el e#(a9ueta#iento ' en la iniciacin de la cabeza. Co#(leta la cabezaI necesario en la unin cabeza"cola. Co#(leta la $or#acin de la cola. Co#(leta la $or#acin de la cola e inter4iene en la $or#acin cabeza"cola. Protena estructural de la cola #%s i#(ortante. Pa(el en el ensa#bla=e de la cola desconocido. eter#ina la longitud de la cola. Partici(an en la iniciacin de la sntesis de la cola. eter#ina el rango de es(eci$icidad del 3os(edero. Presu#ible#ente codi$ica (ara la $ibra de la cola. >RE7Ik! !K E*E!CIA5 E M G(b? *itio de reco#binacin es(ec$ica con el A ! de E. coli. Co#(onentes del siste#a de reco#binacin sitio"es(ec$ico, (ara la integracin o escisin del (ro$ago. Pertenecen al siste#a de reco#binacin general Asiste#a redB. e<o& e<onucleasa. bet& (ro#ue4e la reco#binacin ' renaturalizacin In3ibe la accin de la enzi#a +ec BC del 3os(edero, unindose a ella. Establece la lisogenia, regula la acti4idad de la (rotena CII. In3ibe la restriccin. Protege al $ago del siste#a Eco B ' Eco R del 3os(edero. Antiter#inador de transcri(cin, (er#ite transcri(cin iniciada en PR ' en P5. *iste#a de e<clusin del (ro$ago 5a#bda. 9ue contin)e la
! Re< B Re< A CI Cro C II K, P Regin nin E * R, Rz Cos
>Re(resor 5a#bda?. Mantiene el estado de (ro$ago re(ri#iendo la transcri(cin desde Pl ' PR, ' acti4ando la transcri(cin desde PM. Re(resor 9ue act)a durante el creci#iento ltico (ara a(agar la transcri(cin desde P5, PR, PM. Establece la lisogeniaI regula la estabilidad de la (rotena III Inicia la re(licacin del A ! a (artir del sitio Kri. Parte no esencial del $ago 5a#bda, corres(onde a . G(b de longitud. Antiter#inador de la transcri(cinI (er#ite 9ue la transcri(cin iniciada en PR contin)e dentro de los genes tardos. Inter4iene en la lisis celular, ro#(iendo la #e#brana interna de la clula. Producen endolicinas 9ue degradan la (ared celular. E<tre#o co3esi4o de cadena sencilla.
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Babla No 8 Principales marcadores gen"ticos del bacterifago lambda gt-55 /enes 5ac , -uncin *ubstitucin en el $ago 5a#bda (or la regin no esencial entre el gen J ' el sitio att. 7en 9ue codi$ica (ara la B"galactosidasa, con sitio de clona=e Eco RI 3acia el e<tre#o CKK8 (ara (roducir una (rotena de $usin. Mutacin 9ue con4ierte el (roducto del gen CI ter#ol%bil. Es un re(resor sensible a la te#(eratura, inacti4o a MCeC en la $ase ltica, (er#itiendo una seleccin contra el creci#iento lisognico. elecin de la regin nin, del $ago 5a#bda 9ue re#ue4e el sitio de ter#inacin de la transcri(cin tRP, ' (or lo tanto con4ierte la transcri(cin te#(rana inde(endiente del gen !, acelerando la $ase ltica. Mutacin en el gen * 9ue (roduce lisis de$ecti4a del $ago.
C I -,0 nin ,
* /11
Babla No ; Principales marcadores gen"ticos comunes a los )ospederos E. coli O5=KK , O5=@= /enes *u( @ *tr A min , -uncin *u(resor de la #utacin %#bar en el gen */11 del $ago la#bda gt"// (ara (roducir lisis no de$ecti4a. 7en de resistencia 9ue #odi$ica el antibitico estre(to#icina e in3ibe su enlace al riboso#aI el (roducto de este gen es un agente bacteriano 9ue se une a la subunidad .1* del riboso#a causando lecturas errneas del AR!#. elecin en el o(ern 5ac 9ue reduce la reco#binacin entre el $ago ' el 3os(edero. !ecesario (ara distinguir los $agos reco#binantes de los no reco#binantes. Pl%s#ido (BR".CC 9ue lle4a el gen 5ac I 9ue re(ri#e la e<(resin de genes $or%neos, los cuales dis#inu'en el creci#iento del 3os(edero ' del $ago. El (BR".CC lle4a el gen Bla, 9ue con$iere resistencia a la a#(icilina, ' el gen 2cr, 9ue da resistencia a la tetraciclina.
5ac6/L+ PMC +
Babla No 3 Principales marcadores gen"ticos del )ospedero E. coli O5=KK /enes *u( E Met B 2r( R 8sd R" 8sd M^ 2on A C/ ProC& &2n, min /, -+ /11 ++. + -uncin *u(resor de la #utacin %#bar del $ago la#bda gt"/ Codi$ica (ara la enzi#a c'stationina sintetasa 7en regulador (ara el o(ern del 2r( E4ita la restriccin del A ! clonado !ecesario (ara realizar #odi$icacin (or #etilacin de la secuencia clonada Resistencia ' sensibilidad a los $agos 2/ ' 2C res(ecti4a#ente 2rans(osn 9ue lle4a el gen (ara la (rolina.
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Babla No 9 Principales marcadores gen"ticos del )ospedero E. coli O5=@= /enes Pro A^ 5on Ara /.+ min L /1 / -uncin 7en 9ue codi$ica (ara la (roduccin de 5"gluta#ato se#ialde3do elecin en el gen 5on (roteasa. Per#ite la estabilidad de las (rotenas e<(resadas Parte del Ara 9ue codi$ica (ara la 5"arabinosa iso#erasa.
@ig. C,.
M. tuberculosis te;ido con Piel3"!eelsen 4isto al #icrosco(io (tico.
80
@ig CL. 2e=ido (ul#onar a$ectado (or tuberculosis
@ig C0. Electro$oresis en gel de agarosa al /Q 9ue #uestra& A& Patrones de 5a#bda sil4estre cortados con 8ndIII. B ' C& A ! de M. tuberculosis des(us del trata#iento con R!Aasa a di$erentes concentraciones. ' E& A ! del bacilo antes de R!Aasa a di$erentes concentraciones
81
@ig C-. Electro$oresis del A ! del M. tuberculosis, con AR!, digerido con endonucleasas de restriccin. A& Patrones de 5a#bda sil4estre cortados con Ba#8I. B& A ! del bacilo sin digerir. C& A ! del bacilo digerido con 8indi. & A ! digerido con Ba#8I. E& A ! digerido con EcoRI. @& A ! digerido con Pst"I.
@igura C+. A& 5ibrera culti4ada en (resencia de IP27 ' :"7A5 ' B& Control de ligacin del siste#a 5a#bda gt "//
82
@ig .1. 2itulo de M.1 < /1/1 u$(D#l de la librera a#(li$icada. A& ilucin /1"C, "M "L total#ente con$luente. B& ilucin /1 , con$luente. C& ilucin /1 , no con$luente. Kbsr4ese el alto (orcenta=e de reco#binantes . & ilucin /1"-
83
@ig ./. Aisla#iento de las sondas sintetizadass (or electro$oresis en (oliacrila#ida"urea. A& Patrones, V:C& 4erde"<ileno"cianol, AB@& azul de bro#o$enol. B& *onda /MR. C& *onda M1R.
84
@ig. .C. Autorradiogra$a de geles de (oliacrila#ida"urea 9ue #uestra los oligonucletidos radi#arcados.
85
@ig ... 7radiente en CsCl, des(us de C 3oras de ultracentri$ugacin a MC.111 r.(.#. A& A ! bacteriano de E. coli. B& @agos de la librera.
@ig .M. An%lisis co#(arati4o entre A ! gen#ico ' A ! reco#binante cortados con tres endonucleasas de restriccin di$erentes. A& :/0M cortado con 8aeIII. B& A ! gen#ico cortado con EcoRI. C& A ! reco#binado cortado con EcoRI. & A ! gen#ico cortado con 8ndIII. E& A ! reco#binado cortado con 8indi. @& Patrn de 5a#bda gt"// cortado con 8indi. 7& A ! gen#ico cortado con Pst"I ' 8& A ! reco#binado cortado con Pst"/
86
I -ig 83?
II
I? Autorradiografas de ADN de (ectores de diferentes concentraciones Pl'smidos? A? puC-5K B? p/EM8 C? pBR8:: -agos? D? EMB08 E?0ambda gt55 /enmicos? -? BBC /? P falciparum .ibridi#acin con una sonda de 5;Jb II? ADN genmico de Micobacterium tuberculosis a diferentes concentraciones .ibridi#ado con una sonda de 5;Jb
87
@ig. .L. An%lisis de la electro$orsis en agarosa al /Q 9ue #uestra& A& Patrones de 5a#bda sil4estre cortado con 8indIII. B& A ! gen#ico de M. tuberculosis C& A ! reco#binado cortado con EcoRI del clon (ara la M1R..
@ig. .0. Muestra el clon M1R (uro de M. tuberculosis
88
/losario
Amplificacin? se re$iere a la (roduccin de co(ias adicionales de una secuencia cro#oso#al, encontrada tanto en A ! cro#oso#al co#o en e<tracro#oso#al. Anticuerpo? es una (rotena Ain#unoglobulinaB (roducida (or los lin$ocitos B, 9ue reconoce un antgeno (articular $or%neo ' al cual se dirige la res(uesta in#une. Antgeno? es cual9uier #olcula cu'a entrada a un organis#o (ro4oca la sntesis de un anticuer(o. Autorradiografa? detecta #olculas radiacti4a#ente #arcadas, (or su e$ecto de crear una i#agen $otogr%$ica. Bacterifagos? son 4irus 9ue in$ectan las bacteriasI (ueden re(licarse a s #is#os dentro de ellas ' (ueden ser #odi$icados (ara 9ue tengan un )nico sitio de inserto de A ! blancoI $recuente#ente se abre4ian co#o $agos. Biblioteca de ADN o genoteca? es el con=unto de $rag#entos de A ! de un organis#o, distribuidos en 4ectores, cu'a unin re(resenta el geno#a entero del organis#o. C'pside? es la (rotena e<terna 9ue recubre una (artcula 4iral. Clon? describe un gran n)#ero de clulas o #olculas idnticas con un )nico #dulo o clula ancestral. Codn? es un tri(lete de nucletidos 9ue re(resenta un a#ino%cido o un signo de ter#inacin. Codn de terminacin? es uno de tres secuencias tri(letes& 6A7 A%#barB, 6AA AocreB o 67A A(aloB, 9ue causan ter#inacin de sntesis (roteicaI ta#bin se lla#a codn sin sentido. Concat'mero de ADN? es una cantidad de unidades gen#icas 9ue se re(iten en t%nde# de #)lti(les co(ias de la #is#a secuencia. Degeneracin del cdigo gen"tico? se re$iere al e$ecto de los ca#bios en la tercera base del codn sobre el a#ino%cido 9ue ste re(resenta. Desnaturali#acin? re$erida al A ! o al R!AI describe su con4ersin de doble banda al estado de si#(le bandaI la se(aracin de las bandas est% a #enudo aco#(a;ada de calenta#iento ' %lcali. Determinante antig"nico o eptope? regin es(ec$ica de una (rotena 9ue interact)a con el anticuer(o 3u#oral, deter#inando la es(eci$icidad de la reaccin in#unognica. ADN blanco? es el A ! 9ue se e<trae de un organis#o (ara ser cortado en $rag#entos ' clonado dentro de un 4ector. Endonucleasas o en#imas de restriccin? reconocen ' cli4an secuencias cortas es(ec$icas de A !, usual#ente no #etiladas. Pueden ser es(ec$icas (ara A ! o AR! #ono o bicatenario. Esferoplasto? es una clula bacteriana o le4adura cu'a (ared 3a sido total o (arcial#ente re#o4ida. /enoma? es el (atri#onio gentico de una clula o un organis#o. Este se encuentra constituido (or toda la coleccin de genes ' las secuencias conectoras no codi$icantes, reguladoras ' re(etidas. /enoteca? Vase biblioteca de A !. .ibridi#acin in situ? es un #todo 9ue consiste en desnaturalizar el A ! a (artir de clulas 3o#ogenizadas, sobre un (a(el de nitrocelulosa, donde ocurre una reaccin de a(area#iento de bases co#(le#entarias, cuando se a;ade una cadena si#(le de A ! o R!A #arcadas radiacti4a#ente o (or #todos $rosI la 3ibridizacin es seguida de autorradiogra$a.
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Inmunidad en fagos? se re$iere a la 3abilidad de un (ro$ago (ara (re4enir 9ue otro $ago del #is#o ti(o in$ecte una clula. lsta resulta de la sntesis de un re(resor del $ago en el geno#a del (ro$ago. Integracin de una secuencia de ADN (iral u otra secuencia? es la insercin de una de estas secuencias dentro de un geno#a 3os(edero co#o una regin co4alente#ente ligada (or a#bos lados de la secuencia 3os(edera. 0iga#n? es la $or#acin de un enlace $os$odiester 9ue une dos bases ad'acentes se(aradas (or una #uesca o nicG en una 3ebra de doble 3lice de A !. 0igadores? son $rag#entos cortos de oligonucletidos sintticos de doble 3lice 9ue contienen un sitio blanco (ara una endonucleasa de restriccinI (ueden ser adicionados a los e<tre#os de un $rag#ento de A !. 0infocitos B? son las clulas res(onsables de la sntesis de anticuer(os. 0isogeno? es una bacteria 9ue (osee un (ro$ago re(resado co#o (arte de su geno#a. Mapa de restriccin? es un arreglo linear de sitios sobre el A ! cli4ado (or 4arias enzi#as de restriccin. Modificacin del ADN? inclu'e todos los ca#bios 3ec3os en los nucletidos des(us de su incor(oracin inicial dentro de una cadena (olinucleotdica. 2pern? es una unidad co#(leta de genes bacteriales estructurales, de e<(resin ' de regulacin de A !, reconocidos (or el control de un gen regulador. Palndrome? es una secuencia de A ! 9ue es la #is#a cuando una 3ebra es leda de iz9uierda a derec3a ' la otra es leda de derec3a a iz9uierda. Pares de bases EpbF? es el a(area#iento entre las bases nitrogenadas& A con 2 ' C con 7, en el A ! de doble 3lice. Pl'smidos? son #olculas bicatenarias de A ! circular, las cuales (ueden re(licarse dentro de una clula bacterial. Profago? es un geno#a de $ago co4alente#ente integrado co#o una (arte linear del cro#oso#a bacterial. Protenas antiterminadoras? (er#iten 9ue la AR! (oli#erasa transcriba a tra4s de ciertos sitios ter#inadores. Proteoma? la coleccin de todas las (rotenas (redic3as terica#ente a (artir de la secuencia del geno#a ' las con$ir#adas $isiolgica#ente ba=o di$erentes condiciones de creci#iento celular. Reasociacin de ADN? describe el a(area#iento de cadenas si#(les co#(le#entarias (ara $or#ar una doble 3lice. Redundancia? degenera#iento del cdigo gentico en el sentido de 9ue 4arios tri(letes (ueden codi$icar (ara un a#ino%cido. <ecuencia <)ine-Dalgarno? es (arte o toda una secuencia (oli(urnica aggagg localizada en el AR!# bacterial =usto antes de un codn de iniciacin A67I es co#(le#entaria a la secuencia de /L* AR!# en el e<tre#o .[I ade#%s est% i#(licada en la unin del riboso#a al AR!#. <itios silentes de un gene? describen a9uellas (osiciones en las cuales las #utaciones no alteran el (roducto. <onda? oligonucletido sinttico de una banda radio#arcada, o anticuer(o #onoclonal o (oliclonal, 9ue sir4e (ara buscar genes deseados dentro de una biblioteca. <out)ern QblotR? tcnica 9ue describe el (roceso de trans$erencia de A ! desnaturalizado desde un gel de agarosa 3acia un $iltro de nitrocelulosa, donde ste (uede 3ibridizarse con un %cido nucleico co#(le#entario. Bemperatura de fusin EBmF? es el (unto #edio de un rango de te#(eratura sobre la cual el A ! se desnaturaliza. Berminador? es una secuencia de A !, re(resentada en el e<tre#o del transcrito, 9ue causa la ter#inacin de la transcri(cin de la R!A (oli#erasa. Bransduccin? se re$iere a la trans$erencia de un gene bacterial, de una bacteria a otra, (or un $agoI el $ago 9ue lle4a los genes del 3os(edero co#o ta#bin sus (ro(ios genes,
90
se lla#a $ago transductante. 2a#bin describe la ad9uisicin ' la trans$erencia de secuencias de clulas eucariotas (or #edio de un retro4irus. Bransfeccin de una bacteria? es la ad9uisicin de nue4os #arcadores genticos (or incor(oracin de un A ! adicionado. !ector? es una #olcula de A !, la cual (uede re(licarse co#o una unidad autno#a. 2iene sitios dentro de los cuales el A ! blanco (uede insertarse. E<isten tres ti(os de 4ectores& $agos, (l%s#idos ' cs#idos.
Corolario
El conoci#iento de todas estas estrategias de clonacin ' de A ! reco#binante (one a un estudioso de las ciencias naturales ' en es(ecial de la biologa en una nue4a auto(ista del saber, 'a 9ue 3o' (or 3o' los cient$icos a lo largo ' anc3o del #undo se encuentran a la caza de nue4os genes de di$erentes organis#os incluido el 3o#bre, (er#itindole con esto abrir la co#(uerta de nue4os conoci#ientos (ara el entendi#iento de los (rocesos de la 4ida ' de las relaciones 9ue se te=en entre los organis#os 4i4ientes. El a(ro(ia#iento ' #ane=o (ro$esional de estas estrategias de in4estigacin generan 3o' en da los reconocidos altos ni4eles en los (ases desarrollados, 'a 9ue estos generan #a'or (roduccin ' deasarrollo biotecnolgico (ara la industria $ar#acutica, cos#tica, ali#entaria, (or su(uesto, generando una #e=or alternati4a de salud Acaso de la (roduccin biotecnolgica de la insulinaB ' del bienestar 3u#ano en general. Este libro 3a (retendido (oner a dis(osicin de los interesados nu#erosas e<(eriencias en este interesante ca#(o de la clonacin de genes, con resultados originales del traba=o de in4estigacin de los autores. Es(era#os 9ue esta intencin sea $ecunda ' 9ue (er#ita a los estudiosos en estos ca#(os (oder (oner en (r%ctica las estrategias de traba=o de in4estigacin a9u (lanteadas. Patricia Eugenia Vlez V. Es(eranza Rodriguez Pedro Antonio Moreno 2. Ma'o C11C
91
Bibliografa
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Andice
A Acrila#ida, ,, Acti4idad es(ec$ica, ,L,,Adsorcin, CAgarosa, ML Al#acena=e de genotecas, /L A#(icilina, ..,.0,M-,M+,LC,L-,0A#(li$icacin de genotecas, /C,/L,.+ Antibitico, .0 Anticuer(o, 0,/,,C/,L+ dA2P ,Astringencia, LM Autorradiogra$a, C0,L1,L.,LM Azul de bro#o$enol 0. B Bacteri$ago la#bda, /-,C0,C-,./ Beta"galatosidasa, .C,..,.0 Biblioteca de A !" Reco#binante A4er genotecaB,/L Bioseguridad Anor#asB, 0 Brazos del 4ector Aar#sB, ML,M0 Bro#uro de etidio, ML,0, Bu$$er A4er 2a#(nB, .1 C C%(sides AcabezasB, C/ A !c, genoteca A4er genotecasB /0,/-,.C,MC,M.,LL Cebador A4er iniciador o (ri#erB, MC
c#u, 00 Clon, .0 Clona=e,L,/C,/.,/0,/-, /+,C-,.C Cloruro de Ca^C, << Colas AtailsB, M0 Conse=o de Biotica, 0 Cos, sitio, C1,C-,0-,0+ Cs#ido, C/,C-,MC,+, cpm, ,+ Creci#iento lisognico, -C Cro Are(resorB, .1,./,.,,.L,0+,-1,-/,-C ,+M Cro#atogra$a, ,,,,L,,CsCl, L/,+1
E<tre#os ro#os, C1 E<tre#os co3esi4os, C1,C/,C+ $/ A$agoB, /0,/-,C/,CC,C-" .C,.M,.-,M.,M0,M+,,/,L/ ,LC,L+,0.,0L"-C,+/ @ag#ido, .M,0C,0. @ago A4er bacteri$agoB C@enol, MM,ML,0M"0L,-@iltro A4er #e#branaB @or#a#ida, ,, @rag#ento , 0/,00 @rag#ento , 00 / 7en CI, .1,-1 CII, .1,-1 CIII, .1,-1 Cro, C+ !, C+,-1 7eno#as, ,,0,/C,/,,C-,L,,+7enotecas,/L,C/ gen#icas o de A !, 0L de A !c, ,,/L"/0 . h#l, 00 8ibridizacin, CM,M1 8istoria de la BM, /C" /. 8os(edero A3ostB, M0 >3ot start? A4er PCRB, hsdR Agenoti(oB, C1,./ hsd*, C1 I
D en3art, LM ensidad (tica, 0M esancla=e de oligos, C.,,.",M,+iluciones seriadas, ./,,1,00 A ! gen#ico AgA !B, aisla#iento, 0,/0,L,,LL,+1,+/ A ! co#(le#entario AA !cB, /0,/-,M.,LL,0A ! ligasa, /,,C1 A ! (oli#erasa I, /, ot blotting, MC,L. E Electro$oresis, ML,,0 E#(a9ueta#iento, ML,,0 Enzi#as de restriccin, /M,/-,/+"C/,L1,0/,0-,+C E(iso#a @\, 00 Etanol, 0M E<tractos de e#(a9ueta#iento, ML,M0
95
Induccin, /L,.0,L0" L-,00 Iniciadores, C/,.+"M/ In#unodeteccin, L, In#unologa, CL In#unoreacti4idad, 0,C/ Inserto, C0 IP27,.L,LJ Gilobase AGbB, C0,00
0 lacA, .,,.L lacI, .,,.L,.0 lacK. .-,-1 lacO, .-,-1 lacP, .C,.M,.0".-,-1 5a4ados (ost 3ibridizacin, .L
gt.//, 0PAP II, 0Ma(a de restriccin, .C Marcador seleccionable, /Me#branas (ara trans$erencia nitrocelulosa, CM,L/,L."L-,+C Mtodo $os$to triester, C/,CC,MC,,/ Mo4ilidad del A !, 0C AR!#, /L,/0,C/,.L,M/,-1,+. Muesca , /+,..,+C &ycobacterium leprae, 0, N >nicG? A4er #uescaB !itrocelulosa A4er #e#branasB, !ort3ern blot, CM 2 K. . A densidad (ticaB Kligonucletido, C/,CL,,/ K(erador, .,".0,00 K(ern lac, ./".0,-1 P P.C, P.. A4er .CA2PB PA7E A4er electro$oresisB, ,,,,0 PCR, //"/,,C1"C/,.+" M/,+0 p#u, 0M"0, Piro$os$ato de !a, L. Pl A(ro#otorB, C-,0+ Placa de lsis A4er p#uB Pl%s#ido (B*, 0,..,01"0/,0(Mal, 0,0C >PolilinGer?, 00
Porcenta=e de reco#binan" tes, C1,M-,0,,-, Pro$ago, C-,0+,+C Pro#otor, C-,./,..,.," .0,00 Protena de $usin, .." .M,-1 Proteinasa R, M.,MM,0M 6 E Aantiter#inadorB, C+,0+,+C R Radioisto(o, 0 Radio#arca=e de sondas, ,/",. Rastreo A4er ta#iza=eB, 0,"0L Reco#binantes, 0,/1,/M,/-" C1,./,..,.M,.0".-,M/" MC,M-,M+,L1,L,,L0,0/,0, "0L,-1 Re(resor, .1,.0 Restriccin,/-,ML Modi$icacin, /-" C1,-1,+C R!A Aan%lisisB, /M,CM,CL,M/,M.,,-,0C,+/ ,+C R!A (oli#erasa,C+,.L" .0,+. R!asa, M,
la#bda A4er bacteri$agosB,.,-,/-,C0 C+,.M,.0,.-,M/,MC,ML,LM ,L,,01,0M"0L,0-,-1,+, sil4estre AcaractersticasB, C1,+M gt"/1, .1,.C,MM gt"//, ./,.0 PAP II, .. 5B A#edioB, 0C .eishmania, 0L 5igazn, /+,C1,ML,M0,0, 5sis, C+ 5isogenia, C+ 5isgeno, .M,0L 5isozi#a, /M,M." MM,0.,0L M M/. A$agoB, .1".. Maltosa, C-,M0,L0 Ma(a gt"/1, 0-
< *c3rWdinger, E. /.,/, *creening A4er ta#iza=eB, +0 *ecuencia (alindr#ica, /* *, M.,MM,L.,LM *olucin 3ibridizadora, L.,LL *ondas, C/,CL,,/ *o(orte slido, CC
96
*out3ern blotting, L.,L. **C Asolucin salina citratoB, L/,L.,LM *ubclona=e, 0,+1
O/1+1, ./,M0" M-,L1,L,,L0"L-,-1"-C OACs A4er 4ectorB, C/,C0
B 2M (olinucletido Ginasa, ,2a#(n de carga, M-,0M,0, 2E, Ata#(n o bu$$erB, .1,,0,,M,0M 2tulo de una genoteca, 0, -m, CM,CL,M1" M/,LM,0M,+. 2M7 Ata#(nB, L1 2ranscri(tasa re4ersa, /M 2rans$erencia ti(o *out3ern, L. L 6V, A4er luz 6VB, MM ! Vector, /0,C0 insercin, /e<(resin, /W Sestern blotting, L, M :"gal A4er ,Bro#o"...B, .0,M:5/"Blue MR@\ Ace(a E. coliB, 01,00"0O
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Biologia Celular

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Curso Introductorio de Biologa Molecular

Construccin de Bibliotecas de ADN-Recombinante en el Bacterifago lambda para el aislamiento de clonos de genes

Patricia E !"le#$ Esperan#a Rodrgue# % Pedro A Moreno

P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

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Patricia E !"le#$ Esperan#a Rodrgue# % Pedro A Moreno

P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

Editorial 6ni4ersidad del Cauca

istribuido (or los Autores

P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

A nuestras )i*as +ngela Patricia , Daniela !alentina$

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En los )lti#os ,1 a;os la biologa #olecular 3a re4olucionado la in4estigacin '

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Acerca de la 2bra , Normas de Bioseguridad

P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

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/L CC C. C. CM C, C, CC+ ./ .C .C ., ., .L ..+ .+ M1 M. ,C ,L LC LL -. -. -M -M -, -L -0 --+ -+ +1 +/ +/

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El clona*e ocupa un lugar central /en Protena AClulaB /en AClulaB

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TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT Introduccin al ADN-Recombinante

P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

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.co 89 5:AN$5:;5 <sualme#!e s+me& .co =9 AA;N6:5:; !r>a ro!ac+o#al

%os+bleme#!e alea!or+os6 al me#os 1000 1b desde el s+!+o es1ec>2+co No *+ *+!+o es1ec>2+co

.# o cerca al s+!+o es1ec>2+co

24&26 1b ?ac+a el eA!remo 3B del s+!+o es1e& c>2+co *+ No *+!+o es1ec>2+co

Ac!+vac+"# de la e#/+ma 5ra#slocac+"# del ADN *+!+o de me!+lac+"#

P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

*& (erlas de (l%stico de /1 # con #acro(oros de M</1c a A-11dB B !

P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

-ig? 9 Renaturacin de dos )ebras de 'cido nucleico

" C " C " "

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P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

@ig. +. Estilos de 4ida del $ago la#bda.

P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

<istema gen"tico de gt-5=

P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

<istema gen"tico de gt-55

In ediata ente te !rano Cro % antire!re"or

In ediata ente tardio CII$CIII % reguladore"

Pro ue#e la e0!re"i)n

+, gene" de la 'a(e-a ++ gene" de la 'ola 2 gene" de l."i"

P. E. Vlez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

P+$ C66 T'5

S/- ! A** %)',)

ADN de Escherichia coli

%os+bleme#!e alea!or+os6 al me#os 1000 1b desde el s+!+o es1ec>2+co No + +!+o es1ec>2+co

24&26 1b ?ac+a el eA!remo 3B del s+!+o es1e& c>2+co + No +!+o es1ec>2+co

A. #$%i&i$'(& )%()$+i)& ,( -)+(& ,( .)&(& )%()$+i)& B. '/#%()#i0' C. +()&$#i)#i0' ,( .)',)&

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