UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
FACULTAD DE INGENIERÍAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS
PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS
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DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA
DE ALIMENTOS
LABORATORIO DE
BIOTECNOLOGÍA ALIMENTARIA
TÉCNICAS PARA MEDICIÓN DE
BIOMASA
Ana Gabriela Hoyos 1; Ingrid Ramos2;
Valeria Gonzales Andrade3; Juan Patrón4;
Rosman Ramos5; Iván Villadiego6;
Esteban Polo7.
Programa de Ingeniería de Alimentos,
Universidad de Córdoba, Berástegui,
Colombia.
Docente. PhD. Deivis Lujan Rhenals
1. OBJETIVOS
1.1. OBJETIVO GENERAL
 Implementar diferentes técnicas
para medición de biomasa.
1.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
 Calcular la biomasa microbiana
por Conteo Directo en cámara de
Neubauer, en el laboratorio de
Ingeniería aplicada de la
Universidad de Córdoba, sede
Berástegui.
 Cuantificar biomasa de celular de
S. cerevisiae a través de la técnica
densidad óptica.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
 Centrífuga
 Pipetas graduadas
 Pipetas automáticas
 Auxiliar de pipeteo
 Beakers
 Erlenmeyers
 Tubos para centrífuga
 Pinzas
2.1. Reactivos
 Cultivo de Levadura
 Agua destilada
3. METODOLOGÍA
3.1. Preparación del cultivo madre
Se disolvieron aproximadamente 0,5 gr.
de levadura seca comercial
(Saccharomyces cerevisiae) en un
Erlenmeyer que contenia 200 mL de agua
destilada estéril.
3.2. Preparación de las soluciones
problemas
En una balanza analítica se pesaron 6
tubos de ensayo de 20 mL, los cuales
fueron previamente secados en estufa
durante una noche a 95°C. Las diluciones
fueron preparadas como lo indica la tabla
1.
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Tabla 1. Diluciones de levadura (S.

cerevisiae) partiendo de un cultivo madre.
TUBO 1 2 3 4 5 6 1 mm 2
Ac= =0.04 mm 2
25
mL de 0 8 6 4 2 0
agua Y el volumen por cada cuadro se obtuvo
de la siguiente manera:
mL de 0 2 4 6 8 10 𝑉 = 5𝐴𝑐 ∗ 𝑝𝑟𝑜𝑓𝑢𝑛𝑑𝑖𝑑𝑎𝑑
cultivo
𝑉 = 5(0.04𝑚𝑚2) ∗ 0.1𝑚𝑚
𝑉 = 0.02𝑚𝑚3 = 0.0000 𝑚𝐿

3.3. Medición de la biomasa Se tiene que la concentración de

microbiana por conteo directo en células/mL se calculó con la siguiente
cámara de Neubauer ecuación:

3.3.1. Se agito en un vortex el cultivo de

levadura.
N ° celulas
[ celulas ] =
3.3.2. Se tomó aproximadamente 0,5 mL 0.00002∗F
de la solución con un gotero desechable
estéril.
* Donde F = Factor de dilución
3.3.3. Se depositó una alícuota de la
solución en la cámara de Neubauer. 3.4. Medición de la biomasa
microbiana por densidad óptica
3.3.4. Se ubicó la cámara en la platina de
un microscopio compuesto y se enfocó la Se tomó 2 mL de cada muestra problema,
cuadrícula con los objetivos de menos que posteriormente se adicionaron en
aumento (4X y después 40X) para tubos tapar roscas mezclándose con mL
visualizar la cámara. de agua destilada estéril; después se agitó
cada tubo en el vortex y la absorbancia
3.3.5. Se contó las células que se
fue leída con ayuda de un
encuentren dentro de los 5 cuadros
espectrofotómetro a una longitud de onda
marcados con sombra.
de 540 nm.
Sabiendo que el área de cada cuadro es de
3.5. Medición de la biomasa
1mm2, con una profundidad de 0.1mm.
microbiana por peso seco celular
Entonces el área de cada uno de los 25
cuadros es: Los 6 tubos que contenían las soluciones
originales de lavadura (volumen restante
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conocido) fueron centrifugados a 4000 Para los 6 tubos la concentración de

rpm durante 15 minutos, con ayuda de células/mL fue:
una pipeta se retiró cuidadosamente el
N ° celulas
sobrenadante. Posteriormente, los tubos [ celulas ] =
0.00002∗F
fueron llevados a evaporación del agua
restante en una estufa a 90ºC durante 20
horas. Estos finalmente fueron pesados.
0
[ tubo1 ] = −1
0.00002∗10
4. RESULTADOS ¿ 0 celulas /mL
4.1. Medición de la Biomasa
Microbiana por Conteo Directo en
225
Cámara de Neubauer [ tubo2 ]= −1
0.00002∗10
¿ 1125000 celulas /mL
En la tabla 2, se consolidaron los
resultados observados en la cámara de
Neubauer para cada una de las diluciones. 184
[ tubo 3 ] = −1
Tabla 2. Numero de levaduras (S. 0.00002∗10
cerevisiae) en la cámara de Neubauer ¿ 920000 celulas /mL
Tu Tu Tu Tu Tu Tu
bo bo bo bo bo bo
1 2 3 4 5 6 1 98
[ tubo 4 ]= −1
ESD 0 40 33 37 35 36 0.00002∗10
ESI 0 38 37 42 32 35
¿ 990000 celulas /mL
CEN 0 47 35 33 28 34
TRO
EID 0 31 35 39 26 43
155
EII 0 45 44 47 34 47 [ tubo 5 ] = −1
TOT 0 22 18 19 15 19 0.00002∗10
AL 5 4 8 5 5 ¿ 775000 celulas /mL

ESD= esquina superior derecha; ESI=

esquina superior izquierda; EID = 1 95
[ tubo 6 ] =
esquina inferior derecha; EII= esquina 0.00002∗10−1
inferior izquierda.
¿ 975000 celulas /mL
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4.2. Medición de la Biomasa grafica), así, como el coeficiente de

Microbiana por Densidad Óptica determinación R2
En la siguiente tabla se observan los
valores de las lecturas tomadas de
absorbancia en el equipo
espectrofotómetro de las diluciones
problema.
Tabla 3. Absorbancias de levadura leídas
a 540 nm
Tubos Abs 540 nm
1 0.000 R=
2 0.289 0.614454240331941

3 0.474
4 0.697
5 0.800
6 0.930
Figura 1. Abs vs concentración de
cultivo de levadura.
El coeficiente de determinación R
obtenido fue de 0,614454240331941. Por
lo que el resultado del coeficiente se
encuentra en el rango de 0 y 1 (0%-
100%) entre más próximo esté valor a
cero menos ajustado será el modelo.

4.3. Medición de la Biomasa

Tabla 4. Células/mL y absorbancia
Microbiana por peso seco celular
Tubos Celulas/mL Abs 540
Para encontrar el peso de la levadura en
nm
gramos por cada tubo se utilizó la
1 0.000 0,000
siguiente ecuación
2 1125000 0,289
3 920000 0,474
4 990000 0,697 W lavadura=W tubo seco +levadura−W tubovacio
5 775000 0,800
6 975000 0,930
En la tabla se consolidó el peso en
Con la tabla, usando el programa Excel se gramos de levadura por cada tubo y peso
obtuvo la gráfica células/mL vs Abs (ver seco vacío
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Tabla 5. Peso de tubos con y sin levadura Tabla 7. Concentración gr células/L

Tubos Peso seco Peso seco con TUBOS Gr CELULAR/ L
vacío levaduras
1 5,2558 5,2556 1 0,0285714286
2 5,5788 5,5792 2 0,0571428571
3 5,7272 5,7573
4 5,2613 5,2618 3 0.3
5 5,4472 5,4494
4 4.3
6 5,2607 5,2636
5 0,3142857143
6 0.4142857143
Tabla 6. Gramos de levadura (S.
cerevisiae).
Tubos g de levadura Tabla 8. Concentración de g células/L Vs
1 0,0002 Abs.
2 0,0004
gr células /L absorbancia
3 0,0021
0,028571429 0
4 0,0301
0,057142857 0,289
5 0,0022
6 0,0029 0,3 0,474
4,3 0,697
0,314285714 0,8
Para el cálculo de los g células/mL, se utilizó 0.4142857143 0,93
la siguiente ecuación:

Con los datos de la tabla 8 se obtuvo por

g g medio de Excel la figura siguiente que se
= celulas
L Ldisolucion muestra.

En donde para todos los casos se

utilizaron 0,007L dando los resultados
plasmados en la tabla 7.
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diluciones problemas en valores de

absorbancia células/mL.
1
0.9 f(x) = 0.183028571428571 x − 0.108933333333333
0.8 R² = 0.972384950061118 La medición de la biomasa microbiana
0.7
0.6 por conteo directo en la cámara de
0.5
0.4 Neubauer no es un método totalmente
0.3
0.2 preciso ya que la mayor dificultad con el
0.1
0 conteo de la cámara es lograr la
29 57 0,
3
4,
3 14 43
714 428 857 571
85 71 42 8 repetibilidad en el llenado de la cámara.
02 05 31 42
0, 0, 0, .41
0
De los resultados obtenidos por el método
Fig 1. g células/mL Vs Abs. de densidad óptica se puede realizar
análisis en conjunto con las pruebas de
5. CONCLUSIÓN los métodos conteo directo de la cámara
de Neubauer y Peso seco para estimar los
La realización de esta práctica, permitió
valores del peso seco del cultivo de
que los estudiantes de la asignatura de
levaduras y el número de células
Biotecnología del programa de Ingeniería
presentas en la misma.
de Alimentos de la Universidad de
Córdoba, Colombia, se evaluaran algunos
de los métodos más utilizados para el 6. CUESTIONARIO
recuento de microorganismos
 Consulte y explique otros
determinando así mismo las ventajas y
métodos utilizados para la
desventajas de las mismas.
medición de la biomasa
Se logró medir la biomasa microbiana microbiana.
mediante el uso de las técnicas de la
Para la medición del crecimiento
cámara de Neubauer.
microbiano se emplean otros métodos de
De igual manera se calculó y reportó la conteo microbiano entre los cuales
concentración celular de cada uno de las podemos encontrar:
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Métodos de siembra: El recuento de Métodos bioquímicos: Las medidas de

microorganismos viables se fundamenta alguna actividad enzimática pueden
en la capacidad de dichas células viables considerarse como una alternativa a los
de desarrollar una colonia visible en un métodos tradicionales. Los ensayos
medio de cultivo apropiado. En los enzimáticos son simples de realizar y sus
recuentos en placa por vertido, un resultados se obtienen rápidamente.
volumen de 0,1- 1 ml de la suspensión Además. El equipamiento necesario no es
microbiológica se mezcla con el medio de ni costoso ni complejo. La mayoría de las
cultivo fundido y parcialmente enfriado medidas de actividad enzimática se
en una placa de Petri. En los recuentos en realiza mediante la conversión de
placa por siembra en superficie, se sustratos específicos a productos
extiende un volumen de coloreados que son cuantificados
aproximadamente 0,1 ml de la suspensión fotométricamente. La principal desventaja
sobre la superficie del medio de cultivo. de los métodos bioquímicos es la
Los resultados de los recuentos en placa variación de las actividades enzimáticas
se expresan como unidades formadoras de celulares con los cambios fisiológicos y
colonia (UFC) por unidad de volumen de que, una vez que los microorganismos
la suspensión microbiológica mueren, las enzimas liberadas pueden
(Arnaiz,Isac, & Lebrato, 2000) seguir activas. Entre las distintas medidas
de actividad enzimática cabe destacar la
Determinación de ATP: La
actividad esterasa y la actividad
determinación de adenosin trifosfato
deshidrogenasa (Arnaiz, Isac, & Lebrato,
permite cuantificar de manera indirecta la
2000)
masa de una población microbiana, al
haber presencia de ATP quiere decir que Métodos cinéticos: La base de estos
hay bacterias vivas. (Arnaiz, Isac, & métodos es la medida del consumo de
Lebrato, 2000) sustrato o de la formación de producto en
ensayos en discontinuo. El ejemplo más
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típico en microorganismos aerobios es la Determinación de DNA: La

determinación de la DBO, que indica la determinación de DNA puede emplearse
biodegradabilidad de un sustrato en como la determinación de la masa
disolución a través del consumo de microbiana, suelen emplearse reacciones
oxígeno del medio. Se encuentran: con colorantes fluorescentes como el
Adaptaciones del Respirómetro de bromuro de etidio y la
Warburg, tasa de respiración, tasa de espectrofluorometria (Lebrato, 2000).
desaparición de sustrato, potencial
bioquímico de producción de metano
(Arnaiz, Isac, & Lebrato, 2000)  Consulte las ventajas y
desventajas de cada uno de las
Componentes celulares específicos:
técnicas utilizadas en este
Cualquier componente celular
experimento.
seleccionado para la estimación de la
biomasa viva de una muestra debe Medición de la biomasa microbiana

responder a tres criterios fundamentales: por conteo directo en la cámara de

Estar presente únicamente en células neubauber.

vivas, ser rápidamente degradado en De acuerdo con Arnáiz, et al., 2000,

células vivas, ser relativamente constante
Ventajas: Es un método rápido, se
en concentración respecto a cambios en el
observan células viables y no viables,
estado fisiológico celular y entre distintas
brinda información adicional sobre
especies. Hasta el momento no existe
morfología y el tamaño de los objetos que
ningún componente celular que cumpla
son contados.
estos tres requerimientos. Sin embargo,
los más adecuados para estimar biomasa Desventajas: No es un método muy
viva, son los ácidos nucleicos, las exacto debido a las irregularidades en la
proteínas, los polisacáridos, los lípidos y distribución de la muestra, pueden
el ATP (Arnaiz, Isac, & Lebrato, 2000). confundirse las células con otras formas
orgánicas e inorgánicas existentes en el
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medio, no permiten distinguir células consumen bastante tiempo y son poco

vivas de células muertas. reproductibles. Barcina, 2012.

Medición de la biomasa por densidad ¿Qué son los colorantes supravitales y

óptica para qué se usan?

Ventajas: Método rápido y fácil, se puede
trabajar con densidadesde microbianas
bajas, de microorganismos de tamaño de
unos cuantos nanómetros.
Desventajas: Son muy útiles y poderosos,
pero pueden llevar a resultados erróneos,
por eso es necesario hacer varias pruebas,
son de alto costo ya que son equipos
especializados que se componen de
fuentes de radiación de longitud de onda
de interés.
Medición de la biomasa microbiana
por peso seco celular
Las células en cultivo presentan una gran
ventaja para su estado porque pueden ser
manipuladas y modificadas
experimentalmente añadiendo una
sustancia miscible con el medio de
cultivo. Esta sustancia puede ser un
agente químico, una sustancia
cancerígena, un virus, etc. La alteración
fenotípica y /o genotípica de las células
pueden modificar la viabilidad e incluso
comprometer su supervivencia in vitro.
Los cambios celulares, así como la
viabilidad del cultivo, son procesos
graduales que pueden ser observados

Ventajas: Esta técnica es útil para grandes directamente con diferentes colorantes

volúmenes de muestra, debido a que supravitales. Los colorantes supravitales

diferencia del orden de los miligramos que tiñen las células vivas en cultivo son:

representa el peso de un gran número de rojo neutro, verde Jano, azul tripán,

bacterias, es un método directo y carmín de litio, alizarina, etc. El uso del

sencillo.Desventajas: La desventaja de colorante supravital añadido al medio de

este método es que componentes volátiles cultivo permite identificar las células

de la célula pueden perderse por el secado teñidas como las células viables. Las

y puede existir alguna degradación, células que no captan el color son células
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en proceso de degeneración, no viables in file:///C:/Users/yo/Downloads/eco

vitro. b,+LAZA0808110117A.PDF%20
(1).pd.

7. BIBLIOGRAFÍA

 Arnaiz, C. &., & Isac, L. &. J.

(2000). Determinación de la
biomasa en procesos biológicos I.
Métodos directos e indirectos.
Technologia del Agua, 20, 45–52.
 Barcina, 2012. Como abordar y
resolver aspectos prácticos de
lamicrobiología
 Pascual, M. V. B. (2013).
Métodos morfológicos aplicados
al estudio de cultivos de células
animales. Cultivo de células
animales y humanas. aplicaciones
en medicina regenerativa.
 Lebrato, 2000. Determinación de
la biomasa en procesos biológicos.
Disponible en:
http://sgpwe.izt.uam.mx/files/user
s/uami/tvolke/00_DeterminBM.pd
f.
 Iglesias, M. (2008). Estudio del
carbono de la biomasa
microbiana. Obtenido de