PRODUCCIÓN DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHAS) A PARTIR DE Ralstonia eutropha EN UN

MEDIO CON HARINA DE YUCA COMO FUENTE DE CARBONO

Introducción

Los polihidroxialcanoatos (al que vamos a llamar PHA) son biopolímeros sintetizados por bacterias,
biodegradables y presentan propiedades termoplásticas. Producir por fermentación bacteriana un
Kg de PHA costaba 15 dólares, mientras que hacer un Kg de plástico convencional costaba 3
dólares, es por esta razón que se han propuesto tipos de sustrato como una estrategia para
reducir los costos de producción. Se evaluó la harina de yuca ya que es de bajo costo y ofrece al
microorganismo la energía para sus procesos metabólicos. La yuca es un tubérculo de aspecto
leñoso que constituye una de las fuentes de energía más importantes en las regiones tropicales
del mundo.

La Ralstonia eutropha es una bacteria utilizada en la producción de PHA debido a que es capaz de
almacenar un 96% de este material en peso seco.

Entonces podemos decir que el objetivo es la obtención de PHA a partir de Ralstonia eutropha

Métodos

 Activación y crioconservación de Ralstonia eutropha

La Ralstonia eutropha es activada en Tripticasa soya (qué es un medio que favorece el desarrollo y
aislamiento de microorganismos) a 32°C por 48 hs. Fue crioconservada en glicerol al 15% a
temperaturas inferiores a 0°C.

 Obtención de glucosa a partir de harina de yuca por hidrólisis enzimática

Se realiza una hidrólisis enzimática (que es una reacción química en la que las moléculas de agua
se dividen en sus átomos componentes (hidrógeno y oxígeno)). Las enzimas utilizadas fueron BAN
480L del tipo alfa-milasa, y DEXTROZIME GA del tipo glucoamilasa.

Se purificó el jarabe con una columna de carbón activado y se determinó la glucosa por el método
DNS (técnica que emplea un procedimiento que se basa en una reacción redox que ocurre entre el
DNS, compuesto orgánico aromático, y los azúcares presentes)

 Fermentación bacteriana con Ralstonia eutropha

Se llevó a cabo por 36 horas en un medio mineral mínimo de sales a 30°C usando como inoculo la
bacteria cultivada. Como variables de respuestas se emplearon las pruebas de conteo en placa por
el método NMP y turbidez para determinar biomasa y análisis mediante la técnica de DNS para
consumo de sustrato.

Con el fin de inducir la formación intracelular del biopolímero en la bacteria se estableció una
limitación nutricional, se limitó la fuente de nitrógeno y se suministró un exceso de fuente de
carbono. Se determinaron como relaciones a evaluar 12:1 16:1 20:1 24:1 28:1 usando como fuente
de carbono jarabe de glucosa.

 Prueba de turbidez
Se realizó un seguimiento midiendo la turbidez de cada muestra a 500 nm cada 3 horas.

 Técnica de número más probable

Se dividió la placa de Petri en cinco zonas y se sembraron cinco microgotas incubadas a 30°C por 2
días en cada zona. La población se determinó con base a la tabla de número más probable para
series de diluciones en réplicas de 5 por nivel de dilución.

 Determinación de consumo de sustrato mediante DNS

Determina la concentración de azúcares reductores se empleó un ml de la muestra obtenida de la

fermentación a intervalos de 3 horas a una concentración de 800 ppm luego se agregó un ml del
reactivo de dns y finalmente se agregaron 3 ML de agua destilada, los tubos se agitaron por 30
segundos, se llevaron evolución por cinco minutos y se detuvo la reacción en baño de hielo
durante 10 minutos, para realizar la lectura de las muestras.

 Extracción del biopolimero obtenido

Se centrifugó el medio fermentado a 4500 rpm por 15 minutos. La extracción se realizó

empleando ácido sulfúrico, se llevó a ebullición para nuevamente centrifugar y ajustar el pH. Las
muestras se secaron por 10 horas a 30°C. El biopolímero fue decolorado con hipoclorito de sodio
al 3%

 Caracterización térmica

Se realizó por calorimetría de barrido diferencial, las muestras fueron sometidas a un barrido
térmico. Se tomaron 5 mg del material y se depositaron en una cápsula, luego se sometió al ciclo
de enfriamiento y calentamiento.

 Caracterización estructural

Para la prueba de infrarrojo espectral con transformada de fournier se prepararon pastillas por
medio de prensado compuestas por bromuro de potasio y PHA macerado. La pastilla se colocó en
el compartimento del equipo y se procedió a hacer un barrido en la franja de infrarrojo. Se obtuvo
el espectro para su análisis.

Para la microscopia electrónica de barrido se cortaron y prepararon los pellets activos en una
doble capa de bronce, y luego se cubrieron con una capa de oro. Las muestras se examinaron
usando un acelerador de voltaje y se mantuvieron a una humedad de 68% y 23°C.

Resultados

 Activación de la bacteria

Se identifico a nivel macroscópico que las colonias eran uniformes, de buen tamaño y color beige

 Jarabe de glucosa a partir de la hidrólisis enzimática de harina de yuca

Se observó un cambio de color, de blanco a café claro, debido a la generación de dextrosas y

algunos carbohidratos, los factores son la concentración de enzima y el tiempo de reacción

 Fermentación bacteriana y extracción del biopolimero

El factor a evaluar fue la relación carbono/nitrógeno

(Aquí va el cuadro)

La mejor relación de C/N fue 20, con mayor producción de biopolímero de 0,62 g/L.

 Prueba de turbidez

En fermentación la bacteria se adapta al medio MSM, al tiempo la acumulación del biopolímero

por la limitación del nitrógeno y el exceso de glucosa como fuente de carbono.

 Técnica de número más probable

Se inició con una concentración celular de 7,67*106 cel/ml al cabo de 20 horas, cuando se inicia la
fase estacionaria el número máximo de células generadas es de 9,00*109 cel/ML, la cantidad de
células viables se mantuvo y descendió paulatinamente.

 Determinación de consumo de sustrato mediante DNS

Luego de 20 horas de fermentación, la bacteria inicia la fase estacionaria en la cual se dio un

equilibrio entre las bacterias generadas y las células no viable.

 Caracterización térmica

Las muestras presentaron una temperatura de transición vítrea alrededor de 146°C, con lo cual se
deduce la presencia de un polímero. Se observa que el material obtenido es similar a
polihidroxibutirato.

La temperatura de fusión del biopolímero fue de 168,58°C..

El biopolímero presenta una temperatura de descomposición de 274,12°C.

 Caracterización estructural

El análisis de las muestras obtenidas por FTIR permitió confirmar el material obtenido es PHB, la
prueba de Microscopia electrónica de barrido (SEM), permitió determinar, la forma, tamaño y
distribución del material lo cual es útil para seguir una cinética de formación, dispersión y
compatibilidad de las fases presentes y estudios de degradación del biopolímero.

Conclusión

Mediante el proceso de hidrólisis enzimática, para la obtención de jarabe de glucosa a partir de

harina de yuca, se logró obtener un equivalente de dextrosa del 79% corroborando el alto
rendimiento del proceso, esta hidrolisis catalizada por enzimas, fue un proceso que no generó
productos secundarios que actúen como compuestos antagónicos para el establecimiento y
crecimiento de la bacteria en el medio de fermentación.

La producción de PHA utilizando jarabe de glucosa, cedió en mayor proporción al emplear una
relación carbono/nitrógeno de 20.