“AÑO DE LA DIVERSIFICACIÓN PRODUCTIVA Y DEL

FORTALECIMIENTO DE L EDUCACIÓN”

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL INGENIERIA
AGROINDUSTRIAL

CURSO:
LABORATORIO DE INGENIERÍA DE BIOPROCESOS

DOCENTE:
Dr. Ing. Castillo Calderón Augusto

TEMA:
INGENIERÍA DEL CULTIVO CELULAR POR LOTE Y
MEDICIÓN DEL KLa

ESTUDIANTES:
León Vásquez Susan Carolina
López Perez Rony
Mejía rocha Johann Luigi
Ortiz Moreno Ángela Marcela
Sifuentes Penagos Gabriel Omar

CICLO:
VII

NUEVO CHIMBOTE-2015
RESUMEN

El presente trabajo se realizó con el objetivo de diseñar y realizar una

experiencia de fermentación en cultivo celular por lote de Kluyveromyces
marxianus NRRL Y-7571, en un medio optimizado que contiene extracto de
yacón, a fin de medir el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno a
distintas condiciones de aireación y agitación; así como, determinar la cinética
de crecimiento de la biomasa; los perfiles de fuente de carbono, oxígeno
disuelto y pH a través del tiempo total de fermentación en el biorreactor.

El pre-inóculo se preparó en dos matraces Erlenmeyer de 125 mL conteniendo

cada uno 30 mL de medio de activación celular. El medio se inoculó con una
azada de células mantenida en un agar inclinado, previamente activadas, se
dejó cultivar en un shaker a 30°C Y 180 rpm durante 10 horas. Luego el inóculo
preparado en matraces Erlenmeyer de 500 mL conteniendo 100 mL de medio
de activación y cultivado en las mismas condiciones anteriores.

Luego se cultivó 2 L de medio de fermentación en el BIOSTAT-Aplus y al cabo

de las 2 horas se aplicó el método Dinámico al cabo de cultivo, cuando los
microorganismos se encontraron en la fase exponencial de su crecimiento,
según la matriz experimental de valores de la tabla mostrada en el informe. El
método consistió en tomar lecturas de concentración de oxígeno disuelto a
cada intervalo de tiempo tanto para la fase gasificada como para la fase de
corte de aire.

Método, la experiencia se realizó con un volumen de trabajo de 2 L, controlado

a 30°C y operándose a diferentes condiciones de agitación (N) y velocidad
superficial de aire (Vs) en los rangos 550 a 850 rpm y 7.98 a 23.68 cm/min,
respectivamente.

La matriz de valores obtenidos de K La fueron correlacionados a un modelo que

tuvo como variable dependientes a N y Vs, resultando un coeficiente de
correlación múltiple de 0.961.

En las condiciones de operación ensayadas el valor de K La obtenido mostró ser

más dependiente de la velocidad superficial de aireación que de la velocidad de
agitación.

INFORME FINAL DEL EXPERIMENTO

 TITULO: INGENIERIA DEL CULTIVO CELULAR POR LOTE Y MEDICIÓN
DEL KLa

I. INTRODUCCIÓN
La inulinasa es una enzima caracterizada por hidrolizar la inulina en fructosa
prácticamente pura, sacárido ampliamente usado en la industria de
alimentos como edulcorante dietético.

Actualmente existe el interés por producir inulinasa, purificarla y

caracterizarla, a partir de cultivos microbianos en medios sintéticos y
medios complejos de extractos de vegetales, siendo las levaduras
Kluyveromyces las más estudiadas (Castiillo y Chamy 2010; Cazetta 2005 y
Kango 2008).

La producción de inulinasa por fermentación es aerobia. En los bioprocesos

aeróbicos, el oxígeno es un sustrato clave, debido a su baja solubilidad en
los caldos de cultivo (solución acuosa), por lo que es necesario su
suministro continuo. La velocidad de transferencia de oxígeno deber ser
conocida y en lo posible predicha, para lograr una operación de diseño
óptimo y el escalamiento de birreactores (García-Ochoa y Gómez 2009)

En este trabajo buscamos conocer los valores y su correlación matemática

del coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, determinados por el
método Dinámico, de un fermentador de laboratorio BIOSTAT-Aplus,
fermentando levaduras de Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 en un
medio de cultivo optimizado compuesto de extracto de yacón como fuente
de carbono y energía, para la producción de un enzima inulinasa.

II. OBJETIVOS

1.1. Objetivos generales

Diseñar y realizar una experiencia de fermentación en cultivo celular

por lote de Kluyveromyces marxianus NRRL Y -7571, en un medio
que contiene extracto de yacón, a fin de medir el coeficiente
 volumétrico de transferencia de oxígeno a distintas condiciones de
aireación y agitación.

1.2. Objetivos específicos

 Identificar y describir las partes, accesorios y geometría de un

fermentador de laboratorio, conocimiento de su operación,
esterilización, carga y descarga y toma de muestras.
 Identificar en el fermentador los instrumentos de medición y
control automático, así como la calibración de los sensores.
 Identificar en el fermentador los instrumentos de medición y
control automático, así como la calibración de los sensores.
 Determinar el umáx, Yx/s y Qx en el cultivo por lote.
 Determinar el KLa por el método Dinámico de Humphry y
correlacionar los resultados.
 Obtener los perfiles de masa celular, fuente de carbono, oxígeno
disuelto y pH a través del tiempo total de fermentación en el
biorreactor.

III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS

3.1. Esterilización de pipetas y viales
Materiales:
 Pipetas
 Algodón (filtro pipeta)
 Viales
 Papel aluminio
Equipo:
 Horno de esterilización y presión (Estufa)

3.2. Preparación de reactivos del medio líquido de

activación

Reactivos:
 Agua destilada
  10 g/L de sacarosa (Loba Chemie)
 3 g/L de extracto de levadura (Merck)
 5 g/L de peptona (Bioceno)
 0.65 g/L MgSO4.7H2O (Sigma)
 100 mL/L pH 6
Equipos:
 Balanza analítica

3.3. Preparación y esterilización del medio líquido de

activación
Materiales:
 01 Matraz Erlenmeyer 125 mL
 01 tubo de ensayo (40 mL)
 Pipeta
 Papel aluminio
 Gaza (tampones)
Equipos:
 Olla a presión (autoclave)

3.4. Activación de las cepa microbiana

Equipos:
 Incubadora

3.5. Inoculación del medio sólido de mantención al medio

líquido de fermentación
Materiales:
 Algodón
 Asa bacteriológica
 Mechero bunsen
Reactivos
 Alcohol de 96°
3.6. Preparación de reactivos del medio optimizado de
fermentación (matraz)

Reactivos:

 Agua destilada
 26.2 g/L de extracto de yacón
 10 g/L de extracto de levadura
 10 g/L de (NH4)2SO4
 1 g/L de KH2PO4
 0.386 g/L de MgSO4.7H2O
 100 mL/L Tampón pH 6
Equipos:
 Balanza analítica

3.7. Preparación y esterilización del medio optimizado de

fermentación (matraz)

Materiales:

 01 Matraz Erlenmeyer 500 mL

 02 tubos de ensayo (40 mL)
 Pipetas
 Papel aluminio
 Gaza y algodón (tampones)
Equipos:
 Olla a presión (autoclave)

3.8. Inoculación del medio líquido de activación al medio

de fermentación optimizador (matraz)
Materiales:
 Algodón
 Mechero bunsen
Reactivos
 Alcohol de 96°
3.9. Preparación de reactivos del medio optimizado de
fermentación para biorreactor

Reactivos:

 Agua destilada
 26.2 g/L de extracto de yacón
 10 g/L de extracto de levadura
 10 g/L de (NH4)2SO4
 1 g/L de KH2PO4
 0.386 g/L de MgSO4.7H2O
 100 mL/L Tampón pH 4
Equipos:
 Balanza analítica

3.10. Preparación y esterilización del medio optimizado de

fermentación para biorreactor

Materiales:

 Vaso del Biostat-Aplus

 02 Matraz Erlenmeyer 0.5 L
 Pipetas
 Papel aluminio
 Gaza y algodón (tampones)
Equipos:
 Autoclave

3.11. Inoculación del medio de fermentación (matraz) al

biorreactor
Materiales:
 Algodón
 Mechero bunsen
Reactivos
 Alcohol de 96°
3.12. Medición del KLa por el método dinámico de Humphry
Materiales
 Papel
 Lápiz, lapicero
 Cronometro
Instrumentos e Equipos
 Biorreactor
3.13. Determinación de la concentración celular por d.o
3.13.1. Diluciones para la curva de calibrado
Materiales:
 Matraz conteniendo el medio de fermentación.
 Gasa y algodón
 Tubos de celda
 Tubos de ensayo
 Pipetas estériles
 Gradilla
Equipos:
 Espectrofotómetro
Reactivos:
 Agua destilada

3.13.2. PESO SECO

Materiales:
 Matraz conteniendo el medio de fermentación.
 Gasa y algodón
 Tubos de celda
 Tubos de ensayo
 Pipetas estériles
 Capachos de aluminio
Equipos:
 Espectrofotómetro
 Centrifuga
 Estufa
  Balanza analítica
Reactivos:
 Agua destilada
3.14. Determinar proteínas por el método de Bradford
3.14.1. Preparación de reactivo de Bradford
Materiales:
 Fiola de 1L

Reactivos:

 Azul de coomassie G
 Etanol al 98 %,
 Ácido fosfórico al 85 %
 Agua destilada

3.14.2. Método de Bradford

Materiales:

 Tubo de ensayo
 Pipetas

Equipos:

 Espectrofotómetro

IV. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

4.1. Esterilización de pipetas y viales

Para obtener un cultivo puro debemos tomar medidas asépticas y

una de ellas es la esterilización de nuestros instrumentos y
materiales, y para ello necesitamos lo siguiente:
Materiales:
 Pipetas
 Algodón (filtro pipeta)
 Viales
 Papel aluminio
 Equipo:
 Horno de esterilización y presión (Estufa)

Se precisa realizar los siguientes pasos para la

esterilización de pipetas y viales:
1. Las pipetas y viales, serán lavados y secados en la
estufa
2. Luego en cada pipeta se colocara un filtro de
algodón para no contaminarlo al momento de ser
utilizada.
3. Las pipetas serán forradas con papel aluminio y
junto a las viales puestas a la estufa por un tiempo
20 minutos a temperatura de 140-150ºC.

DIAGRAMA DE BLOQUES DEL PROCESO

Pipetas y viales a
Lavar utilizar

Instrumentos y
Secar materiales en la
estufa

Algodón a cada
Colocar pipeta (función filtro)

Todas las pipetas

Envolver con papel de
aluminio

Esterilizar Estufa (calor seco)

 4.2. Preparación de reactivos del medio líquido de activación

Para la preparación del medio de activación, requerimos lo

siguiente:
Equipos:
 Balanza analítica
Reactivos:
 Agua destilada
 10 g/L de sacarosa (Loba Chemie)
 3 g/L de extracto de levadura (Merck)
 5 g/L de peptona (Bioceno)
 0.65 g/L MgSO4.7H2O (Sigma)
 100 mL/L solución tampón pH 6

Pesas las cantidades requeridas de cada compuesto, con mucho

cuidado, en base a 15 mL.
Tabla B-1

Nutriente Cantidad Cantidad

(g/l) (g/15 ml)

Sacarosa 10 0.15
Extracto de levadura 3 0.045
Peptona 5 0.075
MgSO4.7H2O 0.65 0.01

4.3. Preparación y esterilización del medio líquido de activación

Materiales:
 01 Matraz Erlenmeyer 125 mL
 01 tubo de ensayo (40 mL)
 Pipeta
 Papel aluminio
 Gaza (tampones)
 Equipos:
 Olla a presión (autoclave)
En función a los pesos dados en la tabla B-1:
1. En un matraz de 125 mL mezclar la sacarosa y
adicionar 5 ml de agua destilada.
2. En un tubo de ensayo de 40 mL mezclar el extracto
de levadura con la peptona, MgSO 4.7H20 y adicionar
10 mL de agua destilada.
3. Tapar los matraces con tapones de gasa y recubrir
los picos con papel aluminio, llevar a esterilizar por
15 minutos en la olla a presión.
4. Dejar enfriar a temperatura ambiente.

DIAGRAMA DE BLOQUES DEL PROCESO

C/u de los nutrientes

Pesar como indica la Tabla
B-1

Tubo de ensayo
Matraz de 125 ml

Agregar Agregar
Extracto de levadura
Sacarosa Peptona
MgSO4.7H20

Agregar Agregar

5 ml 10 ml
Agua destilada Agua destilada

Todo lo anterior
Esterilizar en olla a presión
por 15 min
4.4. Activación de las cepa microbiana
Equipos:
 Incubadora
El microorganismo debe estar en incubación 1
hora antes de usarlo.
4.5. Inoculación del medio sólido de mantención al medio líquido
de fermentación
Materiales:
 Algodón
 Asa bacteriológica
 Mechero bunsen
Reactivos
 Alcohol de 96°

Para el resembrado de células:

1. Desinfectar el ambiente con alcohol de 96° a un
radio de 30 a 40 cm.
2. Encender el mechero bunsen para esterilizar los
instrumentos a utilizar en el momento y
proporcionar un radio aséptico.
3. Someter el filamento del asa bacteriológica al
fuego hasta que llegue al rojo vivo.
4. Enfriar por unos segundos, y luego introducir el
asa en el tubo con la cepa.
5. Con el asa extraer la cepa desarrollada.
6. Volver a flamear el tubo y cerrar
7. Introducir el filamento metálico del asa
bacteriológica al matraz de 125 ml con los 15 ml
de medio de activación, y mover
8. Flamear el matraz y colocar el tapón
9. Llevar a incubar al Shaker 180 rpm y 30°C por 9
horas
DIAGRAMA DE BLOQUES

El área de trabajo
Desinfectar con alcohol °96

Mechero para un
Encender radio aséptico

El asa bacteriana al
Someter fuego a rojo vivo

El asa por las paredes

Enfriar
del tubo que contiene la
cepa

Una asada de la
Extraer
célula desarrollada

Flamear El tubo antes de

cerrarlo

En matraz de 15
Inocular mL de medio de
activación

Flamear El matraz antes de

cerrarlo

Incubar A 30°C y 180 rpm

por 10 horas.
4.6. Preparación de reactivos del medio optimizado de
fermentación (matraz)

Equipos:

 Balanza analítica
Reactivos:
 Agua destilada
 26.2 g/L de extracto de yacón
 10 g/L de extracto de levadura
 10 g/L de (NH4)2SO4
 1 g/L de KH2PO4
 0.386 g/L de MgSO4.7H2O
 100 mL/L Solución tampón pH 4

La preparación del medio líquido de fermentación

requiere de lo siguiente.
1. Pesas las cantidades requeridas de cada
compuesto, con mucho cuidado, en base a 90
mL:

Tabla C-1

Nutriente Cantidad (g/l) Cantidad (g/100ml)

Extracto de yacón %(v/v) 26.2 23.6
Extracto de levadura 10 0.9
(NH4)2SO4 10 0.9
KH2PO4 1 0.09
MgSO4.7H2O 0.386 0.0347

4.7. Preparación y esterilización del medio optimizado de

fermentación (matraz)

Materiales:

 01 Matraz Erlenmeyer 500 mL

 02 Tubos de ensayo (40 mL)
  Pipetas
 Papel aluminio
 Gaza (tampones)
Equipos:
 Olla a presión (autoclave)

1. En un matraz de 500 mL adicionar 23.6 ml y

mezclar con 16.4 mL de agua destilada.
2. En un tubo de ensayo mezclar el extracto de
levadura, adicionar 20 ml de agua destilada.
3. En un tubo de ensayo mezclar los demás
nutrientes, adicionar 20 mL de agua destilada.
4. Tapar los matraces con tapones de gasa y
recubrir los picos con papel aluminio, llevar a
esterilizar por 15 minutos en el autoclave.
5. Dejar enfriar a temperatura ambiente.

DIAGRAMA DE BLOQUES DEL PROCESO

C/u de los nutrientes

Pesar y medir como indica la Tabla
C-1

En matraz de 500 ml En tubos de ensayo En tubos de ensayo

Agregar Agregar Agregar

Extracto de Extracto de (NH4)2SO4 + KH2PO4 +

Yacón levadura MgSO4.7H2O

Adicionar Adicionar Adicionar

20 ml 20 ml
16.4 ml
Agua destilada Agua destilada
Agua destilada

Todo lo anterior
Esterilizar en olla a presión
4.8. Inoculación del medio líquido de activación al medio de
fermentación optimizador (matraz)
Materiales
 03 Matraces con nutrientes que forman parte del
medio de fermentación (matraz)
 Medio de activación (15 mL)
 Mechero bunsen
Reactivos
 Alcohol etílico 96°
Equipos
 Shaker (Incubadora)

Para inocular el medio de fermentación

1. Desinfectar el ambiente con alcohol de 96° a
un radio de 30 a 40 cm.
2. Encender el mechero bunsen para esterilizar
los instrumentos a utilizar en el momento y
proporcionar un radio aséptico.
3. Mezclar los matraces que integran el medio de
fermentación (matraz) en condiciones de
asepsia.
4. Retirar del Shaker el medio de activación
5. Inocular al medio de fermentación con el
medio de activación
6. Homogenizar e incubar en condiciones de 30°C
con 150 rpm durante 10 horas
 DIAGRAMA DE BLOQUES
03 matraces con
nutrientes para el
Mezclar medio de
fermentación (100 mL)

Retirar Medio de activación

del Shaker

Todo el contenido del

Agregar medio de activación
(inoculo)

Medio de activación
en medio de
Inocular fermentación
(matraz)

Incubar T= 30°C N= 150 rpm

Por 10 horas

4.9. Preparación de reactivos del medio optimizado de

fermentación para biorreactor

Equipos:

 Balanza analítica
Reactivos:
 Agua destilada
  26.2 g/L de extracto de yacón
 10 g/L de extracto de levadura
 10 g/L de (NH4)2SO4
 1 g/L de KH2PO4
 0.386 g/L de MgSO4.7H2O
 100 mL/L Solución tampón pH 4

La preparación del medio líquido de fermentación

requiere de lo siguiente.
1. Pesas las cantidades requeridas de cada
compuesto, con mucho cuidado, en base a
100 mL:

Tabla C-2

Nutriente Cantidad Cantidad

(g/l) (g/100ml)
4.10. Extracto de yacón 26.2 524 mL
Extracto de levadura 10 20
(NH4)2SO4 10 20
KH2PO4 1 2
MgSO4.7H2O 0.386 0.772
Preparación y esterilización del medio optimizado de fermentación
para biorreactor

Materiales:

 Vaso del Biostat-Aplus

 02 Matraz Erlenmeyer 500 mL
 Pipetas
 Papel aluminio
 Gaza (tampones)
Equipos:
 Autoclave
 1. En el vaso del Biostat-Aplus mezclar los 524 ml de
extracto de yacón y adicionar 790 mL de agua
destilada. (agregar 0.1 g de antiespumante)
2. En un matraz de 0.5 L mezclar el extracto de
levadura, adicionar 300 ml de solución tampón.
3. En un matraz de 0.5 L mezclar los demás nutrientes,
adicionar 300 mL de agua destilada.
4. Tapar los matraces con tapones de gasa y recubrir
los picos con papel aluminio, llevar a esterilizar por
15 minutos en el autoclave.
5. Dejar enfriar a temperatura ambiente.

DIAGRAMA DE BLOQUES DEL PROCESO

C/u de los nutrientes

Pesar y medir como indica la Tabla
C-1

Vaso de Biostat-Aplus En matraz de 0.5 L En matraz de 0.5 L

Agregar Agregar Agregar

Extracto de Extracto de (NH4)2SO4 + KH2PO4 +

Yacón levadura MgSO4.7H2O

Adicionar Adicionar Adicionar

790 ml 300 ml 300 ml

Agua destilada Agua destilada Agua destilada

Todo lo anterior
Esterilizar en autoclave
120°C x 15 min
 4.11. Montaje y esterilización del Biostat-Aplus

ROTOR

CONDENSADOR FLUJO AIRE

(REGULADOR)

CONTROL DE ACIDEZ
INTERCAMBIADOR
DE CALOR
CONTROL DE ALCALINIDAD

SOLUCIONES CONTROL DE ANTI

ACIDAS Y BASICAS ESPUMANTE

CHAQUETA

INTERCAMBIADOR
DE CALOR
ACCESORIOS

Mangueras
Válvulas
Filtros
4.12. Inoculación del medio de fermentación (matraz) al biorreactor

Materiales
 03 Matraces con nutrientes que forman parte del
medio de fermentación (biorreactor)
 Medio de fermentación (100 mL)
 Mechero bunsen
Reactivos
 Alcohol etílico 96°
Equipos
 Shaker (Incubadora)

Para inocular el medio de fermentación

1. Desinfectar el ambiente con alcohol de 96° a un
radio de 30 a 40 cm.
2. Encender el mechero bunsen para esterilizar los
instrumentos a utilizar en el momento y
proporcionar un radio aséptico.
3. Mezclar los matraces que integran el medio de
fermentación (biorreactor) en el Biostat-Aplus en
condiciones de asepsia.
4. Retirar del Shaker el medio de fermentación.
 5. Inocular el medio de fermentación (matraz) con
el medio de medio de fermentación (biorreactor)

DIAGRAMA DE BLOQUES

Matraces con nutrientes para

Mezclar el biorreactor en condiciones
de asepsia

Todo el contenido del

medio de fermentación
Agregar (100 m) en condiciones de
asepsia directamente al
biorreactor

4 ml con jeringa y
Coger
descartarlo para evitar
que coja aire

Coger
4 ml con jeringa otra vez

Agregar El contenido de la celda en

un tubo

Absorbancia
(espectrofotómetro a 540
Medir
nm), pH y % oxígeno
disuelto

Agregar El contenido de la celda en

un tubo para centrifuga

Centrifugar
Por 15 min
 Agregar Sobrenadante en viales

4.13. Medición del KLa por el método dinámico de Humphry

Congelar
Materiales
 Papel
 Lápiz, lapicero
 Cronometro
Instrumentos e Equipos
 Biorreactor

Cortar Hasta el 50% de aire

Que la concentración
Esperar
caiga

Anotar El valor cada 15 segundos

hasta que llegue a 78%

Nuevamente el flujo de
Conectar aire hasta el 100%

Graficar Comportamiento del % de

oxígeno disuelto
4.14. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR
POR D.O

El método se basa en el aumento de la turbidez del medio al

incrementar la concentración de microorganismos, lo que puede ser
detectado fácilmente por un espectrofotómetro a una densidad óptica
de 640 nm. Para esta determinación fue necesario que previamente
se elabore una curva de calibrado, lo cual, la concentración celular
en el medio fue determinado por peso seco.
4.14.1. DILUCIONES PARA LA CURVA DE CALIBRADO
Materiales:
 Matraz conteniendo el medio de fermentación.
 Gasa y algodón
 Tubos de celda
 Tubos de ensayo
 Pipetas estériles
 Gradilla
Equipos:
 Espectrofotómetro
Reactivos:
 Agua destilada
Para realizar las diluciones se precisa a ejecutar lo siguientes pasos:
Dilución 1:2
 Se coloca 2 ml de caldo del matraz con una pipeta
previamente esterilizada.
 Añadir también 2 ml de agua destilada y homogenizar
 Luego pasar a medir la absorbancia en un espectrofotómetro
a una longitud de onda de 640 nm.
Dilución 1:2 de la muestra anterior
 Se coloca 4 ml de agua destilada a la dilución anterior y
homogenizar.
 Luego pasar a medir la absorbancia en un espectrofotómetro
a una longitud de onda de 640 nm.

Dilución 1:10
 Se coloca 0.5 ml de caldo y 4.5 de agua destilada y se
homogeniza.
 Luego pasar a medir la absorbancia en un espectrofotómetro
a una longitud de onda de 640 nm.
 4.14.2. PESO SECO

Materiales:
 Matraz conteniendo el medio de fermentación.
 Gasa y algodón
 Tubos de celda
 Tubos de ensayo
 Pipetas estériles
 Capachos de aluminio
Equipos:
 Espectrofotómetro
 Centrifuga
 Estufa
 Balanza analítica
Reactivos:
 Agua destilada
Para realizar el la determinación de la concentración celular por
seco se pasa a ejecutar lo siguientes pasos
1. Se toma una muestra de 5ml de caldo y se
lleva al espectrofotómetro para dar lectura de la
absorbancia a 640 nm.
2. Luego se procede a centrifugar a 5000 rpm
durante 20 min.
3. Se elimina el sobrenadante, se lava las células
restantes con 5 ml de agua destilada y se
homogeniza.
4. Se vuelve a centrifugar en las mismas
condiciones a fin de eliminar restos de sustrato
que pudieran alternar la determinación.
5. Se elimina el sobrenadante, se re disuelve el
precipitado agregándole al capacho
previamente, se seca en la estufa a 80°C y se
pesa.
6. Se repite el procedimiento para 3 capachos,
anotar pesos y absorbancia en tabla para luego
determinar crecimiento de biomasa.

DIAGRAMA DE BLOQUES

Coger 5 ml de caldo

Medir Absorbancia en
espectrofotómetro 640nm

Centrifugar 10 min

Descartar Sobrenadante
 Células restantes con 5 ml
Lavar
de agua

Agitar

Centrifugar 10 min

Descartar Sobrenadante

Las células con agua

Re suspender destilada agregándolo al
capacho previamente
pesado y secado

En estufa hasta el día

Secar
siguiente

Pesar

4.15. DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CONSUMO DE LA

FUENTE DE CARBONO:
4.15.1. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES:
MÉTODO DEL DNS (ÁCIDO DINITROSALICÍLICO).
Materiales:
 8 tubos de ensayo sin tapa
 Gradilla
 Micro pipeta con puntas
  Vasos precipitado
 Olla con trípode
 Hielo
 Celdas
 Papel toalla

Equipos:

 Mechero Bunsen
 Agitador Maxi Mix
 Espectrofotómetro

Reactivos:

 DNS
 Agua destilada

Para la determinación de azúcares reductores, en

este caso por el método del DNS (ácido
dinitrosalicílico) prepararemos primero el reactivo
DNS que se requiere lo siguiente:

Materiales:

 Matraz

Equipos:

 Balanza analítica

Reactivos:

 10 g/l de ácido 3.5 dinitrosalicílico

(DNS).
 200 ml/l de NaOH 2N
 300 g/l de tartrato de sodio y potasio
tetrahidratado.
 Para la preparación de este reactivo, se disuelve el
tartrato en aproximadamente 500 ó 600 ml de agua,
paralelamente se disuelve el ácido DNS. Ambas
soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1
litro y se agita hasta la completa disolución de todos
los componentes, para posteriormente aforar hasta
un litro.

DIAGRAMA DE BLOQUE
Tartrato

Agua destilada En un vaso de

500ml ó 600 ml Disolver
precipitado

Ácido DNS
En un vaso de
Disolver
precipitado

Las dos soluciones

anteriores
Mezclar En un matraz de 1 litro

Agitar Hasta la completa

disolución de todos los
componentes

Agua destilada
Aforar
 Una vez preparado el reactivo DNS realizaremos
estos pasos para poder hacer el análisis de la
muestra:
1. Se añade un volumen del reactivo DNS a un
volumen de muestra a analizar.
2. Poner a hervir agua en una olla y colocar los
tubos juntos, y dejarlos en la olla por 5
minutos cuando el agua se encuentre en
estado de ebullición.
3. Retirar todos los tubos pasado los 5 minutos
y colocar igualmente todos los tubos y
colocarlos en agua con hielo y dejarlos enfriar
por 3 minutos.
4. Retirar los tubos y después agregarle a cada
tubo 5 mL de agua destilada.
5. Al minuto 15, leer los datos en el
espectrofotómetro con una longitud de onda
de 540 nm
6. La concentración se obtiene interceptando la
medida de absorbancia en la curva de
calibrado.
DIAGRAMA DE BLOQUE

Reactivo DNS A un volumen dado de

Un volumen dado AÑADIR
deter muestra a analizar

  Mezcla en baño de
MANTENER agua a ebullición por 5
  minutos

 
ENFRIAR  
 

Agua Destilada
AÑADIR
10 volúmenes dados
 AÑADIR

LEER
  Absorbancia a 540 nm.

 
Agua Destilada
Utilizar Como blanco
 

La curva de calibración se
hace a partir de muestra de
concentración conocida y
analizada según este
procedimiento

4.16. DETERMINAR PROTEÍNAS POR EL METODO DE

BRADFORD
Preparación de reactivo de Bradford:

Materiales:

 Fiola de 1L

Reactivos:

 Azul de coomassie G
  Etanol al 98 %,
 Ácido fosfórico al 85 %
 Agua destilada

1. Disolver 0.1 g de azul de coomassie G, 250 ml de

etanol al 98 %, más 100ml de ácido fosfórico al 85 %.
2. Aforar con agua destilada a un litro.
Método de Bradford

Materiales:

 Tubo de ensayo
 Pipetas

Equipos:

 Espectrofotómetro

Procedimiento:

1. Agregar a un tubo de ensayo 100 ul de muestra

convenientemente diluida.
2. Añadir 5 ml de reactivo de Bradford (cada
muestra) y dejar reaccionar durante 5 minutos.
3. Leer la absorbancia a una longitud de onda de
595 nm, contrastándolo con un blanco de agua
destilada de 50 ul.
4. La concentración se obtiene interceptando la
medida de absorbancia en la curva de calibrado.

Curva de calibrado

La curva de calibrado se obtiene a partir de

muestras de concentración conocida de una
solución estándar de albúmina suero bovino y
analizado según este procedimiento anterior.

DIAGRAMA DE BLOQUE
PREPARACIÓN DEL REACTIVO

Azul brillante de
coomassieg G-250
En 50 ml de etanol al
0.1 g
DISOLVER
95%

Ácido fosfórico
AÑADIR Al 85 % (w/v)
100 ml

Con agua destilada en

AFORAR una fiola de 1 litro.

PROCEDIMIENTO DE LA DETERMINACIÓN

Muestra AGREGAR En un tubo de ensayo

100 uL convenientemente diluida.

Reactivo Bradford A cada

AGREGAR muestra
5 ml

MEZCLAR

REACCIONAR Por cinco minutos

V. RESULTADOS
5.1. IDENTIFICACIÓN Y DESCRIPCIÓN DE LAS PARTES, ACCESORIOS Y
GEOMETRÍA DE UN FERMENTADOR DE LABORATORIO,
CONOCIMIENTO DE SU OPERACIÓN, ESTERELIZACIÓN, CARGA Y
DESCARGA Y TOMA DE MUESTRAS.

Controlador

Biorreactor

Laptop con
Software
incluido
Vaso de 4L

Material: Bufles
Vidrio de
boro
silicato

Difusor de
Rotor con 6
aire
alabes

Motor de
agitación
Sensor de
espuma

Electrodo de pH y Oxigeno Condensador

Área para agregar

inóculo

Entrada de gas
Ingreso de la
Alimentación
Tubo para tomar muestra
 Bomba de alimentación

Regulador de aire

Acido

Cabezales de bomba
Base peristáltica

Antiespumante

Tubos de salida

Reguladores de pH
 Acido Base

A. Sistema de Medida y Control de la temperatura:

La unidad cuenta con un control digital PID. La medida se realiza
con un sensor de Pt-100 y el control se lleva a cabo mediante una
válvula de refrigeración y una resistencia de 600 W. La temperatura
de operación se selecciona y ajusta mediante un indicador digital,
con una sensibilidad de 0.1ºC. El intervalo de medida es de 0 a
100ºC.

B. Sistema de Medida y Control de la Agitación:

La unidad cuenta con un controlador digital PID, ajustando la
velocidad travésdeunmotorde180Wde potencia máxima, que ejerce
su acción sobre una varilla de acero inoxidable, sobre la que se
encuentran dos agitadores de turbina de seis palas planas. La
velocidad de agitación se mide con un tacómetro ajustable entre 0 y
1200rpm, con una resoluciónde10rpm.

La aireación del caldo se consigue suministrando aire por burbujeo,

mediante un compresor, filtrándose a través de un filtro que posee
una membrana de 0.2µm, para que el aire se introduzca en el
reactor estéril. El aire se distribuye en el interior mediante un difusor.
El caudal de aire se ajusta con una válvula y un rotámetro, y se
puede regular automáticamente.

C. Sistema de Medida y Control de pH:

En este caso también cuenta la unidad con un controlador digital PID
que actúa sobre las bombas de alimentación de ácido y de base en
función de la señal de medida, previamente amplificada. Se utiliza un
electrodo INGOLD, cuyo rango de medida varía entre 2 a 12
unidades de pH. Las calibraciones realizadas mediante un sensor
digital.
D. Sistema de Medida y Control de Oxígeno Disuelto:
La unidad cuenta con un controlador digital PID del oxígeno disuelto
en cascada, actuando directamente sobre la velocidad de agitación,
es decir, sobre la velocidad de giro del agitador. La medida de la
concentración de oxígeno disuelto se realiza con un electrodo
esterilizable INGOLD, cuyo rango de medida varía entre 0 y 100%.
La calibración se realiza con un sensor digital.

E. Electrodo de O2 disuelto
Para la medida del oxígeno disuelto se utiliza un electrodo de O 2
disuelto polarográfico esterilizable (HAMILTON
OXYFERMFDA).Consiste en un cátodo de platino y un ánodo de
Ag/AgCl conectados conductimétricamente por un electrolito,
separados de la solución mediante una membrana permeable al gas.

F. Compresor de aire
El aire comprimido se consigue mediante un compresor Atlas Copco
GA5, con una presión máxima de descarga de 10 bar y es
almacenado en un pulmón pasando por una serie de accesorios cuya
función es la desecar y eliminar tanto el aceite como el polvo de la
corriente gaseosa que llega al fermentador.

G. Medidor de flujo másico

El caudal de aire introducido en el reactor a través del difusor de gas
se ha determinado utilizando para ello un medidor de flujo
másico, GFM37 AALBORG, con un intervalo de operación de 0 a 20
L/min en condiciones estándar, y un tiempo de respuesta de 2 s, con
una variación del ±2%.

H. Electrodo de pH
Se utiliza un electrodo combinado de pH METTLER TOLEDO de
Ag/AgCl, cuyo rango de medida varía entre 0 y 12 unidades de pH y
permite una temperatura máxima de 130ºC. El calibrado del electrodo
se realiza con un sensor digital. El control de pH en el interior del
fermentador se consigue mediante un controlador digital PID que
actúa sobre las bombas de alimentación de ácido y de base.
BIORREACTOR BIOSTAT –A:
Suministro de control de aire: Cuenta con un ingreso
de aire el cual es necesario para que nuestras células
se desarrollen en un cultivo aerobio.

Sistema de muestreo: Tiene una salida de muestreo,

el cual es necesario para tomar nuestros datos correspondientes durante
la fermentación.

Sistema de alimentación: El biorreactor cuanta

con un sistema de alimentación el cual fue
necesario en el CLA para proporcionarle la fuente
de carbono para que las células se sigan
desarrollando y sigan produciendo etanol.

Sistema de Agitación: El motor

dará velocidad de agitación de 50
a 1200 rpm. En el caso del
régimen de motor, que es
controlada por la velocidad que los
usuarios configuran.
Control de la Temperatura: El biorreactor es capaz de controlar la
temperatura.
-El biorreactor antes de ser puesto en marcha se llenara con agua
destilada para ser lavado.
El biorreactor del laboratorio de la universidad nacional del
santa posee las siguientes partes:
 Determinación de PH (4.2)
 Sensor de PH
 Sensor de Tº
 Sensor Oxígeno Disuelto.
 Antiespumante
 Condensador
 Motor de rotor
 Posee cuatro bombas peristaticos: acido- base-
alimentación- espumante
 2 Sensores de aire (1%)

1. Sensor de espuma
2. Condensador
3. Motor
4. Sensor de O.D
5. Sensor de PH
6. Sensor de Tº

SENSOR DE TEMPERATURA
GEOMETRÍA DEL FERMENTADOR

PARTES DEL MEDIDAS

FERMENTADOR Cm
Altura del 55
fermentador
Diámetro externo 16

Perímetro 53.5

CONOCIMIENTO DE SU
OPERACIÓN
1. Aireación

Algunas consideraciones que se debe tomar son:

 Proporcionar a los microorganismos el oxígeno necesario para

llevar a cabo su proceso respiratorio.

 La solubilidad del O2 es baja < 10mg/l Þ se necesita alimentar en

forma continua este “nutriente”, dado que su demanda es
aproximadamente de 1g/l.

Se pueden tener sistemas donde los microorganismos crecen con

múltiples sustratos, pero en el caso que todos son limitantes. Ejemplo: C,
N, O2, luego la cantidad de cada uno de ellos afecta la cinética de
crecimiento.

G N O
μ=μ max
( )(
⋅ ⋅
)(
K G +G K N + N K o +O )
Entrada del
Flujo de aire Regulador del Fujo de Caudal de Aire ( Qa=0.4L/h)

2. Transferencia de Oxígeno
El comportamiento de las fermentaciones está fuertemente influenciado
por una serie de operaciones de transferencia.

Es posible que una determinada fermentación, en especial las aeróbicas,

esté limitada en sus posibilidades de mejorar su rendimiento y
productividad, no por razones propias de las características de las
células sino que por problemas en el diseño que permita satisfacer la
alta demanda de transferencia de masa, y en especial de oxígeno.

Proceso de transferencia de oxígeno (OFERTA)

Etapas
 A. Del seno de la burbuja a una capa interna de gas
B. Difusión en la capa interna de gas.
C. Difusión a través de una capa externa de líquido que rodea a
la burbuja ¡Etapa limitante!
D. Transferencia al seno del líquido
E. Difusión a través de la capa de líquido que rodea a los
microorganismos ¡Etapa limitante!
F. Difusión en el interior de los microorganismos

 Velocidad de Transferencia de Oxígeno por área interfacial

La velocidad de transferencia por unidad de área interfacial, W, está dada

por:

W = kl (Ci – C)

Como en la interfase se supone que hay equilibrio entre el oxígeno en el

gas y el disuelto.

W = kl (Ci – C)=kG (P – Pi)

Las cantidades Pi y Ci resultan difíciles de determinar en la práctica, se

prefiere hacer uso de las relaciones de equilibrio, trabajando con las
concentraciones y presiones de equilibrio C* y P*. Con ello se trabaja con la
“Velocidad de transferencia de oxígeno volumétrica”, NA

 Velocidad de Transferencia de
oxígeno volumétrica

Cuando el control de la transferencia de O 2 se encuentra en el film líquido

que rodea a la burbuja o a los microorganismos, la velocidad de
transferencia de oxígeno, NA se puede expresar como:

NA = kLa (C* - C) = H kLa (P – P*)

Se supone que hay equilibrio entre el oxígeno del gas y el disuelto en el

líquido.

kL: Coef volumétrico de transferencia de O2 a la fase líquida (cm/hr)

a: Área interfacial específica (cm2/m3) Resulta difícil de medir è (kLa)

C*: Conc. de O2 en el equilibrio (mM/L) (Hipotético)

C: Conc. de O2 disuelto en el seno de la fase líquida (Este valor no puede

ser inferior Ccrítico» 1mg/l)

P* : Presión de O2 en el equilibrio

P : Presión de O2 en el seno de la fase gas.

H : cte. de Henry.

¿
k L a⋅(C −C )=0

La pendiente de la curva es la demanda de O2:

μ⋅x dC
=
Y o2 dt
x
 3. Agitación

La agitación es la operación que crea o que acelera el contacto entre dos

o varias fases. Una adecuada agitación de un cultivo microbiano es
esencial para la fermentación ya que produce los siguientes efectos en
las tres fases:

 Dispersión del aire en la solución de nutrientes.

 Homogeneización, para igualar la temperatura, pH y concentración

de nutrientes, en el fermentador.

 Suspensión de los microorganismos y de los nutrientes sólidos.

 Dispersión de los líquidos inmiscibles.

Bajo estas premisas se podría concluir que cuanto mayor sea la

agitación, mejor será el crecimiento. Sin embargo, la agitación excesiva
puede romper las células grandes e incrementar la temperatura lo que
ocasiona un descenso en la viabilidad celular. Por lo tanto, se debe
conseguir un balance entre la necesidad del mezclado y la necesidad de
evitar el daño celular.

La agitación es una operación muy importante tanto del punto de vista

técnico como económica.

La agitación es importante para:

• un mezclado homogéneo

• Una buena transferencia de masa y de calor, permite disminuir el

espesor de la película líquida estática.

 Diseño del sistema de agitación

 El sistema de agitación tiene la función de generar la potencia necesaria
para producir una mezcla perfecta para el sistema de cultivo y producir
un régimen de agitación adecuado que, maximice la difusión de gases
en el líquido y minimice la producción de esfuerzos cortantes y la presión
hidrodinámica local y global, para optimizar los fenómenos de
transferencia de momentum, calor y masa.

ESTERILIZACIÓN
Para poder llevar a cabo una fermentación con
éxito es imprescindible y obligatoria tener en
todas las etapas cultivos libres de
contaminantes, desde el cultivo preliminar hasta
el fermentador de producción. Por lo tanto, el
fermentador y su equipamiento, así como el
medio de cultivo deben estar estériles antes de
la inoculación. Además, el aire que se
suministra durante la fermentación debe ser
estéril y no deben existir roturas mecánicas en
el fermentador que podrían permitir la entrada
de microorganismos. También se deben esterilizar los aditivos
(antiespumantes), sin embargo los ácidos y bases concentrados no es
necesario esterilizarlos.

Un biorreactor puede ser esterilizado, destruyendo los microorganismos,

con algún agente letal como calor, radiación o un producto químico o
bien separando los organismos viables mediante un procedimiento físico
como la filtración.
Durante la fermentación se deben observar dos puntos para asegurar la
esterilidad:

- Esterilidad en el medio de cultivo

- Esterilidad del aire que entra y sale
 Para lo cual es necesario una construcción apropiada del biorreactor que
facilite la esterilización así como la prevención de la contaminación
durante la fermentación.

Esterilización significa la eliminación de toda forma de vida de un medio

o material, lo que se lleva a cabo generalmente por medios físicos, por
ejemplo, filtración, o por muerte de los organismos por calor, productos
químicos u otra vía.
La razón fundamental para efectuar la esterilización en Microbiología
Industriales para evitar la competición por los nutrientes en medios de
cultivo y permitir así que el cultivo de microorganismos específicos que
se utilizan en un proceso de fermentación de los rendimientos esperados
en biomasa y/o metabolitos específicos.

En la práctica de la esterilización es necesario tener presente que la

calidad nutriente del medio debe ser preservada todo lo posible, razón
por la cual, es imprescindible diseñar un ciclo de esterilización lo más
efectivo posible pero al mismo tiempo lo más corto posible. Podremos
definir un término nabla (V) que representa la magnitud de la
disminución del número de organismos viables de manera que:

CARGA, DESCARGA Y LIMPIEZA DEL BIOSTAT-APLUS

CARGA:

Le carga de la biomasa en EL reactor BIO STAT PLUS 5 litros, serán

cargados con la fuente de carbono, con la finalidad de obtener más
biomasa. Esto dura un día según el siguiente protocolo:

- Crear un inóculo a partir de las cepas disponibles.

- Preparar el montaje del equipo soporte
 - Poner en contacto en el biorreactor con el soporte, el inóculo y
medio fresco, oxigenando continuamente el sistema, para
fomentar el crecimiento de la biomasa que coloniza las partículas.
- Homogenizar el líquido para promocionar el crecimiento
homogéneo de la biomasa a todo el lecho. Concluida esta etapa
el reactor puede operar en lote.
DESCARGA:

Se hará llevando una adecuada esterilización.

TOMA DE MUESTRAS:

Tiene una salida de muestreo, el cual es necesario para tomar nuestros

datos correspondientes durante la fermentación.

5.2. DETERMINAR EL KLa POR EL MÉTODO DINÁMICO DE

HUMPHRY Y CORRELACIONAR LOS RESULTADOS.

Tabla 2.1: Datos del nivel de oxígeno disuelto en el tiempo - I, por aplicación
del método dinámico en el BIOSTAT-Aplus conteniendo 2000 mL de caldo de
K. Marxianus NRRL Y-7571 en su fase exponencial, operando a 400 rpm y
velocidad de aireación 7.89 cm/min, a 30°C

%
Tiempo
Oxígeno
(s)
  Disuelto
 0 81.3
6 76.6
12 71.5

Desgasificación
18 61.9
20 55.8
27 50
30 45.5
32 40
34 35
38 30.9
40 24.9
 
40 24.9
51 29.8
Gasificación

54 34.8
58 40.5
61 45.6
64 50.9
69 54.3
74 59.2
79 64.7
93 68.2

Figura 2.1: Perfil del nivel de oxígeno disuelto en el tiempo - I, por aplicación
del método dinámico en el BIOSTAT-Aplus conteniendo 2000 mL de caldo de
K. Marxianus NRRL Y-7571 en su fase exponencial, operando a 400 rpm y
velocidad de aireación 7.89 cm/min, a 30°C

90

80

70
Oxigeno Disuelto (%)

60

50

40

30

20

10

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Tiempo (segundos)

Cálculo del KLa:

 Tiempo
Cl (%)
  (h)
0.0000 81.3
0.0017 76.6
0.0033 71.5

Desgasificación
0.0050 61.9
0.0056 55.8
0.0075 50
0.0083 45.5
0.0089 40
0.0094 35
0.0106 30.9
0.0111 24.9

90

80 f(x) = − 5122.46 x + 85.37

R² = 0.98
70

60

50
CL(mg/L)

40

30

20

10

0
0.0000 0.0020 0.0040 0.0060 0.0080 0.0100 0.0120

Tiempo (horas)

μX %  O2
=N A =pendiente → N A =5122.5
YO 2
h

Tiempo
Cl (%)
  (h)
0.0111 24.9
0.0142 29.8
Gasificación

0.0150 34.8
0.0161 40.5
0.0169 45.6
0.0178 50.9
0.0192 54.3
 0.0206 59.2
0.0219 64.7
0.0258 68.2

80

70
f(x) = − 96702.25 x² + 6967.54 x − 44.76
R² = 0.96
60

50
CL (%)

40

30

20

10

0
0.0100 0.0120 0.0140 0.0160 0.0180 0.0200 0.0220 0.0240 0.0260 0.0280

Tiempo (horas)

Teniendo laecuación :

y=−96702 x 2 +6967.5 x−44.746

Derivando :
dy
=−193404 x +6967.5
dx

dCL
=−193404 t+6967.5
dt

Tiempo
CL (%) dCL/dt Na Na + dCL/dt
(h)
0.01111 24.9 4818.5667 5122.5 9941.1
0.01417 29.8 4227.6100 5122.5 9350.1
0.01500 34.8 4066.4400 5122.5 9188.9
0.01611 40.5 3851.5467 5122.5 8974.0
0.01694 45.6 3690.3767 5122.5 8812.9
0.01778 50.9 3529.2067 5122.5 8651.7
0.01917 54.3 3260.5900 5122.5 8383.1
0.02056 59.2 2991.9733 5122.5 8114.5
0.02194 64.7 2723.3567 5122.5 7845.9
0.02583 68.2 1971.2300 5122.5 7093.7
 Figura 2.2: Perfil para determinar el valor inverso de K La, por aplicación del
método dinámico en el BIOSTAT-Aplus conteniendo 2000 mL de caldo de K.
marxianus NRRL-7571 en su fase exponencial, operando a 400 rpm y
velocidad de aireación 7.89 cm/min

80

70 f(x) = − 0.02 x + 198.53

R² = 0.94
60

50
C L (% )

40

30

20

10

0
6500.0 7000.0 7500.0 8000.0 8500.0 9000.0 9500.0 10000.0 10500.0

Na + dCL/dt

1
= pendiente=0.0175 → KLa=57.10 h
KLa

Tabla 2.2: Datos del nivel de oxígeno disuelto en el tiempo - II, por aplicación
del método dinámico en el BIOSTAT-Aplus conteniendo 2000 mL de caldo de
K. Marxianus NRRL Y-7571 en su fase exponencial, operando a 400 rpm y
velocidad de aireación 7.89 cm/min, a 30°C

  Tiempo %
(s) Oxígeno
Disuelto
0 79.5
11.2 76.6
18.04 65.5
Desgasificación

22.27 57.3
26.91 50.8
29.88 46.2
32.88 41.1
35.86 36.4
38.4 30.8
40.2 21.9
 
 39.2 27
43.55 33.3
52.55 39.5
65.24 43.5

Gasificación
81.35 48.6
101.73 52
129.18 56.4
162.38 62.2
198.74 67.7
237.66 71
281.04 71.5
333.96 72.9

Figura 2.3: Perfil del nivel de oxígeno disuelto en el tiempo - II, por aplicación
del método dinámico en el BIOSTAT-Aplus conteniendo 2000 mL de caldo de
K. Marxianus NRRL Y-7571 en su fase exponencial, operando a 400 rpm y
velocidad de aireación 7.89 cm/min, a 30°C

80
70
Oxigeno Disuelto (%)

60
50
40
30
20
10
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400

Tiempo (segundos)

Calculo del KLa:

Tiempo
Cl (%)
  (h)
0.0000 79.5
Desgasificación

0.0031 76.6
0.0050 65.5
0.0062 57.3
0.0075 50.8
0.0083 46.2
0.0091 41.1
 0.0100 36.4
0.0107 30.8
0.0112 21.9

90
80
70 f(x) = − 5940.94 x + 95.03
60 R² = 1
CL (mg/L)

50
40
30
20
10
0
0.0020 0.0040 0.0060 0.0080 0.0100 0.0120

Tiempo (horas)

μX %  O2
=N A =pendiente → N A =5940.9
YO2
h

Tiempo
Cl (%)
  (h)
0.0109 27
0.0121 33.3
0.0146 39.5
0.0181 43.5
Gasificación

0.0226 48.6
0.0283 52
0.0359 56.4
0.0451 62.2
0.0552 67.7
0.0660 71
0.0781 71.5
0.0928 72.9
80

70 f(x) = − 8798.68 x² + 1382.9 x + 18.73

R² = 0.98
60

50
CL (mg/L)

40

30

20

10

0
0.0000 0.0200 0.0400 0.0600 0.0800 0.1000

Tiempo (horas)
 Teniendo laecuación :

y=−8798.7 x2 +1382.9 x−18.725

Derivando :

dy
=−17597.4 x +1382.9
dx

dCL
=−17597.4 t+1382.9
dt

Tiempo
CL (%) dCL/dt Na Na + dCL/dt
(h)
0.01089 27 1191.2839 5904.9 7096.2
0.01210 33.3 1170.0203 5904.9 7074.9
0.01460 39.5 1126.0268 5904.9 7030.9
0.01812 43.5 1063.9960 5904.9 6968.9
0.02260 48.6 985.2476 5904.9 6890.1
0.02826 52 885.6268 5904.9 6790.5
0.03588 56.4 751.4466 5904.9 6656.3
0.04511 62.2 589.1595 5904.9 6494.1
0.05521 67.7 411.4258 5904.9 6316.3
0.06602 71 221.1783 5904.9 6126.1
0.07807 71.5 9.1296 5904.9 5914.0
0.09277 72.9 -249.5521 5904.9 5655.3

Figura 2.4: Perfil para determinar el valor inverso de K La, por aplicación del
método dinámico en el BIOSTAT-Aplus conteniendo 2000 mL de caldo de K.
marxianus NRRL-7571 en su fase exponencial, operando a 400 rpm y
velocidad de aireación 7.89 cm/min
 80
70
f(x) = − 0.03 x + 251.5
R² = 0.86
60
50
CL (%) 40
30
20
10
0
5400.0 5600.0 5800.0 6000.0 6200.0 6400.0 6600.0 6800.0 7000.0 7200.0

Na + dCL/dt

1
= pendiente=0.03 → KLa=33.31 h
KLa

Tabla 2.3: Datos del nivel de oxígeno disuelto en el tiempo - III, por aplicación
del método dinámico en el BIOSTAT-Aplus conteniendo 2000 mL de caldo de
K. Marxianus NRRL Y-7571 en su fase exponencial, operando a 400 rpm y
velocidad de aireación 7.89 cm/min, a 30°C

%
Tiempo
Oxígeno
(s)
  Disuelto
0 83.9
6 79.6
14 76.8
20 69.4
Desgasificación

26 55.5
30 50.8
33 46.6
36 40.5
39 36.6
42 31.3
44 26
47 20.9
 
44.4 25.4
Gasificación

47.4 41.3
52.4 50.5
58.4 60.4
66.4 64.6
75.4 69.6
 87.4 75
101.4 80.4
119.4 83.5

Figura 2.5: Perfil del nivel de oxígeno disuelto en el tiempo - III, por aplicación
del método dinámico en el BIOSTAT-Aplus conteniendo 2000 mL de caldo de
K. Marxianus NRRL Y-7571 en su fase exponencial, operando a 400 rpm y
velocidad de aireación 7.89 cm/min, a 30°C

90
80
70
Oxigeno Disuelto (%)

60
50
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80 100 120 140

Tiempo (segundos)

Cálculo del KLa:

  Tiempo Cl (%)
(h)
0.0000 83.9
0.0017 79.6
0.0039 76.8
0.0056 69.4
Desgasificación

0.0072 55.5
0.0083 50.8
0.0092 46.6
0.0100 40.5
0.0108 36.6
90
80 f(x) = − 5037.62 x + 90.79 0.0117 31.3
70 R² = 0.97 0.0122 26
60 0.0131 20.9
50
CL (%)

40
30
20
10
0
0.0000 0.0020 0.0040 0.0060 0.0080 0.0100 0.0120 0.0140

Tiempo (horas)
 μX %  O2
=N A =pendiente → N A =5037.6
YO 2
h

  Tiempo Cl (%)
(h)
0.0123 25.4
0.0132 41.3
0.0146 50.5
Gasificación

0.0162 60.4
0.0184 64.6
0.0209 69.6
0.0243 75
0.0282 80.4
0.0332 83.5
90
80
f(x) = − 166601.84 x² + 9812.49 x − 61.26
70 R² = 0.94
60
50
CL (%)

40
30
20
10
0
0.0100 0.0150 0.0200 0.0250 0.0300 0.0350

Tiempo (horas)

Teniendo laecuación :

y=−166602 x 2+ 9812.55 x −61.258

Derivando :
dy
=−333204 x +9812.55
dx
 Tiempo
CL (%) dCL/dt Na Na + dCL/dt
(h)
0.01233 25.4 5703.0340 5037.6 10740.6
0.01317 41.3 5425.3640 5037.6 10463.0
0.01456 50.5 4962.5807 5037.6 10000.2
0.01622 60.4 4407.2407 5037.6 9444.8
0.01844 64.6 3666.7873 5037.6 8704.4
0.02094 69.6 2833.7773 5037.6 7871.4
0.02428 75 1723.0973 5037.6 6760.7
0.02817 80.4 427.3040 5037.6 5464.9
0.03317 83.5 -1238.7160 5037.6 3798.9

Figura 2.6: Perfil para determinar el valor inverso de K La, por aplicación del
método dinámico en el BIOSTAT-Aplus conteniendo 2000 mL de caldo de K.
marxianus NRRL-7571 en su fase exponencial, operando a 400 rpm y
velocidad de aireación 7.89 cm/min

90
80 f(x) = − 0.01 x + 119.68
70 R² = 0.8
60
CL (%)

50
40
30
20
10
0
3000.0 4000.0 5000.0 6000.0 7000.0 8000.0 9000.0 10000.0 11000.0 12000.0

Na + dCL/dt

1
= pendiente=0.0072→ KLa=139.15 h
KLa
 5.3. PERFIL DE MASA CELULAR A TRAVÉS DEL TIEMPO TOTAL DE
FERMENTACIÓN EN EL BIORREACTOR

5.4. PERFIL DE FUENTE DE CARBONO A TRAVÉS DEL TIEMPO

TOTAL DE FERMENTACIÓN EN EL BIORREACTOR

5.5. PERFIL DEL OXÍGENO DISUELTO A TRAVÉS DEL TIEMPO

TOTAL DE FERMENTACIÓN EN EL BIORREACTOR

5.6. PERFIL DEL pH A TRAVÉS DEL TIEMPO TOTAL DE

FERMENTACIÓN EN EL BIORREACTOR

VI. DISCUSIONES
6.1. DETERMINAR EL KLa POR EL MÉTODO DINÁMICO DE
HUMPHRY Y CORRELACIONAR LOS RESULTADOS.

La medición de la capacidad de transferencia de masa, oxigeno, en un

biorreactor aerobia es de suma importancia, por cuanto dicho valor determinará
la productividad del sistema.

La característica general de los problemas de transferencia de masa en un

sistema fermentativo es que el oxígeno pasa desde una fase a otra en la cual
se encuentra el microorganismo. Las distintas etapas presentes en este
fenómeno son:

- Transporte de oxigeno desde la fase gaseosa hacia la interfase gas-

líquido.
- Difusión del oxígeno a través de la interfase gas-líquido
- Transporte del oxígeno a través de la fase líquida hasta las vecindades
del microorganismo.
- Difusión del oxígeno en la interfase líquido-sólido (célula).
- Difusión intrapartícula (intracelular).
- Reacción bioquímica intracelular.

Una de las particularidades de la ocurrencia de este fenómeno es que todas

estas etapas se dan en serie. Se ha determinado, por ejemplo, que en
microorganismos unicelulares la etapa limitante la constituye la difusión del
oxígeno en la interfase gas-líquido, de modo que la velocidad neta de
transferencia de masa se expresa en términos de un coeficiente de
transferencia referido a la fase líquida, el área de la interfase y un gradiente de
concentraciones de oxígeno entra la interfase y la fase líquida. Sin embargo, en
fermentaciones donde se forman agregados celulares o “pellets”, la difusión del
oxígeno a través de los agregados se constituye como el paso limitante. Es
decir, el producto del coeficiente de transferencia de oxígeno y el área de la
interfase gas-líquido representan un índice de la capacidad de aireación de un
biorreactor. El valor de este parámetro depende del diseño del biorreactor, del
grado de agitación (o consumo de potencia por unidad de volumen de
biorreactor), del flujo de aire (medidos como VVM), de la viscosidad del medio,
de la presencia de antiespumante, entre otros. En consecuencia el diseño y las
condiciones de operación del biorreactor deben ser tal que satisfacen los
requerimientos de oxígeno por el microorganismo.

En este sentido determinamos experimentalmente el coeficiente volumétrico de

oxígeno KLa, en un biorreactor batch BIOSTAT-Aplus isotérmico y observar el
efecto del nivel de aeración y el grado de agitación.

Consideremos una burbuja de aire moviéndose en un líquido en fermentación.

El oxígeno debe pasar desde el interior de la burbuja hacia el líquido y
posteriormente ser consumido por los microorganismos. Hemos señalado una
serie de pasos o etapas en este fenómeno tan complejo; sin embargo vamos a
restringir nuestro estudio a sólo tres etapas como son:

- El transporte de oxígeno desde el seno de la burbuja de aire hacia la

interfase.
- La difusión del oxígeno a través de la interfase gas-líquido.
- El transporte a través del líquido.

Por lo tanto, evaluar la transferencia de oxígeno en un sistema de fermentación

implica el cálculo de las resistencias diversas al paso del oxígeno desde la
burbuja de aire hasta su difusión en la célula.

Para el estudio de un problema de transferencia de masa, son importantes las

condiciones de la interfase. Con excepción de los casos de transferencia
extremadamente intensos o de acumulación de partículas sólidas en la
interfase, la experiencia muestra que existe equilibrio entre las fases a través
de la interfase. Es decir, si una burbuja de aire se mueve en un líquido en una
fermentación, el oxígeno debe pasar desde el interior de la burbuja hacia el
líquido, para finalmente ser consumida por las células. En otras palabras, la
concentración de oxígeno en el gas, junto a la interfase, está en equilibrio con
la concentración de oxígeno en el líquido, también junto a la interfase.

Ya que existe equilibrio entre las fases en la interfase, se puede aplicar las
leyes que rigen en el equilibrio. La manera más simple es por la ley de Henry.

Si existe una diferencia de concentraciones de oxígeno disuelto en el líquido

(CL) y en la interfase (C*), ocurre una transferencia de masa.

La diferencia de concentración (CL-C*) debe mantenerse para la transferencia

de oxígeno a través de la interfase (difusión) y por analogía al caso de la fase
líquida, el flujo de oxígeno por difusión a través del gas.

En síntesis, los coeficientes de transferencia de masa dependen de:

- Las propiedades de las dos fases.

- La geometría del sistema (burbuja, gotas, lechos continuos).
- El tipo de régimen que existe entre las dos fases (laminar o turbulenta=

El número de variables que intervienen en los cálculos de estos coeficiente es,

pues, tan grande y su influencia tan compleja que, a no ser en algunos casos
triviales, no existen teorías que lleven a expresiones matemáticas de estos
coeficiente. Esto es tan evidente en el caso de régimen turbulento, que es lo
que ocurre en la mayoría de los casos de transferencia de masa industrial.

La determinación experimental del coeficiente de transferencia de oxígeno se

puede realizar siguiendo los métodos siguientes:

- Oxidación de sulfito.
- Técnica de eliminación de gas.
- Balance de oxígeno en el sistema.
- Técnica dinámica.
Para efecto de cumplir los objetivos, en esta experiencia prescindiremos de una
fermentación real, por lo que se aplicará la técnica dinámica.

Técnica Dinámica

6.2. PERFIL DE MASA CELULAR A TRAVÉS DEL TIEMPO TOTAL

DE FERMENTACIÓN EN EL BIORREACTOR

6.3. PERFIL DE FUENTE DE CARBONO A TRAVÉS DEL TIEMPO

TOTAL DE FERMENTACIÓN EN EL BIORREACTOR

6.4. PERFIL DEL OXÍGENO DISUELTO A TRAVÉS DEL TIEMPO

TOTAL DE FERMENTACIÓN EN EL BIORREACTOR

6.5. PERFIL DEL pH A TRAVÉS DEL TIEMPO TOTAL DE

FERMENTACIÓN EN EL BIORREACTOR

RESULTADOS:

Variacion del pH en el tiempo

4.5
4
3.5
3
2.5
pH

2
1.5
1
0.5
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo h

Fig. 6.1 Perfil para determinar la variación del pH en el tiempo, durante la

fermentación de la Kluyveromyces Marxianus NRRL- Y – 7571. Operado a 400
rpm a 7.98 cm/min, a 30°C.

Discusiones de la variación del pH

Variación del pH en la fermentación de la Kluyveromyces Marxianus.

El pH óptimo para el crecimiento de las levaduras varía de 4,5 a 6,5 aunque

muchas especies toleran grandes variaciones de pH 2,8 - 3 a 2 – 8,5. Entre
estos, los valores del pH intracelular varían entre 5,8 a 6,8 (Jagnow, 1991,
citado por Villamil 1999).

Los ácidos orgánicos tienen efecto inhibidor en su forma disociada, el Ion H no

penetra en la célula pero el ácido no disociado RCOOH puede hacerlo. La
sensibilidad de una levadura a un ácido orgánico depende así del pH y de la
capacidad de la levadura de metabolizar o eliminar el ácido si este penetra la
célula. Es por esto que los ácidos sorbico y propinoicos son más inhibidores
que los ácidos acéticos, cítricos y lácticos (Rose, 1987, citados por sarmiento
2003).

Durante las fermentaciones por lo general es necesario controlar el pH,

particularmente cuando se forman productos ácidos como el ácido láctico,
acético y cítrico o cuando los mismos substratos de crecimiento son ácidos o
bases, de modo que la consumirse el pH del medio cambiara de manera
importante. Un ejemplo es el uso de NH4OH como fuente de nitrógeno. El
crecimiento dará como resultado el consumo de NH3 (el nivel de reducción de
N en la célula) dejando un protón en el medio, el cual causa que el pH
disminuya. A menudo se usan soluciones amortiguadoras para evitar grandes
fluctuaciones de pH en el medio de cultivo, aunque estas son caras,
particularmente a escala industrial, y aumenta el contenido de sal en el medio,
lo cual es indeseable si el producto, por ejemplo, la proteína unicelular
(biomasa) será usada como materia prima para algún proceso.

Estos diferentes intervalos de pH pueden usarse ventajosamente para las

fermentaciones, para reducir la posibilidad de contaminación. Así las
fermentaciones de levaduras con frecuencia operan a un pH tan bajo como
económicamente sea posible para evitar la contaminación bacteriana, con una
consecuente reducción en los costos de esterilización.

La levadura Kluyveromyces Marxianus tiene un perfil de aminoácidos que la

caracteriza, este microorganismo desde tiempos muy antiguos es una fuente
de proteínas unicelular que en la actualidad la hace compararse con muchos
alimentos que son fuente de proteínas.

Durante la fermentación la levadura toma el nitrógeno de los aminoácidos

orgánicos, perdiendo su carácter anfótero y pasando a ácidos, lo cual origina
una disminución del pH del medio. Cuanto más bajo el pH del medio, tanto
menor el peligro de infección, pero si se trabaja con pH muy bajos la
fermentación es muy lenta, ya que la levadura no se desarrolla de la forma
conveniente.

En otros estudios de las proteínas de la Kluyveromyces Marxianus se

determinó que exista en ella la presencia de lisina y de treonina y que el
aminoácido encontrado en mayor cantidad es el ácido glutámico, característico
de organismos unicelulares, mientras que la metionina es el aminoácido
obtenido en menor proporción. Entonces observamos que el ácido glutámico al
encontrarse en mayor concentración genera una disminución del pH del medio.

Conclusiones.

 El pH del medio puede variar, dependiendo del tipo de nutriente que

tenga nuestra fermentación; en este caso el yacón con sus compuestos
nitrogenados representa la causa principal de la variación del pH en toda
la experiencia, ya que este producto tiene un alto contenido de proteínas
de aproximadamente 11 -17%

 El pH también puede variar por que la Kluyveromyces va a tomar el

nitrógeno de los aminoácidos orgánicos, y perdiendo su carácter
anfótero pasan a ácidos, lo cual va a originar el pH bajo del medio.

 Otra causa de esta disminución es que la Kluyveromyces Marxianus

tiene una gran cantidad de ácido glutámico, por lo tanto sabemos que
durante toda la fermentación hay multiplicación de células pero también
hay autolisis de estas, por lo tanto los ácidos orgánicos van a liberarse al
medio generando una baja en el pH.
  El trabajar con un pH bajo tiene la ventaja de que la fermentación esté
libre de microorganismos indeseables, pero se debe tener en cuenta que
mientras más bajo es el pH el proceso es más lento y podría traer otras
consecuencias como que la levadura no crezca correctamente.

VII. ANEXOS
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS: CULTIVO CELULAR
POR LOTES KLUYVEROMYCES MARXIANUS NRRL - 7571

Fecha GRUPO ACTIVIDAD

SEMANA 01

 Identificar y describir las

partes, accesorios y
geometría de un
fermentador de
laboratorio,
conocimiento de su
operación, esterilización,
Martes 26/05/15 A carga y descarga y toma
de muestras.
 Identificar en el
fermentador los
instrumentos de
medición y control
automático, así como la
calibración de los
sensores
 Identificar y describir las
partes, accesorios y
geometría de un
fermentador de
laboratorio,
conocimiento de su
operación, esterilización,
Miércoles 27/05/15 B carga y descarga y toma
de muestras.
 Identificar en el
fermentador los
instrumentos de
medición y control
automático, así como la
calibración de los
sensores
Viernes 29/05/15 C  Identificar y describir las
 partes, accesorios y
geometría de un
fermentador de
laboratorio,
conocimiento de su
operación, esterilización,
carga y descarga y toma
de muestras.
 Identificar en el
fermentador los
instrumentos de
medición y control
automático, así como la
calibración de los
sensores
SEMANA 02

 Esterilización de
pipetas, viales,
biorreactor.
 Preparación y
esterilización de medios
de activación 15 mL
(matraz de 125 mL),
medio de fermentación
100 mL (matraz de 500
mL) y medio de
A fermentación 2 L
(Biostat-Aplus)
 12:00 m
Martes 02/06/15 Activación de las cepas
en el medio sólido de
mantención
 02:00 pm (S/L)
Inoculación de la cepa
desde el medio solido
de mantención al medio
liquido de activación
B  11:00 pm (L/L)
Inoculación desde el
medio líquido de
activación al medio
liquido de fermentación
(matraz)
Miércoles 03/06/15  Armado del Biostat-
Aplus
 07:30 am
Inoculación desde el
medio líquido de
fermentación (matraz) al
Biostat-Aplus
 Medición del KLa
  08:00 am – 12:00 m
Seguimiento del cultivo
 Seguimiento del cultivo
Jueves 04/06/15  02:00 pm
Descarga y limpieza del
Biostat-Aplus
 Esterilización de
pipetas, viales,
biorreactor.
 Preparación y
esterilización de medios
de activación 15 mL
Viernes 05/06/15 (matraz de 125 mL),
medio de fermentación
100 mL (matraz de 500
mL) y medio de
fermentación 2 L
C (Biostat-Aplus)
SEMANA 03

 12:00 m
Activación de las cepas
en el medio sólido de
mantención
 02:00 pm (S/L)
Inoculación de la cepa
desde el medio solido
Lunes 08/06/15 de mantención al
medio liquido de
activación
A  11:00 pm (L/L)
Inoculación desde el
medio líquido de
activación al medio
liquido de fermentación
(matraz)
 Armado del Biostat-
Aplus
 07:30 am
Inoculación desde el
Martes 09/06/15 medio líquido de
fermentación (matraz) al
Biostat-Aplus
 Medición del KLa
 08:00 am – 12:00 m
Seguimiento del cultivo
Miércoles 10/06/15  Seguimiento del cultivo
 02:00 pm
Descarga y limpieza del
Biostat-Aplus
  Esterilización de
pipetas, viales,
biorreactor.
 Preparación y
esterilización de medios
de activación 15 mL
(matraz de 125 mL),
medio de fermentación
100 mL (matraz de 500
mL) y medio de
B fermentación 2 L
(Biostat-Aplus)
 12:00 m
Activación de las
cepas en el medio
sólido de mantención
 02:00 pm (S/L)
Inoculación de la cepa
Jueves 11/06/15 desde el medio solido
de mantención al
medio liquido de
activación
 11:00 pm (L/L)
Inoculación desde el
medio líquido de
activación al medio
liquido de fermentación
(matraz)
 Armado del Biostat-
Aplus
 07:30 am
Viernes 12/06/15 Inoculación desde el
C
medio líquido de
fermentación (matraz) al
Biostat-Aplus
 Medición del KLa
 08:00 am – 12:00 m
Seguimiento del cultivo
Sábado 13/06/15  Seguimiento del cultivo
 02:00 pm
Descarga y limpieza del
Biostat-Aplus

 Determinación de
Martes 16/05/15 A azúcares reductores y
proteínas
  Determinación de
Miércoles 17/05/15 B azúcares reductores y
proteínas

 Determinación de
Viernes 19/05/15 C azúcares reductores y
proteínas