CONSERVACIÓN DE BACTERIAS NO FILAMENTOSAS

RESUMEN
Esta práctica se realizó con el fin de elaborar y evaluar un Banco de Cepas
Primario utilizando glicerol al 25% (v/v) como crioprotectante ​; para esto se
realizó coloración de Gram para verificar la pureza de ​Escherichia coli; ​de este
cultivo, de hicieron diluciones seriadas de 10−1 hasta10​-8 y se sembró 0.1 mL en
agar BHI de las diluciones 10​-4​-10​-8​, se llevó a incubar a 37°C por 24 horas y se
hizo el recuento inicial. Posteriormente, se realizó el banco usando 2 mL de caldo
BHl y glicerol al 25%(v/v) + 2 mL del cultivo los cuales se repartieron en tres tubos
eppendorf que se conservaron a -20°C. Por último, se hicieron diluciones seriadas
a partir del banco (en el caso de los viales previamente descongelados) hasta la
dilución 10​-8 para sembrar de 10​-4 a 10​-8 y se incubó por 24 horas a 37°C. Por
último, se verificó pureza y se realizó el recuento posterior a la conservación.
Resultados: El recuento inicial fue de 68*10​10​UFC/mL que representó el 100%
de viabilidad. Posterior a la conservación se obtuvo que: Para -20ºC el recuento
fue 56*10​10​UFC/mL (99.2% de viabilidad), para 7ºC el recuento fue 38*10​7​UFC/mL
(72.5% de viabilidad) y para Tº ambiente, 24*10​2​UFC/mL (28,6% de
viabilidad),Según los datos de control interno ​Conclusión​: El método de
conservación fue efectivo en la temperatura de ​-20ºC ya que bajo esta condición
no disminuyó significativamente la viabilidad de la población bacteriana a
diferencia de las demás temperaturas y la concentración de glicerol no fue toxica,
demostrando su efectiva acción como crioprotectante.
PALABRAS CLAVE: ​Conservación, Crioprotectante, Glicerol, E.​coli,​ Viabilidad,
Temperatura.
INTRODUCCIÓN

Los procesos biotecnológicos requieren de métodos de conservación que

garanticen la viabilidad, la pureza y la estabilidad genética de una o varias cepas
de interés. Los microorganismos pueden ser conservados para su posterior
estudio o utilización a través de diferentes métodos. La congelación por ejemplo,
se ha convertido en la elección con más ventajas y por ello es necesario
considerar los diferentes factores que están implicados en este proceso: papel de
la membrana, estrés bacteriano, criopreservantes como el glicerol, y medios de
conservación (1). La congelación bacteriana es un método físico químico que
permite conservar microorganismos viables por un tiempo sin sufrir cambios
genotípicos. En este proceso se involucra el agua como microambiente y es ella la
que cambia su estado líquido a solido; de otro lado, la bacteria inmersa en este
medio debe adaptarse a las condiciones de este nuevo ambiente, transformar la
velocidad de su metabolismo, conservar su viabilidad y evitar que los cristales de
hielo formados por el cambio de temperatura del agua le ocasione algún daño. En
el proceso de adaptación bacteriana inducido por la congelación, es significativa la
reducción en la velocidad metabólica, a tal punto que su metabolismo se hace
imperceptible, pero suficiente para mantener el microorganismo vivo y algunas de
estas adaptaciones son : Producción de enzimas resistentes al frio, sistemas de
transporte adaptados a bajas temperaturas, aumento de la concentración de
ácidos grasos en la cadena de fosfolípidos de la membrana celular, esta última,
para que continúe el estado semifluido de la membrana y evitar la congelación.
Entre los factores relacionados con la adaptación bacteriana al proceso de
congelación se encuentran: El microambiente ya que la bacteria reconoce sus
espacios favorables , los modifica si puede, y se adapta o se aleja de ellos (2);la
membrana citoplasmática, ya que actúa como barrera esencial y el estrés
bacteriano, que condiciona los cambios de adaptación en la bacteria y
normalmente es un estado transitorio que le permite tener condiciones de
resistencia, situación que finaliza cuando las condiciones de estrés se eliminan;
este estado genera una adaptación que incluye entrar en un periodo de latencia,
donde la actividad enzimática disminuye notablemente e incluso podría decirse
que se detiene (3). Según lo mencionado en el artículo “protectantes usados en la
crioperservacion”, Las sustancias denominadas crioperservantes tienen
interacción molecular con el agua, la cual evita la acción destructiva del
congelamiento sobre las células, evitando formación de cristales de hielo con un
grado bajo de toxicidad para las células vivas (4). Entre las sustancias más
utilizadas en la conservación bacteriana a bajas temperaturas se encuentran:
macromoléculas no proteicas, sustancias ricas en proteínas, proteínas purificadas,
y/o sustancias no ionizables de bajo peso molecular que evitan la deshidratación
celular: glicerol, .sacarosa, lactosa DMSO (dimetilsulfoxido), entre otros ​(5).El
objetivo de la practica fue elaborar y evaluar un BCP (Banco de Cepas Primario)
utilizando glicerol al 25% (v/v) como crioprotectante (6).

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Microorganismo:
 Escherichia coli: ​S​e realizó una coloración de Gram con el fin de confirmar la
pureza del cultivo.

2. Determinación de la población inicial a partir de la cual se hizo el banco de

cepas de trabajo.

Se incubó un cultivo de ​E.coli por 12 horas 150 rpm a 37ºC, siendo esta la
población inicial para realizar diluciones seriadas de 10−1 hasta 10​-8​.Seguido a
esto, se sembró 0.1mL en agar BHI de forma masiva, de las diluciones 10​-4 hasta
10​-8. ​Se incubaron las cajas por 24 horas a 37ºC, y se hizo recuento siguiendo las
normas establecidas para siembras en superficie.

3. Elaboración de un banco de células de trabajo.

Se mezclaron 2mL de suspensión con 2 mL de caldo de cultivo BHI con glicerol

50% (v/v), para obtener un volumen final de 4 mL, con una concentración de
glicerol 25% (v/v), seguido a esto, se repartió este volumen en 3 tubos eppendorf
de 1.5 mL, solamente para la temperatura de -20ºC y se llevaron a congelación.
Se realizó el mismo procedimiento en tubos de vidrio para la conservación a
temperaturas de -7ºC y Tº ambiente.

4. Pruebas de viabilidad y estabilidad aceleradas.

Se realizó el recuento de las cajas sembradas con el fin de determinar la

viabilidad, se descongelaron los viales, y a partir de estos y de los tubos evaluados
a las diferentes temperaturas, se realizaron diluciones seriadas 1/10 hasta 10​-8
para hacer la siembra en agar BHI de la dilución 10​-4 a la 10​-8 de forma masiva;
Se incubó por 24 horas a 37ºCy posteriormente se realizó el recuento (6).

RESULTADOS
 En la tabla No.1 se muestra la morfología microscópica observada al hacer la
coloración de Gram con el fin de verificar que el cultivo utilizado para el
procedimiento era un cultivo axenico.

Tabla 1. Prueba de Pureza

Microorganismo Evaluado Reporte de coloración de Gram

Escherichia coli Cocobacilos Gram negativos
Fuente: Tomada de ref. 6, modificada por Autores.

En la tabla No.2 se reporta el recuento de la población inicial a conservar

equivalente al 100% de viabilidad, previa a la preparación del banco de trabajo.

Tabla 2. Población inicial a conservar

Microorganismo Recuento (UFC/mL)

Escherichia coli 68x10​10
Fuente: Tomada de ref.6, modificada por Autores.

- En el procedimiento realizado se obtuvo como resultado del laboratorio un

reporte de NO DATO, por lo cual se trabajó con los datos de control interno.

En la tabla 3 se muestran los datos de control interno donde se puede observar el

recuento y porcentaje de viabilidad obtenido luego de la conservación para cada
una de las temperaturas evaluadas.

Tabla 3. Prueba de estabilidad acelerada Datos de control interno

Fuente: Ref 6. Datos de control interno.

 Tabla 4. Prueba de estabilidad acelerada a diferentes temperatura usando
Glicerol 25%(V/V) como crioprotectante en ​Escherichia coli.

Temperatura Rto inicial Log 10 Rto final Log 10 %Viabilida

(UFC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL) d
-20ºC ND ND ND ND ND

7ºC ND ND ND ND ND

Ambiente ND ND ND ND ND
Fuente: Autores

En la figura 1 se muestra la disminución de la viabilidad con respecto a la variación

de temperaturas evaluadas siendo la temperatura ambiente la que presento mayor
perdida y temperatura de congelación la que mantuvo más la viabilidad.

Figura 1. Porcentaje de viabilidad versus temperaturas evaluadas

DISCUSIÓN

El objetivo principal de la conservación de cultivos microbianos es mantener al

microorganismo vivo, no contaminado y sin variación o mutación, en una condición
lo más cercana posible al aislamiento original. La crioconservación o conservación
a bajas o ultra bajas temperaturas permite detener los procesos metabólicos y el
deterioro biológico durante largos períodos, manteniendo la estabilidad genética
del material crioconservado. Con este método resulta muy importante el empleo
de crioprotectores, grupo heterogéneo de sustancias de alta afinidad por el agua
que contribuyen a la supervivencia de la célula durante la crio conservación. Los
crioprotectores disminuyen el punto de congelación del sistema y reducen la
cantidad y el tamaño de los cristales de hielo durante el enfriamiento,
contribuyendo a la protección física de las membranas y disminuyendo el
incremento de la concentración iónica producto de la congelación del agua.(1)
Los resultados en el laboratorio no se tomaron como referencia para la discusión
ya que se informó ND (no dato) para la práctica experimental ver tabla 4.
Por esta razón se analizaron los datos del control interno, donde se observaron
diferencias entre las tres temperaturas para la conservación del microorganismo
(E​scherichia coli​) a corto plazo mediante la técnica de congelación, (ver la tabla 3).
Entre las tres temperaturas, la mejor para la conservación E​. coli utilizando
glicerol al 25%(V/V) como agente crioprotector fue a -20ºC, por tener un
porcentaje de viabilidad del 99,5% y el logaritmo de Unidades formadoras de
colonias por mililitros fue 11.74 en la prueba de estabilidad acelerada (Ver figura
1),por esta razón, se considera un método de conservación efectivo para
mantener la viabilidad de las células ya que detiene en su totalidad el
funcionamiento del metabolismo. Por ello en la criopreservacion bacteriana es
indispensable considerar el papel que juega la membrana citoplasmática, ya que
actúa como una barrera esencial y separa el interior con el exterior celular. (7)
para ello se utilizan agentes crioprotectante como el glicerol ya que es el más
utilizado en microbiología, porque penetra lentamente en la pared celular y
también en la membrana citoplasmática; este agente, es altamente hidrofílico, se
forman puentes de hidrogeno con el agua intracelular evitando así la
deshidratación excesiva, reduce la toxicidad de la sal y previene la formación de
grandes cristales de hielo dentro de la célula, dependiendo de la temperatura y el
tipo de las células para su conservación (5). Sin embargo, se presentan algunas
desventajas con este método entre las cuales se encuentran la muerte de los
microorganismos a temperaturas por debajo de 0ºC, esto depende de varios
factores como: el número inicial de células viables, la tasa de congelación y
descongelación y la temperatura de congelación siendo las temperaturas de 0 a
-20ºC, las más destructivas para algunos microorganismos, tiempo de
almacenamiento y la presencia de protectores físicos. Para conseguir una mínima
destrucción de las bacterias interesa que la cristalización sea extracelular y que
las bacterias se deshidraten parcialmente impendiéndose la nucleación
intracelular, pero no lo suficiente como para que se reduzca su viabilidad por se
combina con el uso de agentes crioprotectantes (7).
En el control interno se observo mejor una mejor conservación a -20°C, puesto
que presento una viabilidad del 99,5 %, esto es debido a que el glicerol actúa de
mejor manera a bajas temperaturas porque no alcanza a penetrar el interior de la
célula, solo se adhiere a la célula como una capa protectora, por ende esta
temperatura es ideal para la conservación de cepas en este medio. También
puede deberse a que ​Escherichia coli posee un regulador de transcripción, el
CdpA, que reconoce los promotores del gen produciendo proteínas de choque frio,
que estabilizan el mRNA de manera que pueda reiniciarse la producción de
proteínas, además, dentro de la membrana de la célula la composición de los
fosfolipidos y los glicolipidos cambia, ya que se incrementa la cantidad de ácidos
grasos insaturados a expensas de los ácidos grasos saturados, formando una
bicapa con los grupos principales polares en las superficies intracelulares y
extracelulares. Las cadenas acil del acido graso se unen con los grupos metílicos
terminales situados en el interior de la bicapa para asegurar la función de la
membrana tal como actividad enzimática y transporte de solutos (8).

Mientras que a temperatura ambiente y a 7°C, la población celular disminuye a

través del tiempo en varias unidades logarítmicas, debido probablemente a que el
metabolismo en ambas condiciones pudo acelerarse como efecto de la
temperatura, llevando a que la población celular disminuyera, presentándose una
desnaturalización de las proteínas y alteraciones producidas en las membranas
lipidicas, generando cambios en la barrera de permeabilidad (9)

Las temperaturas de 7º y a temperatura ambiente se ve una gran disminución de

la viabilidad de la cepa, debido a que entre más alta sea la temperatura es mas
fácil para el glicerol penetrar en la célula, desplazando el agua que esta contiene y
por ende intoxicándola y termina matándola, por esta razón el porcentaje de
viabilidad disminuye notoriamente. (6)

CONCLUSIÓN

- A una concentración de 25% de glicerol y a -20ºC de temperatura es

posible obtener un 93.7% de viabilidad lo que representa que la población
solo disminuye en un ciclo indicando que el método de conservación en
esas condiciones es efectivo para un microorganismo como​ E.coli.

BIBILIOGRAFIA

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Congelación Bacteriana: Factores que intervienen en el proceso. Programa
de bacteriología y laboratorio Clínico. Facultad de ciencias de la Salud.
Universidad Colegio mayor de Cundinamarca. Nova-publicación científica
ISSN:1794-2470 vol 3. Enero-junio de 2005:1-120.
2. Pettersson M, Baath E. Temperature-dependent changes in the soil bacteria
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3. Mukamolova G, Kaprelyants A, Douglas B. Young Michael. Adoption of the
transiently non-culturable state- a bacterial survival strategy. Advances in
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4. Hubalek Z. Review. Protectants used in the cryopreservation of
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63-68.Capitulo 8.Conservacion de Bacterias no Filamentosas.
7. Bouachanh T, Jean P, Desmasures N, Micheline G, Jean, P. Resin straw as
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Microbiological Methods. 2004; 57:181. 186
8. Beales, N. adaptation of microorganism to cold temperatures, weak acid
preservatives, low pH, and osmotic stress: a Review. Comprehensive
reviews in food science and food safety. Institute of food technologists 2004:
3. 20 p-
9. Singlenton, P. bacterias en biología, biotecnología y medicina. Editorial
Acribia S.A 2004. Zaragoza España. 55-59 p.