DIGESTION DE LAS PROTEINAS: ACCION DE LAS ENZIMAS

DIGESTIVAS PANCREATICAS SOBRE LA CASEINA

I. INTRODUCCION:

La digestión de las proteínas, o degradación hasta aminoácidos en el tubo

digestivo, es un proceso complicado que se realiza con el concurso de
diversas enzimas proteolíticas Entre estas enzimas proteoliticas tenemos: a)
de origen gástrico: pepsina y renina; b) de origen pancreático: tripsina,
quimotripsina, elastasa y carboxipeptidasa; c) de origen intestinal:
aminopeptidasas, dipeptidasas. Son endopeptidasas: pepsina, tripsina,
quimotripsina, elastasas. Son exopeptidasas: carboxipeptidasa y
aminopeptidasa. La tripsina, es activada por la enterocinasa en el intestino, y
es específica de los enlaces peptidicos sobre el lado carboxílico de residuos
de aminoácidos básicos: lisina y arginina solamente. La quimotripsina es
específica para los enlaces peptidicos de los aminoácidos sin carga como los
aromáticos: tirosina, triptofano y fenilalanina. La elastasa tiene una
especificidad amplia, ataca a los residuos pequeños, como la glicina, alanina
y serina. La carboxipeptidasa hidroliza el enlace peptídico carboxiterminal en
las cadenas polipeptidicas.
La falta de enzimas proteolíticas produce creatorrea (presencia de fibras
musculares identificables en las heces, que provienen de la carne de los
alimentos), y azorrea (gran cantidad de productos nitrogenados en las heces).
En el lactante con ausencia congénita de tripsinogeno y por consiguiente por
falta de activación de quimotripsinógeno y procarboxipeptidasa, existe
hipoproteinemia, con retardo marcado del crecimiento.

La presente práctica tiene como finalidad demostrar la acción hidrolítica de las

enzimas digestivas contenidas en el páncreas sobre la caseína o proteína de
la leche, determinado los productos (aminoácidos) con ninhidrina

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 II. REACTIVOS A UTILIZAR:

- Caseína al 1% en buffer fosfato 0,1 M pH 8.

- Buffer fosfato 0,1 M pH 8.
- Solución de extracto pancreático.
- Solución acuosa de ninhidrina al 0,25% saturada con butanol.
- Acido tricloroacético al 10%.

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento

Armar el siguiente sistema:
COMPONENTES (ml) I II III
Caseína al 1% 1 1 ---
Buffer fosfato 0.1 M pH 8.0 1 1 1
Solución de extracto pancreático 1 --- 1
Agua destilada --- 1 1

Pasos:

* Mezclar y colocar al baño de agua a 37 ºC por 30 minutos.

* Después del tiempo de incubado tomar 0,5 ml, de cada uno de los
tubos y trasladarlo a otro sistema numerado (I, II, III).
* En este nuevo sistema, agregar 1 ml de solución de ninhidrina.
* Mezclar y llevar a un baño de agua hirviendo (franca ebullición),
durante 3 a 5 minutos.
* Observa los cambios de color de cada tubo.
* Luego a los tubos de incubación del primer sistema, agregue gota a
gota 1 ml de ácido tricloroacético al 10% agitando continuamente.
* Observe las variaciones que se produce en cada tubo.

IV. RESULTADOS

Sistema I:

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 TUBO I: La ninhidrina evidencia la formación de aminoácidos, debido a
esto el tubo I se va a teñir más oscuro, por la presencia de enzima y
sustrato.
 TUBO II: En este tubo sólo hay sustrato, así que la proteína no se degrada,
la ninhidrina lo reconoce con menor intensidad, haciendo que se tiña de
un color rojo pardo medio.
 TUBO III. Ausencia de sustrato. No hay reacción alguna. La tinción es casi
transparente.

Trabajando en el primer sistema:

1ml de ácido Tricloroacetico
Resultados:

El ácido tricloroacético precipita la proteína que no ha sido degrada, es por

esto observamos lo siguiente:

 TUBO I: Presencia de sustrato y enzima. La proteólisis se dio por

completo, no quedaron residuos de péptidos por lo que la solución al entra
en contacto con el ácido tricloroacético no revela precipitado.
 TUBO II: Aquí observamos la precipitación de proteína no degradada ya
que no hubo enzima que actuara sobre el sustrato.
 TUBO III: Ausencia de sustrato. El ácido tricloroacético no tiene proteínas
que precipitar.

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V. CUESTIONARIO

1. Elabore un esquema con la digestión y absorción de proteínas y

aminoácidos.

2. Explique el sitio de producción y la acción de las hormonas que

intervienen en el proceso de digestión y absorción de los
aminoácidos

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 3. Escriba dos esquemas mostrando dos ejemplos de transaminación
y dos de desaminación con los nombres de aminoácidos y alfa
cetoácidos que participan.

TRANSAMINACIONES:

DESAMINACIÓN:

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 INHIBICION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS: ACCION DE LA SOYA
HERVIDA Y CRUDA SOBRE EL EFECTO PROTEOLITICO DE LA TRIPSINA

I. INTRODUCCION:

La tripsina actúa como una endopeptidasa e hidroliza prácticamente toda

clase de proteínas. Digiere las proteínas desnaturalizadas y parcialemente
digeridas, con mayor rapidez que las originales desdoblándose en
polipéptidos de peso variable y algunos aminoácidos.
Algunos alimentos en estado natural poseen componentes perjudiciales para
la nutrición. Por ejemplo el frijol de soja contiene un principio cuya actividad
antitripsina dificulta la digestión de las proteínas. Esta sustancia de naturaleza
peptídica es inactivada por el calor, ello explica en parte que el valor nutritivo
del frijol de Soja aumenta considerablemente si se coce a ebullición por varios
minutos.
El ovomucoide de la clara de huevo inhibe también de manera enérgica la
tripsina. Es interesante también que el aceite de semilla de algodón posea un
pigmento, el gisipol, con actividad antioxidante y antitripsina que disminuye el
apetito y dificulta la digestión de las proteínas.Los extractos de páncreas
poseen también un péptido inhibidor de la tripsina, la alfa-1 antitripsina fecal
(1-AT-Fecal) que es una glicoproteína, secretada a la luz intestinal.

La finalidad del siguiente experimento es demostrar el efecto inhibidor del

extracto de soya cruda sobre el efecto proteolítico de la tripsina, efecto que
desaparece cuando la soya es hervida.

II. MATERIALES Y REACTIVOS A UTILIZAR:

- Buffer fosfato 0,1 M pH 8,0.
- Solución de ninhidrina 0,25% saturada con butanol.
- Solución de tripsina 20 mg%.
- Proteína de soya cruda 30%.
- Proteína de soya hervida 30%.
- Etanol absoluto.

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III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)

Armar el siguiente sistema:

COMPONENTES (ml) I II III IV

Buffer fosfato 0.1 M pH 8.0 2,5 2,5 2,5 2,5
Proteína de soja cruda 30% 0.5 0,5 - -
Proteína de soja hervida 30% - - 0,5 0,5
Solución de tripsina 20 mg% 0,2 - 0,2 -

- Pasos:
1. Incubar en baño maría a 37°C durante 1 hora.
2. Después del tiempo de incubación: agregar a cada uno de los
tubos 2 ml de etanol absoluto.
3. Mezclar y centrifugar a 2500 rpm por 10 min.
4. En otra serie de tubos numerados I , II, III, IV colocar 1 ml de
sobrenadante de los tubos respectivos del paso anterior y agregar
1 ml de ninhidrina 0,25%.
5. Someter los tubos a temperatura de ebullición del agua utilizando
baño maría durante 5 minutos.
6. Anotar los resultados.

IV. CUESTIONARIO:

1. Explique con sus propias palabras cuál cree que es el objetivo de la

práctica que realizó.

El objetivo central del siguiente experimento es demostrar el efecto inhibidor del

extracto de soya cruda sobre el efecto proteolítico de la tripsina.

Gran parte de los alimentos de origen vegetal, presentan inhibidores de

proteasas, en donde la mayor proporción se manifiesta en la semilla.

También se demuestra en esta práctica que tal efecto inhibidor desaparece al

utilizar soya hervida. Debido a que el hervor rompe con tal efecto.

Estudios relacionados con la inactivación del inhibidor de soya fueron realizados

por Bainter (Bainter, 1981) y por Collins y Beaty (Collins y Beaty, 1980),

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indicando que es suficiente un tratamiento con agua hirviendo por tres minutos
para inactivar el 90% de inhibidor. La mayoría de los inhibidores de proteasas
son inactivados por la acción del calor, por lo que en el cocimiento de los
alimentos que contienen este tipo de compuestos, generalmente va
acompañado de un incremento en la calidad nutritiva.

2. Por qué razón el ovomucoide de la clara del huevo inhibe la acción

de la tripsina.

El ovomucoide es una glicoproteína el cual tiene un inhibidor de tripsina de una

alta estabilidad térmica.

Posee una serie de enlaces azufrados. Es un inhibidor del tipo Kazal, siendo su
sitio activo en el residuo de lisina para la mayoría de las aves, pero en gallinas
se encuentra en la arginina.

3. ¿Qué es el gisipol y cómo actúa en su acción antioxidante?.

Químicamente, el gisipol se clasifica como

un polifenol, que permeabiliza las células y
actúa como un inhibidor para varias de las
enzimas deshidrogenasas. Es un pigmento
amarillo. Básicamente, el gisipol se presenta
en dos formas: libre y ligado, siendo de
mayor importancia la forma libre, que es biológicamente tóxica y que
corresponde casi a la totalidad de gisipol de la planta del algodón. Normalmente,
en la semilla del algodón, el gisipol total constituye de 0,8 a 1,4%. El gisipol
(C30H30O8) es una toxina potente que interfiere con la utilización de los
elementos minerales, forma complejos estables con cationes, como el Fe++,
pudiendo producir anemia. Combina su grupo carbonilo con las proteínas y los
aminoácidos, siendo el factor principal de la toxicidad su efecto acumulativo,
causa alteraciones en las organelas celulares, altera los procesos bioquímicos e
inhibe la actividad de algunas enzimas, así como la síntesis de DNA.

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 Ejerce un efecto inhibidor en las enzimas digestivas. Es un antioxidante biológico
que hace que disminuya el apetito y que se produzca estreñimiento. Las gallinas
alimentadas con harina de semilla de algodón pueden dar huevos con yemas
moteadas debido al efecto del gisipol.
El gisipol es tóxico para los animales monogástricos cuando se les suministra en
cantidades excesivas. El cerdo y los conejos son los animales más sensibles.
Las aves de corral son más tolerantes. Los rumiantes adultos pueden ingerir
gisipol mientras que los bovinos jóvenes son mucho más susceptibles.

El efecto biológico del gisipol puede evitarse añadiendo hierro, en forma de

sulfato férrico.

4. Con dibujos represente la práctica realizada.

TUBO I

BUFFER FOSFATO 0,1M /

pH 8 ETANOL
37ºC x 1 ABSOLUTO

SOLUCIÓN DE hora
TRIPSINA PROTEÍNA DE SOYA
CRUDA 30%

C
E
N
T
RI
F
U
NIHIDRINA G
A
NO HUBO REACCIÓN, R
DEBIDO A LA
INACCIÓN DE LA Extraer 1ml
HERVIR
TRIPSINA, YA QUE del
sobrenadante
FUE INHIBIDO POR LA
ACCIÓN DE LA SOYA
CRUDA.

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 TUBO II

BUFFER FOSFATO 0,1M / ETANOL

pH 8 ABSOLUTO
37ºC x 1
hora
PROTEÍNA DE SOYA
CRUDA 30%

C
E
N
T
NIHIDRINA RI
F
U
G
NO HUBO A
Extraer 1ml
REACCIÓN POR HERVIR del R
LA AUSENCIA DE sobrenadante
TRIPSINA

TUBO III

BUFFER FOSFATO 0,1M / ETANOL

pH 8 ABSOLUTO
37ºC x 1
hora
PROTEÍNA DE SOYA
HERVIDA 30%

C
E
N
SOLUCIÓN DE T
TRIPSINA NIHIDRINA RI
F
LA SOYA HERVIDA U
PERDIÓ SU ACTIVIDAD G
ANTITRIPSINA. AL Extraer 1ml A
HERVIR R
AGREGAR NIHIDRINA, del
PONE DE MANIFIESTO sobrenadante
LA ACCIÓN DE LA
TRIPSINA.

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 TUBO IV

BUFFER FOSFATO 0,1M / ETANOL

pH 8 ABSOLUTO

37ºC x 1 hora
PROTEÍNA DE SOYA
HERVIDA 30%

C
E
N
T
RI
F
NIHIDRINA
U
G
A
R

HERVIR
Extraer 1ml del
sobrenadante

V. CONCLUSIONES:

 La soya cruda tiene propiedades inhibitorias para la tripsina, impidiendo

la proteólisis de las proteínas y la formación de aminoácidos. en los tubos
1 y 2, no ocurrió proteólisis, no hubo aminoácidos libres, lo que se
demostró con la nihidrina (indicador de aminoácidos libres).

 La actividad antitripsina es inhibida al hervir la soya, lo que permite la

acción de la tripsina y la formación de aminoácidos libres. la nihidrina tiñe
la solución de color violeta oscuro. lo que se observó con más acentuación
en el tubo nº 3.

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VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 Benítez R, Ibarz A, Pagan J. Hidrolizados de proteína: procesos y

aplicaciones [Internet]. Scielo.org.ar. 2018 [cited 30 May 2018]. Available
from: http://www.scielo.org.ar/pdf/abcl/v42n2/v42n2a08.pdf

 León M. Actividad de las Enzimas Tripsina y Lipasa Pancreáticas en

Cerdos Alimentados con Harina de Pijiguao (Bactris gasipaes H.B.K.) y
Lisina Sintética [Internet]. Redalyc.org. 2018 [cited 30 May 2018].
Available from: http://www.redalyc.org/html/3731/373139084002/

 http://biblioteca.ucm.es/tesis/19911996/D/2/AD2006301.pdf

 https://www.pancan.org/section_en_espanol/learn_about_pan_cancer/di
et_and_nutrition/Pancreatic_enzymes.php

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