Primera Unidad Fundamentos Bioquímicos, Enzimología y Biología Molecular de las membranas biológicas

PRACTICA N°4
- DIGESTION DE LAS PROTEINAS E INHIBICION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS
PROTEICAS --

ACCION DE ENZIMAS DIGESTIVAS PANCRETICAS SOBRE LA CASEINA.

INTRODUCCION:
La digestión de las proteínas, o degradación hasta aminoácidos se inicia en la boca, en mínima cantidad, se continua en el
estómago con la pepsina; pero es el páncreas que produce enzimas que cumplen un rol principal en este proceso conociéndose
como enzimas proteolíticas. Entre estas se tiene a: tripsina, quimotripsina, elastasa y carboxipeptidasa; y las de origen
intestinal: aminopeptidasas, dipeptidasas. Estas mismas enzimas se pueden clasificar a su vez como endopeptidasas: pepsina,
tripsina, quimotripsina, elastasas y exopeptidasas: carboxipeptidasa y aminopeptidasa.

La tripsina, es activada por la enterocinasa en el intestino, y es específica de los enlaces peptídicos sobre el lado carboxílico de
residuos de aminoácidos básicos: lisina y arginina solamente. La quimotripsina es específica para los enlaces peptídicos de los
aminoácidos sin carga como los aromáticos: tirosina, triptofano y fenilalanina. La elastasa tiene una especificidad amplia, ataca
a los residuos de aminoácidos alifáticos neutros pequeños, como la glicina, alanina y serina. Las exopeptidasas catalizan la
hidrólisis de enlaces peptídicos, uno a la vez, desde los extremos de péptidos. Las carboxipeptidasas, secretadas en el jugo
pancreático, hidroliza el enlace peptídico carboxiterminal en las cadenas polipeptídicas. Todas ellas son sintetizadas como
zimógenos y son activadas al ser liberadas a la luz del intestino para que actúen sobre las proteínas

La falta de enzimas proteolíticas produce creatorrea (presencia de fibras musculares identificables en las heces, que provienen
de la carne de los alimentos), y azorrea (gran cantidad de productos nitrogenados en las heces). En el lactante con ausencia
congénita de tripsinogeno y por consiguiente por falta de activación de quimotripsinógeno y procarboxipeptidasa, existe
hipoproteinemia, con retardo marcado del crecimiento.

FUNDAMENTACIÓN DE LA TECNICA:
La reacción con la ninhidrina produce colores que sirven como base para la cuantificación de todos los aminoácidos. A simple
vista podemos distinguir una coloración que va de azul a violeta intenso. Ya con la ayuda de equipos podemos evaluar la
intensidad de la luz midiendo la absorción con longitud de onda de 540 nm. Aminoácidos secundarios como la prolina forman
productos ligeramente distintos, estos son amarillos y su máxima absorción es a 440 nm.

FINALIDAD:
 Demostrar la acción hidrolítica de las enzimas digestivas contenidas en el páncreas sobre la caseína o proteína de la leche,
determinado los productos (aminoácidos) con ninhidrina.

MATERIAL Y EQUIPOS
 Material: de vidrio: tubos de ensayo, pipetas milimetradas.
 Equipos: baño maría, olla para baño de agua hirviendo.
 Reactivos:
 Caseina al 1% en buffer fosfato 0,1 M pH 8.
 Buffer fosfato 0,1 M pH 8.
 Solución de extracto pancreático.
 Solución acuosa de ninhidrina al 0,25% saturada con butanol.
 Acido tricloroacético al 10%.

PROCEDIMIENTO
 Armar el siguiente Incubado:
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (ml)
I II III
Caseina al 1% 1.0 1.0 --
Buffer fosfato 0.1M pH 8.0 1.0 1.0 1.0
Solución de extracto pancreático 1.0 -- 1.0
Agua Destilada -- 1.0 1.0
Mezclar y colocar en baño maría a 37 ºC por 30 minutos.
Transcurrido el tiempo, armar un nuevo sistema y colocar:

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TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (ml)
I II III
Incubado anterior 0.5 0.5 0.5
Ninhidrina 1.0 1.0 1.0
Mezclar y llevar a un baño de agua hirviendo (franca ebullición), durante 3 a
5 minutos.
Observa los cambios de color de cada tubo.

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 Trabajar con lo que resta del incubado:

TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (ml)
I II III
Incubado anterior 0.5 0.5 0.5
Ácido tricloroacético al 10% (gota a gota) 1.0 1.0 1.0
Agitar continuamente.
Observa las variaciones que se produce en cada tubo.

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Actividades a desarrollar por el alumno:

- Explique bioquímicamente lo encontrado.

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ACCION DE LA SOYA HERVIDA Y CRUDA SOBRE EL EFECTO PROTEOLITICO DE LA TRIPSINA.

INTRODUCCION:
La tripsina actúa como una endopeptidasa e hidroliza prácticamente toda clase de proteínas. Digiere las proteínas
desnaturalizadas y parcialmente digeridas, con mayor rapidez que las originales desdoblándose en polipéptidos de peso
variable y algunos aminoácidos.

Algunos alimentos en estado natural poseen componentes perjudiciales para la nutrición. Por ejemplo, el frijol de soja contiene
un principio cuya actividad antitripsina dificulta la digestión de las proteínas. Esta sustancia de naturaleza peptídica es
inactivada por el calor, ello explica en parte que el valor nutritivo del frijol de Soja aumenta considerablemente si se coce a
ebullición por varios minutos.

El ovomucoide de la clara de huevo inhibe también de manera enérgica la tripsina. Es interesante también que el aceite de
semilla de algodón posea un pigmento, el gisipol, con actividad antioxidante y antitripsina que disminuye el apetito y dificulta la
digestión de las proteínas.Los extractos de páncreas poseen también un péptido inhibidor de la tripsina, la alfa-1 antitripsina
fecal (1-AT-Fecal) que es una glicoproteína, secretada a la luz intestinal.

FUNDAMENTACIÓN DE LA TECNICA:
El inhibidor de tripsina es una de las peptidasas encontradas en la soya. Este inhibidor es el único polipéptido que forma
complejo estable y enzimáticamente inactivo con la tripsina gracias a la compatibilidad de sus enlaces peptídicos con el sitio
activo de esta última, reduciendo la disponibilidad celular. La soya también tiene lipooxigenasa, ureasa, hemaglutinina y factor
antitiroideo. El inhibidor de la tripsina de la soya, es termolábil así que en la soja hervida pierde su capacidad de inhibir a la
tripsina.

FINALIDAD:
 Demostrar el efecto inhibidor del extracto de soya cruda sobre el efecto proteolítico de la tripsina, efecto que desaparece
cuando la soya es hervida.

MATERIAL Y EQUIPOS
 Material: de vidrio: tubos de ensayo, pipetas milimetradas.
 Equipos: centrífuga, baño maría, olla para baño de agua hirviendo.
 Reactivos:
 Buffer fosfato 0,1 M pH 8.
 Solución de ninhidrina 0,25% saturada con butanol.
 Solución de tripsina 20 mg%
 Proteína de soya cruda 30%
 Proteína de soya hervida 30%
 Etanol absoluto.

PROCEDIMIENTO
 Se arma el siguiente sistema, colocando:
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (ml)
I II III IV
Buffer fosfato 0.1M pH 8.0 2.5 2.5 2.5 2.5
Proteína de soya cruda al 30% 0.5 0.5 -- --
Proteína de soya hervida al 30% -- -- 0.5 0.5
Solución de tripsina al 20% 0.2 -- 0.2 --
Se mezclan y colocan todos los tubos en baño maría a 37 ºC, durante 60 minutos.
Transcurrido el tiempo, se agrega:
Etanol absoluto (ml) 2.0 2.0 2.0 2.0
Se mezclan y todos los tubos se centrifugan a 2500 rpm, durante 10 minutos.
Observe los resultados.

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 Se arma un segundo sistema, colocando:

TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (ml)
I II III IV
Sobrenadante anterior 1.0 1.0 1.0 1.0
Ninhidrina al 0.25% 1.0 1.0 1.0 1.0
Se somete a todos los tubos a baño de agua hirviendo durante 5 minutos.
Observe los resultados.

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Actividades a desarrollar por el alumno:

- Explique bioquímicamente lo encontrado.

PREGUNTAS DE APLICACIÓN.
1) ¿Cuáles fueron los objetivos de la práctica?
2) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica.
3) Explique el sitio de producción y la acción de las hormonas que intervienen en el proceso de digestión y
absorción de los aminoácidos
4) Elabore un esquema con la digestión y absorción de proteínas y aminoácidos.
5) Elabore un esquema mostrando dos ejemplos de transamiación e identifique los componentes que
interviene.
6) Elabore un esquema mostrando dos ejemplos de desaminación e identifique los componentes que
interviene.
7) ¿Cuál es la acción de la soya sobre la digestión de la proteína?
8) ¿Cuál es la razón de utilizar ninhidrina en el experimento de la digestión de las proteínas?
9) ¿Qué ocurre si se trata con el calor la soya?

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10) ¿Por qué el ovomucoide de la clara de huevo inhibe la acción de la tripsina?

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.
2) Nelson D, Cox M. Lehninger. Principios de Bioquímica. 6ta Edición, Editorial Omega, España, 2011