BIOQUIMICA I ELECTROFORESIS 2D (IEF+SDS-PAGE)

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
(ISOELECTROENFOQUE y SDS-PAGE)

Introduccin
Como bien sabemos, la electroforesis es un mtodo de separacin de molculas biolgicas que se basa en la
migracin de las mismas segn su carga en un campo elctrico. Luego se desarroll la electroforesis
bidimensional, que es una combinacin secuencial de:
1. el enfoque isoelctrico y
2. la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
De este modo se es capaz de separar:
protenas de masa molecular idntica que difieren en su pI
protenas con valores de pI similares pero con diferentes masas moleculares.

El nombre de la tcnica, 2D (IEF+SDS-PAGE), sugiere que separa las protenas:

En una primera dimensin: mediante isoelectroenfoque (IEF) las separa segn su punto
isoelctrico (pI)
En una segunda dimensin: las separa por su peso molecular (MW) por SDS-PAGE; SDS ya que
se emplea Dodecil Sulfato Sdico (detergente) y PAGE dado que las protenas corren en un gel de
poliacrilamida.
Las partculas migrarn hacia el ctodo o el nodo en relacin a su carga. Su movilidad depende de una
combinacin de:
su carga
su peso molecular
su estructura tridimensional

Isoelectroenfoque (IEF)
El Isoelectroenfoque es un tipo de electroforesis que se emplea para separar molculas cargadas.
Fundamento:

Una protena tiene grupos cargados de ambas polaridades, por lo que presenta un punto isoelctrico (pI)
que corresponde al valor de pH al cul la molcula posee carga neta (z) igual a cero (zwitterion), y por lo
tanto es inmvil en un campo elctrico.
En un zwitterion simple, pI= (pK1+ pK2)/2 (Fig. A); mientras que para un aminocido de cadena lateral
cido-base, pI es el promedio de los pK entre la especie con carga+1 y -1 (Fig. B).
Z= +1 0 -1 +2 +1 0 -1

Fig. A) Curva de titulacin del aminocido Glicina. Fig. B) Curva de titulacin del aminocido Histidina.

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Autores: Arizmendi, Ailn - Gribaudo, Virginia - Lonigro, Manuel - Loyola, Ailn - Polarolo, Antonela - Wingeyer, Evelina
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Se establece un gradiente de pH en el gel de poliacrilamida, que puede tener forma de cilindro o lmina,
realizando una electroforesis de una mezcla de polianfolitos (polmeros pequeos con mltiple carga). El gel
suele tener urea, de concentracin cercana a 6M, que a diferencia del SDS no posee carga y no puede afectar
en forma directa la carga neta de las protenas. Se coloca la muestra (mezcla de protenas obtenida) en un
buffer de baja fuerza inica y con la aplicacin de una diferencia de voltaje, las protenas cargadas se
desplazan hasta alcanzar un pH equivalente a su punto isoelctrico.

Fig. C) Enfoque isoelctrico. Se

establece un gradiente estable de pH en el
gel por adicin de anfolitos adecuados.
Se coloca una mezcla de protenas en un
pocillo del gel y se aplica un campo
elctrico. Las protenas se distribuyen a lo
largo del gel de acuerdo con sus valores de
pI.

Al aplicar la diferencia de potencial las protenas que se encuentran en regiones de pH inferior a su punto
isoelctrico estarn cargadas positivamente, y migraran hacia el ctodo; mientras que aquellas que se
encuentran en regiones de pH ms altos que su punto isoelctrico tendrn carga negativa y migrarn hacia el
nodo.

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Ventajas:

Un anfolito siempre se detiene en la zona en la que el pH coincide con su punto isoelctrico.

Gran repetitividad: los resultados no estn sujetos a variaciones debidas a las condiciones
experimentales, tales como la diferencia de potencial elctrico aplicada.
Gran poder de resolucin.
La muestra se puede colocar en cualquier zona del medio de soporte, en la zona cercana al ctodo, al
nodo o en el centro del mismo.

Aplicaciones:

La capacidad del IEF de separar las protenas en bandas definidas lo hace til como herramienta
analtica y preparativa. Varias preparaciones proteicas que se crean homogneas se separaron en
varios componentes mediante esta tcnica.
Una de las aplicaciones ms importantes de la IEF es la electroforesis bidimensional, que consiste
en la separacin de protenas segn su pI y su respectivo peso molecular (MW).

Electroforesis SDS-PAGE
En este tipo de electroforesis utilizamos dodecil sulfato de sodio (SDS), que es un detergente usado en
muchas preparaciones bioqumicas dado que se une con firmeza a las protenas y las hace asumir una
estructura desordenada de manera de obtener una eficiente desnaturalizacin.

Fundamento:

La electroforesis de protenas en un gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) separa a las

macromolculas en el orden de sus masas moleculares por los efectos de filtracin por geles.
Este tipo de electroforesis es una variante de la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) donde los
geles se forman por polimerizacin de la acrilamida y la N,N-metilen bisacrilamida inducida por radicales
libres en un buffer.

Las protenas unen SDS en una proporcin bastante uniforme de alrededor de 1,4g del detergente por
gramo de protena (que equivale a 1 molcula de SDS cada 2 residuos aminoacdicos aproximadamente).
La carga otorgada por el SDS enmascara a las cargas proteicas intrnsecas de forma que las protenas
tratadas con SDS tienden a presentar relaciones carga/masa casi idnticas y formas similares (desplegadas).
Es por esto que la separacin ocurre por efecto de filtracin de geles en funcin del MW (separacin por
tamao o largo de la cadena polipeptdica).

Las masas moleculares de las protenas se determinan con una precisin del 5-10 % con esta tcnica, y las
movilidades relativas de las protenas varan en forma lineal con el logaritmo de sus masas moleculares.
Algunas protenas estn formadas por ms de una cadena polipeptdica; al tratarla con SDS se rompen las
interacciones no covalentes entre estas subunidades. De esta manera el SDS-PAGE nos permite obtener
masas moleculares de las subunidades de la protena en vez de la protena intacta. Distinto es el caso cuando
tenemos subunidades unidas por puentes disulfuro. En ste ltimo caso, para separar las subunidades se
agrega mercaptoetanol a los geles SDS-PAGE de manera de escindir los puentes di-sulfuro por reduccin.
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Fig. D) Determinacion de la masa molecular de una protena. En la imagen de la izquierda podemos ver protenas patrn de
masa molecular conocida en el carril 1 del gel revelado luego de la electroforesis. Estas protenas marcadas se pueden utilizar para
determinar la masa molecular de una protena desconocida (carril 2). Una grfica del Log M r de las protenas patrn frente al
desplazamiento relativo de las mismas es lineal, lo que permite leer la masa molecular de la protena desconocida.

Aplicaciones:
Pueden analizarse las protenas contenidas en:
lquidos biolgicos: sangre, plasma, suero (plasma sin fibringeno), orina, lquido sinovial, saliva,
lgrimas.
Alimentos, especialmente lcteos y cereales.
En investigacin y en clnica, tanto humana como animal

Electroforesis Bidimensional
La electroforesis 2D (IEF+SDS-PAGE) es la herramienta ms empleada para el anlisis global y la
separacin de los componentes del proteoma (conjunto de protenas que se expresan a partir de un genoma
en un momento dado).
Dicha tcnica pasa por las siguientes etapas:
1. Preparacin de la muestra; En este paso se emplean agentes caotrpicos, surfactantes y agentes
reductores. Los agentes caotrpicos, como la urea, provocan la desnaturalizacin de las protenas
por ruptura de puentes de hidrgeno, dejando expuestos los residuos hidrofbicos que son
solubilizados por los agentes surfactantes. Los agentes reductores, como el DTT (Dithiothreitol,
aunque tambin se emplean otros reductores alternativos no cargados), completan la
desnaturalizacin proteica por ruptura de puentes disulfuro.
2. Separacin en la 1 dimensin (Isoelectroenfoque); Separacin de la mezcla de protenas segn
sus puntos isoelctricos.
3. Separacin en la 2 dimensin (SDS-PAGE); Las protenas se separan en funcin de su peso
molecular.
4. Revelado; Los mtodos ms usados son la tincin con azul Coomassie -que se fija a las protenas
pero no al gel-, la tincin fluorescente con Sypro Ruby y la tincin con Plata. La tincin de azul
Coomassie clsica puede detectar normalmente bandas de protena de 50 ng, mientras que la tincin
con plata incrementa este lmite de sensibilidad en unas 50 veces.

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Fig. E) Electroforesis bidimensional. Las protenas se separan en un

primer momento mediante enfoque isoelctrico en un gel cilndrico. A
continuacin se extiende el gel horizontalmente sobre un segundo gel, en
forma de plancha, y las protenas se separan mediante electroforesis
SDS-PAGE. La separacin horizontal refleja las diferencias de pI; la
vertical refleja las diferencias en masa molecular.

Aplicaciones:

La aplicacin principal es la protemica de expresin; con esta tcnica se puede comparar de forma
cualitativa y cuantitativa la expresin de protenas de dos muestras. La aparicin y desaparicin de manchas
proporciona informacin sobre la expresin diferencial de protenas, mientras que la intensidad de las
mismas permite conocer sus niveles de expresin. Este mtodo de trabajo, llamado DIGE (Difference gel
electrophoresis), permite la comparacin de tejidos normales con tejidos enfermos; o la de clulas tratadas
con drogas o sometidas a diferentes estmulos. Para esto se procede al marcaje de muestras con
fluorocromos (como por ejemplo Cy3, Cy5, Cy2) antes del IEF, y finalizado el experimento se realiza la
visualizacin en escner confocal y anlisis automtico.

Bibliografa

http://148.206.53.231/tesiuami/UAMI14317.pdf; fecha de visita 20/09/13

http://www.bvs.sld.cu/revistas/uni/vol1_2_00/uni07200.htm?iframe=true&width=95%&height=95%;
fecha de visita 20/09/13
Lehninger, A. (1994) Principles of Biochemistry. 3rd ed.
Voet-Voet Bioqumica Ed. Panamericana 3. Ed.

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