ESTUDIO Y ANÁLISIS

DE LAS PROTEÍNAS
Extracción de
proteínas
Separación de proteínas
Cromatografía en columna

Según la matriz usada puede ser:

• De intercambio iónico (catiónico o aniónico)

• Por filtración en gel (por diferencia de
tamaño molecular)
• De afinidad (mayor selectividad por uso de
ligandos específicos unidos a la matriz)
 Electroforesis

Permite separar y analizar moléculas (proteínas y AN) en función de su diferente

movilidad al aplicar un campo eléctrico, que dependerá de su carga eléctrica.

Electroforesis libre:
• Moléculas en disolución o suspensión.
• Poca resolución.

Electroforesis de zona:
• Soporte que retiene las moléculas.
• Alta resolución.
Equipo electroforético

Electroforesis horizontal

Electroforesis vertical
 pH bajo:
carga neta positiva

pI:
carga neta nula

pH alto:
carga neta
negativa
 Factores que afectan la electroforesis
1. Campo eléctrico
*Diferencia de potencial (V-voltios): bajo voltaje (10-500 V)- alto voltaje (500-10000 V)
*Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica
depende de V y de R (Ley de Ohm V=RxI)
*Resistencia (R): determinada por el soporte y tampón electroforesis
*Temperatura: efecto Joule : El aumento de temperatura generado puede dañar el soporte, el equipo electroforético y
desnaturalizar las proteínas. Requiere uso de refrigerantes.

2. Muestra
*Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la molécula
*Tamaño
*Forma: formas globulares avanzan más

3. Tampón de electroforesis
*pH: determina el grado de solvatación y la carga de las moléculas.
Generalmente es ligeramente básico → moléculas (-)
*Fuerza iónica: generalmente 0.05 o 0.1 M para que no interfiera
4. Soporte
 Soporte electroforético
Características
❑ Gel poroso (entramado tridimensional).
❑ Tiene que permitir el paso de moléculas.
❑ Material inerte: NO puede estar cargado y no debe adsorber las moléculas de la muestra.

Tipos de soporte
❑ No restrictivo (Tipo I): Tamaño poro >>> moléculas, no opone impedimento a su paso
→separación sólo por carga. Ej: papel, agar, almidón, acetato de celulosa.

❑ Restrictivo (Tipo II): Tamaño poro ≈ moléculas, opone resistencia a su paso

→separación por tamaño (tamizado molecular). Ej: acrilamida.
 Electroforesis en acetato de celulosa
Proteinograma
❑ Soporte no restrictivo
❑ Electroforesis horizontal
❑ Aplicación: estudios serológicos (separación de proteínas séricas)

muestra

+ Avance de las proteínas

-
Campo eléctrico (V)

1. Aplicación de la muestra
2. Electroforesis
3. Detección por tinción:
Azul de Coomassie
Negro amido
4. Densitometría / Espectrofotometría
 Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)
❑ Soporte: gel de poliacrilamida
• Polimerización de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida
• Variación de la concentración →variación del tamaño de poro: ↑ [poliacrilamida]↓tamaño poro

❑ Electroforesis vertical

❑ Separación por carga y tamaño molecular

Detección de las proteínas por tinción con
Azul de Coomassie
Electroforesis PAGE-SDS

❑ Separación por tamaño molecular

❑ Usa agentes desnaturalizantes: SDS
(dodecilsulfato sódico)
❑ Aplicaciones:
✓ Separar proteínas
✓ Determinar peso molecular de
una proteína
✓ Separar proteínas oligoméricas
Dodecilsulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulphate, SDS, laurilsulfato sódico)

H-(CH2)12-SO4−
▪ detergente aniónico que se une a las proteínas, desnaturalizándolas en una conformación
extendida recubierta de moléculas de SDS.
▪ el tamaño de la molécula de proteína es directamente proporcional a su longitud en
aminoácidos y su carga queda enmascarada por la mayor carga del SDS que la recubre, que
es también proporcional a la longitud.
▪ la movilidad electroforética de la proteína depende exclusivamente de su masa molecular.
▪ se usa (en el tampón de ruptura o de carga) para desnaturalizar las proteínas de la muestra
antes de aplicar ésta y como componente del gel para mantenerlas desplegadas durante la
electroforesis.
Estimación del peso molecular (PM)
usando electroforesis PAGE-SDS

Se corre una mezcla de diferentes

proteínas de las que se conoce su
PM junto con la proteína incógnita.
Por comparación, se puede estimar
el PM de la proteína desconocida.
 Simulación electroforesis PAGE-SDS

https://biomodel.uah.es/lab/SDS-PAGE/inicio.htm
Enfoque isoeléctrico
El punto isoeléctrico (pI) es el
pH al que una molécula tiene
carga eléctrica neta cero.