PROTOCOLO CORTE CON ENZIMA DE RESTRICCION

La restriccin de plsmidos, tiene dos propsitos uno es diagnstico, el otro es preparativo.

El corte de diagnstico, me permite determinar si el fragmento de DNA que clon esta al
derecho, o al reves.
El corte preparativo, me sirve para extraer el fragmento que clon con el fin de subclonarlo,
utilizarlo como sonda, etc.
Cundo puede ocurrir que el fragmento se clone al revs?
Cuando se clona en un sitio blunt end, o producto del corte con una sola enzima de
restriccin.

Corte diagnstico
a) al derecho
Enzima Y

cabeza cola

Enzima X

P pares de bases O

b) al revs

Enzima X
Enzima Y

cola cabeza

P + n pares de bases

Porque pasa esto, dado que los sitios de restriccin son fijos en cada fragmento, si varia la
orientacin espacial, entonces la distancia se incrementar (como en el dibujo).
En un gel de agarosa entonces podr ver la diferencia entre un tipo de banda y otro.
Segn sea el uso que vaya a darle al fragmento, ser necesario optar por uno u otro.
Si es para secuenciar, no importa la orientacin del fragmento, si es un plsmido de
expresin, o debo extraer la banda para subclonar entonces si importa la orientacin.

Se cortarn ~ 2 ug de plsmido por reaccin.

Elementos:
4 tubos eppendorf rotulados A, B, C y D
Micropipetas 1-20 uL.
Tips
H2O deionizada.
Plsmidos A, B, C y D.
React Buffer segn cada reaccin
Enzima necesarias.

Procedimiento:

En cada tubo rotulado se coloca:

DNA plsmido:csp 1ug.

Buffer React 10X.. 2 uL.
Enzimas ... 1 uL c/u
H20 deionizada csp..20 uL.

Se pone a incubar en bao a 37 C durante 3 h.

Se guarda hasta prxima clase en freezer 20C.