Herramientas moleculares para el

diagnóstico de enfermedades
genéticas

Claudia Ramírez Vielma

Becada Laboratorio Clínico
U. Chile
Conceptos Básicos

● Gen → unidad molecular de la

herencia
● Sitios de splicing
● Proteínas reguladoras del
splicing → potencian o inhiben
el reconocimiento de un exón y
su incorporación en el mRNA
maduro.
Mutaciones
● Variación espontánea o inducida del genoma
● Puntuales → modificaciones en un par de bases
● Regiones mayores → deleciones - inserciones - duplicaciones
● Sitios de corte y empalme
Polimorfismos de nucleótido único (SNP)

● Presencia de formas alélicas

diferentes
● Muy frecuentes
● Variaciones en un solo
nucleótido o par de bases
● Amplia distribución y
estabilidad en el genoma
humano → relacionado a
muchas enfermedades
Microsatélites

● Secuencias cortas de ADN, repetidas en bloque o tándem un número

específico de veces.
● VNTR (9-100 pb) y STR (9 pb)
● La cantidad de repeticiones determinará la variabilidad de alelos
distintos en un mismo locus.
● No se encuentran en todo el genoma → uso en la identificación de
individuos. Exámenes de paternidad y quimerismo
Electroforesis
 Electroforesis en gel

● Migración de moléculas a
través de un gel o matriz
porosa, según su peso
molecular o tamaño;
movimiento generado por un
campo eléctrico.
Electroforesis capilar

● Técnica de separación
● Migración diferencial de
moléculas sujetas a un campo
eléctrico a través de un capilar
<50 µm de diámetro.
● Si-OH → Si-O (elevan el pH)
● Un láser de Ar, excita los
fragmentos a diferentes
longitudes de onda.
● La separación ocurre por carga
y tamaño de los fragmentos.
Métodos diagnósticos
Reacción en cadena de la
Polimerasa (PCR)
PCR

● Dr. Kary Mullis (1986)

● Replicación exponencial in vitro
de una molécula de ADN
● La longitud del producto
amplificado la delimitan los
iniciadores, de cuyo diseño
adecuado depende el éxito de
la PCR.
Esquema de la RCP
Reacción en cadena de la polimerasa con triplete
repetido (TP-PCR)

● Partidores locus específicos marcados con fluorescencia que flanquean

la totalidad de la región repetida
● Partidores pareados que amplifican desde múltiples sitios dentro del
segmento repetido.
● Se mantiene el tamaño del alelo usando parejas de partidores con cola 5
´
● P1 → partidor específico marcado
con fluorescencia
● P3-P4 → tienen una secuencia cola
5´común
● P4 se agota tempranamente en la
reacción de amplificación
● P3 se une preferencialmente al
extremo terminal de los productos
AmplideX® PCR/CE FMR1

● Detecta todos los alelos, incluyendo mutaciones completas de baja

cantidad
● Calcula el tamaño de cada repetición hasta las 200 CGG
● Resuelve la cigosidad femenina
● Detecta la presencia de interrupciones AGG
Amplificación de sondas
dependiente de ligación
múltiple (MLPA)
MLPA

● Se amplifican las sondas que se hibridan a las secuencias objetivo.

● Análisis mediante electroforesis capilar
● Se comparan los patrones obtenidos con una muestra de referencia
● MS-MLPA → cuantificación de copias y perfil de metilación
Amplificación de sondas dependiente de ligación múltiple
con metilación específica (MS-MLPA)

● Método semicuantitativo para determinar alteraciones epigenéticas

como el perfil de metilación
● La detección del número de copias se combina con el uso de enzimas de
restricción sensibles a la metilación
● Uso en enfermedades de impronta genómica como Prader
Willi/Angelman o síndrome de Beckwith Wiedemann/RSS
Técnicas de hibridación
Southern blot

● Edwin Southern (1975)

● Estrategia estándar para analizar ADN previamente digerido con
enzimas de restricción.
● Identifica secuencias específicas, separándolas por tamaño mediante
electroforesis en gel y localizándolas por hibridación de sondas
específicas marcadas.
HGC con matrices + Polimorfismos de nucleótido
único (aCGH + SNP)

● Hibridación con una micromatriz multigénica que contiene aprox.

100.000 o más oligonucleótidos dispuestos en cadenas cortas y únicas,
correspondiente a secuencias diferentes y específicas.
● Detecta variaciones en el número de copias (CNV)
● Evaluación de discapacidad intelectual, anomalías congénitas múltiples y
trastornos neuropsiquiátricos.
● Pérdida de heterocigosidad (LOH), disomía uniparental (UDP),
consanguinidad
Secuenciación
Método de Sanger

● Emplea análogos de dNTP específicos de terminación de

cadena.
● Los más utilizados son los didesoxinucleótidos trifosfatados
(ddNTP), iguales que los dNTP pero sin el grupo OH en el
carbono 3’ de la desoxirribosa.
● Se incorporan a una cadena de ADN en crecimiento, pero
actúan como terminadores porque, no permiten que se una otro
nucleótido.
Procedimiento

● Polimerasa dependiente de ADN de alta fidelidad

● ADN de una sola hebra
● Partidor complementario a la plantilla
● Desoxinucleótidos
● Mezcla de cuatro di-desoxinucleótidos, marcados con fluoróforo único
● Copias de fragmentos de ADN de diferente longitud se someten a
electroforesis.
● La secuencia de ADN se lee a través de la emisión fluorescente del di-
desoxinucleótido a medida que fluye a través del gel o capilar.
Secuenciación de la próxima generación (NGS)

● Método de secuenciación donde millones de reacciones se llevan a

cabo en paralelo, aumentando el rendimiento de la secuenciación.
● Requiere una genoteca con secuencias adaptadoras personalizadas.
Estas secuencias proporcionan un sitio de cebado universal.
● Cada fragmento de la
biblioteca se amplifica y se
crean grupos de ADN, que se
originan a partir de un único
fragmento de la genoteca
● La secuencia de cada grupo se
lee ópticamente a partir de
ciclos repetidos de
incorporación de nucleótidos.
● Utilizada por las plataformas
Illumina NGS.
● Incorporación de un solo
nucleótido terminador por
ciclo unido de manera
reversible a un fluoróforo
único que se va repitiendo
hasta completar la
secuenciación de ADN.
● La señal fluorescente se lee en
cada grupo y se registra.
● La reacción de secuenciación
se controla a través de la
liberación del pirofosfato
durante la incorporación de
nucleótidos.
● La liberación de pirofosfato
genera una serie de reacciones
químicas que resultan en la
generación de luz detectada
por una cámara que registra la
secuencia apropiada del grupo.
● Este ciclo continúa hasta
completar la reacción de
secuenciación.
● No utiliza una ADN polimerasa para incorporar
nucleótidos, se basa en sondas de
oligonucleótidos cortas que se ligan entre sí.
● La reacción comienza con la unión del cebador a
la secuencia adaptadora y luego la hibridación de
la sonda apropiada que se liga al partidor a través
de una ADN ligasa.
● La señal se detecta y se registra y luego comienza
el siguiente ciclo. Después de 7 ciclos de ligadura,
se usa otro cebador de secuenciación, en total se
usan 5 cebadores de secuenciación
Referencias

● Nussbaum R.L, McInnes R.R, Willard H.F. Thompson & Thompson

Genética en Medicina. Editorial Elsevier Masson, 7° Edición.
● Salazar A, Sandoval A, Armendáriz J. Biología Molecular. Fundamentos y
aplicaciones en las ciencias de la salud. Editorial McGraw-Hill, 1°
Edición, 2013
● Claverie F, Ramos E, González F.J. Técnicas para el diagnóstico molecular
de enfermedades hereditarias. Bol Pediatr 2008; 48: 235-241
● Huston S, Katsanis N. Molecular genetic testing and the future of
clinical genomics. Nat Rev Genet. 2013 June ; 14(6): 415–426.