ADN recombinante

Miguel Ángel Carrillo Hernández

Matemáticas aplicadas a la biotecnología
Endonucleasas de restricción
• Son enzimas que reconocen una secuencia de ADN especifica (sitio de
reacción) y cortan en justo en ese sitio o por un lado.
• Por ejemplo la endonucleasa EcoR1

Los sitios reconocidos específicamente por enzimas varían en

tamaño 4 a 13 pb (5 prima a tres primas y viceversa)
• Actividad de enzima de restricción = unidades (1 µg de ADN λ)
Problema:
Un stock de ADN genómico humano está a una concentración de 275 µg /mL. Se desea cortar 5 µg con 10
unidades de la endonucleasa de restricción Hind III. La enzima Hind III está a una concentración de 2.500
unidades/mL. ¿Qué volúmenes de ADN y enzima deberían ser utilizados?

• Digestión por restricción (20 a 100 µL).

• ADN humano y enzima se representan en mL

Por lo tanto: 18.2 µL de ADN

humano contiene 5 µg de ADN
Por lo tanto: 10 unidades= 4 μL de enzima
 Frecuencias de corte en DNA
• Depende de la composición de bases y su tamaño
• Por ejemplo en mamíferos GC es poco frecuente, por lo tanto NruI (TCGCGA) corta el AND con menor
frecuencia que en bacterias.
• 4 PB es mas frecuente que 6 pares de bases
• El tamaño medio de un fragmento de restricción a partir de una secuencia de DNA aleatoria puede ser
estimado.

• Problema:
• La endonucleasa de restricción Hind III reconoce la secuencia AAGCTT (6). Si un ADN genómico de secuencia
aleatoria es digerido con Hind III, ¿cuál será el tamaño medio de los fragmentos producidos?

• Solución:
• La probabilidad de que A C G o T aparezca en una secuencia de ADN es 1 en 4.
• El numero de sitios de restricción en el ADN puede ser estimado como ¼ a la n (n=número de pares de bases de la
secuencia de reconocimiento. Por ejemplo 6 (Hind III).

Por lo tanto en la secuencia de ADN

aleatoria para Hind III, cada 4.096
pb cortara.
Calculo de cantidad de extremos de fragmento
• Es importante conocer la cantidad de fragmentos y extremos generados de ADN para ciertas
aplicaciones, como el marcaje con isotopos radioactivos.

Problema:
• Se tiene 4 μg de un fragmento de 3400 pb, ¿Cuántos picomoles del extremo del fragmento
representa?

Por lo tanto, 4 μg en un fragmento de 3400 pb

posee 3,6 pmol de extremos
Ligación del ADN
• Una vez que se tiene el fragmento a clonar (diana o inserto), este puede ser unido por una ADN
ligasa
Dos factores:
1. Compatibilidad de los extremos en el fragmento
(sitios de restricción).
2. Cantidad de circularización.

Entre extremos 5'-fosfato

y 3'-hidroxil

Formar enlace
fosfodiéster
 Eficiencia de transformación
• Tras la ligación del ADN al plásmido viene el proceso de transformación, que es la incorporación del
fragmento recombinante al DNA de la célula huésped

Por ejemplo: Si 10 nanogramos (0.01 μg) de plásmido se

utilizaron para transformar 1 ml de células, y se sembraron
0.1 ml de la mezcla obteniéndose 100 colonias

Se puede la eficiencia de transformación: la

capacidad de las células de absorber ADN ajeno y
expresar sus genes
Bibliotecas genómicas
• Son formas de almacenar información genética por medio de bacterias huésped que contengan genoma exógeno.
• Se guarda mediante vectores de clonación; ¿Cuántos clones se necesitan?, depende de dos factores: 1) tamaño medio de
los insertos clonados y 2) tamaño del genoma a clonar

N= numero de clones independientes Para estimar la probabilidad de

I = tamaño del inserto clonado (pn) encontrar un clon en particular
G = tamaño del genoma diana dentro de un librería aleatoria.

Problema: supongamos que deseamos preparar una biblioteca de genoma humano como vector al fago lambda el genoma
humano tiene 3,0 X 109 pb; si el tamaño de los insertos clonados en el vector es de 17 pb, y queremos tener una probabilidad
del 99% (P= 0,99) de que cualquier gen humano este representado al menos una copia, precisaremos una biblioteca de:
Medición de fragmentos de ADN por electroforesis en gel
• Una vez identificado el clon recombinante por expresión de una proteína de interés o
cualquier otra técnica, este debe ser caracterizado.
• Una de las maneras mas sencillas de hacerlo es mediante su tamaño, esto se hace mediante
electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida.

Tamaños de fragmento de ANDc insertados en

el vector plasmídico