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2013
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ESTERILIZACIN
1) Qu consideraciones debe tener en cuenta para cargar el autoclave con material a esterilizar?
2) Qu mtodo utilizara para esterilizar cada uno de los siguientes materiales y soluciones?
Placas de Petri descartables, material de ciruga, ropa de cama hospitalaria, solucin fisiolgica,
suero fetal bovino, vitaminas, antibiticos, etanol, glicerol.
b) Una vez solucionado el inconveniente, Cmo determinara si dicho medio est efectivamente
estril?.
a) Indique que mtodo de esterilizacin y/o desinfeccin de los que se dispone en su laboratorio
utilizara para cada uno de los materiales mencionados.
DIVERSIDAD MICROBIOLGICA
1) Qu tipos de bacterias se encuentran asociadas con las zonas de color prpura y verde de la
columna de Winogradsky?
5) a) Indique que funcin cumplen cada uno de los elementos agregados en la columna de
Winogradsky.
TINCIONES
3) Cmo espera observar las bacterias luego de la tincin de Gram si se olvida de realizar el
paso de decoloracin ?.
6) Qu caractersticas debe tener un colorante para ser empleado en una tincin negativa?.
8) Bacillus subtilis presenta color violeta al microscopio ptico luego de una tincin de Gram
y color rosado al efectuarse una coloracin de esporas. Por qu motivo el cristal violeta en
el primer caso y la safranina en el segundo tien la bacteria de esa manera ?.
9) Indique cual o cuales de las tinciones realizadas en los trabajos prcticos ponen en
evidencia diferencias estructurales de la pared bacteriana. Explique brevemente.
10) Diga si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas y justifique su respuesta.
a) En una tincin negativa los colorantes utilizados tienen afinidad slo por la pared
bacteriana.
c) Las clulas Gram negativas no se tien con cristal violeta porque el mordiente no puede
atravesar la pared de peptidoglicano.
11) Se dispone de un kit de Gram y un frasco de verde de malaquita. Con estos colorantes podra
realizar una tincin para determinar la ubicacin de las esporas en una especie de Bacillus que
se quiere identificar?. Explique.
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
1) Qu tipo de medio es el agar Mossel?. Para qu sirven cada uno de sus constituyentes?.
Podra reemplazar el manitol por otro azucar y el rojo fenol por rojo neutro?.
2) Disee un medio que le permita diferenciar microorganismos Gram negativos que degradan la
maltosa con produccin de cido de los que no lo hacen.
b- Un enriquecimiento selectivo se realiza en medio lquido pues hay libre competencia por los
nutrientes.
a) Cualquiera de los siguientes medios podra ser utilizado para diferenciar aquellos
microorganismos capaces de fermentar la lactosa:
b) Especies del gnero Bacillus pueden ser aisladas en placas de agar EMB.
PRUEBAS BIOQUIMICAS
b) De qu otra forma podra determinar la capacidad de utilizar la lactosa por parte de los
cinco microorganismos ?.
a) El color rojo de las colonias en agar McConkey se debe a los productos cidos generados
por la fermentacin de la lactosa.
resultados:
.- Colonias transparentes.
.- Colonias con centro pardo-grisceo sin brillo metlico.
.- Colonias con brillo verde metlico.
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a) Sobre la base del aspecto macroscpico de las colonias qu componentes del medio de
cultivo utilizan los microorganismos para su crecimiento?. Explique.
b) En caso de que posean un metabolismo fermentativo, podra inferir que tipo de fermentacin
realizan y a qu colonias corresponden los microorganismos con esas caractersticas?. Explique.
c) Qu pruebas bioqumicas empleara para verificar el tipo de fermentacin, qu colonias
utilizara y cul sera el resultado de dichas pruebas en cada caso?.
d) Qu caractersticas deberan tener los microorganismos aislados para poder ser identificados
empleando un test multiprueba API 20 E.
1) Las enzimas responsables de las hidrlisis de los sustratos ensayados en el TP 7 son exo o
endocelulares? Justifique
2) Puede el mtodo ensayado dar resultados cuantitativos? Qu debe tener en cuenta?
3) Puede Ud sugerir un ensayo para evaluar la hidrlisis de gelatina como sustrato proteico en
placa
4) Qu otras actividades enzimticas podra ensayar en placa como mtodo de rastreo?
ANTIBIOTICOS
3) Disee un protocolo experimental para comprobar que una bacteria A libera al medio un
compuesto con actividad antibitica. Cmo determinara si dicho compuesto es bactericida
o bacteriosttico ?.
7) En un antibiograma, una cepa de E. coli presenta un halo de inhibicin 3 veces mayor para
el antibitico A que para el antibitico B. Qu conclusin se puede extraer de esta prueba ?.
Justifique.
8) Se dispone de tres sustancias obtenidas por sntesis qumica con presunta actividad
antimicrobiana para bacterias gram negativas.
b) Qu resultados esperara obtener al comprobar la CIM de las bacterias que forman estas
colonias en relacin a las que crecen por fuera del halo de inhibicin? Cmo la calculara?
10) Debido al recorte presupuestario, la Ctedra de Microbiologa no pudo comprar las tiras
de E-Test Penicilina para la determinacin de la CIM (concentracin inhibitoria mnima).
Qu metodologa alternativa podra emplear para calcularla?. Explique detalladamente el
mtodo por Ud. propuesto. Nota: Se dispone de todo el material de laboratorio necesario.
11) Un antibitico A que acta por unin reversible a la subunidad menor del ribosoma
bacteriano se modifica qumicamente obtenindose una serie de compuestos distintos: B, C y
D.
Al realizar una prueba de sensibilidad en agar para un determinado microorganismo se
obtuvieron los siguientes dimetros (d en mm) en los halos de inhibicin: dA 25, dB 6, dC 30
y dD 6.
a) Qu conclusiones se pueden obtener a partir de estos resultados?. Justifique.
b) Cmo comprobara que C tiene ms actividad que A?. Explique brevemente.
Al determinar el mecanismo de accin de C se obtuvieron las siguientes curvas de DO600 nm (--
-) y log UFC/ml () en funcin del tiempo:
FAGOS
1) Cul es el ttulo de un stock de fagos a partir del cual se cuentan 38 placas de lisis en la
dilucin 10-5 ?. Volumen de inculo 0,1 ml.
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2) Si un lisado de ttulo 5 x 108 UFP/ml se utiliz para infectar a una moi = 20 Qu cantidad
de bacterias fueron necesarias para la infeccin ?.
b) Qu diluciones hara a partir del cultivo original para obtener 35 placas de lisis en una
placa de Petri ?.
4) Se preparan dos lisados del fago virulento P1. Del primero se obtienen 20 ml que se titulan
en placa con un recuento de 50 playas de lisis en la dilucin 10-6. Del segundo se obtienen 2.5
ml que se diluyen al medio con solucin fisiolgica y se titula en placa con un recuento de
200 playas de lisis en la dilucin 10-6. Cul de los dos lisados tiene mayor nmero de UFP
totales? (Volumen de inculo = 0,1 ml).
Si es necesario infectar a una m.i. = 5 Qu cantidad de bacterias utilizara para cada uno de
los lisados?. (Considere volumen de inculo = 0,1 ml para fagos y bacterias).
Protocolo: Volumen de cultivo bacteriano infectado: 10 ml. Inculo del viejo stock: 0.1 ml de
una dilucin 10 1. Tiempo de incubacin a 37 C: 5 horas. El lisado obtenido es centrifugado
y filtrado.
a) Qu rango de 3 diluciones debera plaquear para poder verificar que el ttulo aumento un
orden?.
6) Se dispone de un stock de fagos con un ttulo de 106 UFP/ml. Se desea preparar un nuevo
stock de mayor ttulo teniendo en cuenta que cada bacteria sensible produce 300 fagos. Para
ello se cuenta con un cultivo de bacterias en fase exponencial con 5x109 bacterias/ml. La
preparacin de dicho stock se realiza mezclando 1 ml del stock original con 1 ml de la
dilucin del cultivo bacteriano que garantice un fago por bacteria ( mi = multiplicidad de
infeccin = 1).
a) Qu diluciones tendra que realizar para obtener una mi = 1 ?. Indique los volmenes.
b) Qu diluciones del nuevo stock de fagos hara para determinar el ttulo viral ?. Indique
los volmenes.
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RECUENTO DE BACTERIAS
2) Partiendo de un cultivo bacteriano que tiene 4 x 108 UFC/ml : Cmo procedera para obtener
80 colonias en una placa de agar nutritivo ?. Indique los volmenes a utilizar.
3) Qu dilucin debera realizar para obtener 2 ml de una suspensin de bacterias que contenga
2 x 105 UFC totales, si parte de un cultivo que contiene 2 x 109 UFC/ml ?.
4) Un cultivo bacteriano se diluye 1/4. A partir de esa dilucin se realizan diluciones seriadas al
dcimo. Se siembra 0,1 ml de cada dilucin en placas de agar nutritivo por triplicado
obtenindose los siguientes resultados:
Nmero de colonias
Dilucin
Placa 1 Placa 2 Placa
3
10-4 621 546 356
10-5 64 56 68
10-6 5 9 4
Qu dilucin elegira para calcular las UFC del cultivo original ?. Justifique su eleccin.
6) Un fabricante de yogurt afirma que sus productos contienen 4 x 106 bacterias lcticas viables
/ ml.
8). Para un cultivo exponencial de Escherichia coli se realiza una curva de calibracin de
recuento en placa vs. turbidez (D.O. leda a 600 nm). A partir de la misma se establece una
relacin UFC./ml por unidad de D.O. de 4. 107
b) Que diluciones debera realizar para contar 100 colonias en una placa de agar nutritivo
sembrada con 0,1 ml de un nuevo cultivo de E. coli con una D.O. de 0.5.
10) Un cultivo de Klebsiella pneumoniae en fase exponencial tiene una DO = 0,2 medida a 600
nm. Al realizar un recuento en placa se contaron 40 colonias al sembrar 0,2 ml de la dilucin 4
del cultivo original.
a) Calcular las UFC/ml
b) Calcular las UFC totales si el volumen del cultivo original es de 3 ml.
c) Qu diluciones debera realizar a partir del mismo cultivo de Klebsiella pneumoniae cuando
alcanza una DO = 0,5 para contar en una placa 100 colonias.
d) En un cultivo exponencial de Baccillus megaterium que tiene una DO = 0,5 esperara obtener
ms o menos UFC/ml que en el cultivo de Klebsiella pneumoniae que tiene igual DO?. Por
qu?.
11) En un laboratorio un tcnico realiza el anlisis de una muestra de agua debiendo informar el N
ms probable (NMP) de coliformes totales/100 ml. Para ello el tcnico us el mtodo de Wilson
empleando el caldo McConkey como indicador de coliformes:
Diluciones de la muestra TC -1 -2 -3 -4
Tubos sembrados 3 3 2 2 2
Volumen sembrado (ml.) 1 1 1 1 1
Positivos en McConkey 37C 3 3 2 0 0
12) Con el objeto de investigar una eventual contaminacin de las aguas de un afluente del
Riachuelo, se tom una muestra y se procedi a analizarla empleando el caldo Brila Fluorocult. El
protocolo y los resultados fueron los siguientes:
13) Se realiza un recuento de Pseudomonas a partir de una muestra de agua de pozo empleando
caldo M9 glicerol/asparragina, obtenindose los siguientes resultados:
3 1 10-6 1
3 0,01 10-4 1
INMUNOLOGA
1) Indique:
b) Cmo procedera para cuantificar un antgeno bacteriano soluble utilizando una tcnica
inmunolgica?
Nota: Ud. dispone de: antisuero anti humano total, antisuero monoespecfico anti albmina
humana, albmina humana purificada de origen comercial de concentracin conocida, agar,
solucin fisiolgica, material de vidrio y micropipetas.
Cmo determinara cul de los dos animales alcanzo el ttulo ms elevado de anticuerpos anti
Salmonella newport? Describa brevemente la tcnica empleada y cmo expresara los
resultados.
a) Sabiendo que all se trabaja con 2 especies de dicha bacteria : Salmonella schottmulleri y
Salmonella typhi, Podra Ud. determinar que especie de Salmonella se emple para obtener
cada antisuero ?. Qu tcnica empleara ?. Expliquela brevemente. Describa los resultados
que le permitiran identificar ambos antisueros.
PROBLEMA 1
Se desea estudiar la efectividad de un mtodo de irradiacin para esterilizar arroz. Para ello se
dispone de tres muestras de arroz esterilizadas en autoclave (5 g/ 8,5 ml), de 10 ml de un cultivo de
E. coli con un recuento de 50 UFC cuando se plaquean 0,1 ml de la dilucin 10-6 y de 5 ml de una
suspensin de esporas de B. cereus de 4x107 esporas/ml. Cada una de las muestras de arroz
esterilizadas se inocul con 1 ml del cultivo de E. coli y con 0,5 ml de la suspensin de esporas y se
someti a una dosis diferente de radiacin. Al cabo de los respectivos tratamientos se cuantific en
cada muestra el nmero de UFC totales de E. coli y de B. cereus sobrevivientes obtenindose los
siguientes resultados:
Tratamiento 1 2 3
E. coli 2,5x104 ND ND
B. cereus 2,5x104 2x102 ND
ND= no detectable.
a) Discuta sobre la efectividad de cada uno de los tratamientos como mtodo de esterilizacin.
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b) Cul es la carga bacteriana total con que se inocul cada muestra antes de someterlas a la
radiacin?.
c) Describa el protocolo para hacer los recuentos de los sobrevivientes justificando los pasos que
realizara. Indique volmenes, diluciones, medios de cultivo empleados con la funcin de sus
constituyentes.
d) Ud. dispone de una cuarta muestra de arroz esterilizada en el autoclave simultneamente con las
otras tres muestras. Qu tipo de control le realizara previamente a dicha muestra para garantizar
que los sobrevivientes de las otras muestras provienen de la inoculacin artificial?
PROBLEMA 2
PROBLEMA 3
A partir de una muestra de agua del lago de Palermo se prepar una dilucin 10-2 y se sembr por
rastrillado 0,1 ml de dicha dilucin en tres placas con los siguientes medios:
b) Describa todos los tipos de morfologa de colonias que podran encontrarse en la placa con agar
Mac Conkey explicando a qu se deben las diferencias.