- Buscar reglamentación del alimento en el código alimentario argentino o en el

CODEX internacional.
- Buscar información en Papers en caso de no estar reglamentado -
- Realizar recuento de: -Hongos y levaduras (Sabourand) inoculación en superficie.
-Aerobios Mesófilos totales (PCA) inoculación en profundidad.
(se incuba a 37°C durante 24hs)
- recuento Coliformes totales (EMB) inoculación en superficie.
- colonias sospechosas (EMB) inoculación en superficie

# Agar Sabourand: contiene peptona especial, D-glucosa, Agar-Agar.

# UFC: Unidad formadora de Colonias (debe ser 30-300)
#Esterilización: destrucción de todo tipo de organismo

mecanismo de acción contra mo:

-membrana citoplasmática y pared celular (hipoclorito e detergentes)
- proteínas y enzimas (calor)
- núcleo (radiación)

Métodos físicos de esterilización

Temperatura
-calor húmedo: autoclave(vapor y presión de agua) y Tindalización(56°C- 100°C, óptimo:
65°C)
- calor seco : estufa de esterilización y mechero de Bunsen
para que la esterilización sea efectiva depende del tiempo de exposición de la naturaleza
del calor y de la sensibilidad del mo.

Radiación
afectan el ADN del microorganismo. rayos X, rayos Gamma, UV.

TP 2 Medios de cultivos

# Medio de cultivos: mezcla equilibrada de nutrientes en concentraciones óptimas y en

condiciones físicas óptimas contiene base mineral(electrolitos como Na), fuentes de
carbono y azufre.

Clasificación de los medios según la finalidad

- Medio común: tiene todos los nutrientes básicos ( es para recuento, calidad, examen
bacteriológico) , crece todo tipo de microorganismo porque tiene todos los nutrientes
básicos (ejemplo PCA)
- Medio enriquecido: tiene nutrientes en exceso (sirve para mo con grandes
exigencias nutricionales)
- Medio selectivo : sólo permite que se desarrolle un grupo de mo el inhibe el
crecimiento de otro (es para seleccionar y aislar) (EMB, citrato de Simmons)
- Medio diferencial : es para revelar características fisiológicas. (EMB y citrato de
Simmons)
-
Preparación de los medios de cultivos
La preparación de medios de cultivo es un proceso clave en microbiología y
consiste en la creación de un ambiente nutritivo adecuado para el
crecimiento de microorganismos en el laboratorio. A continuación, te
proporcionaré una descripción general de los pasos involucrados en la
preparación de medios de cultivo:

1. Selección del medio de cultivo: Primero, debes seleccionar el medio de

cultivo adecuado según el tipo de microorganismo que deseas cultivar y los
objetivos del estudio. Puede ser un medio sólido (con agar) o líquido.

2. Medición y mezcla de ingredientes: A continuación, debes medir y mezclar

los ingredientes del medio de cultivo. Estos ingredientes pueden incluir
nutrientes como extractos de carne, extractos de levadura, peptona,
azúcares, sales y otros aditivos. La cantidad y la proporción de los
ingredientes deben seguir la receta específica del medio.

3. Desinfección y autoclavado: Una vez que los ingredientes están

mezclados, debes esterilizar el medio de cultivo para eliminar cualquier
contaminación microbiana. Esto se logra mediante la aplicación de calor en
un autoclave, que es un equipo que utiliza vapor de alta presión para
alcanzar temperaturas elevadas y eliminar los microorganismos presentes.

4. Ajuste del pH: Después del autoclavado, el medio de cultivo puede estar
ácido o alcalino, por lo que debes ajustar su pH a un valor específico
utilizando ácidos o bases, generalmente utilizando un pHmetro para medir y
ajustar con precisión.

5. Dispensación y esterilización final: Una vez que el pH es adecuado, el

medio de cultivo esterilizado se puede dispensar en recipientes estériles,
como placas de Petri, tubos de ensayo o frascos. Luego, se procede a la
esterilización final, generalmente utilizando calor o radiación, para asegurar
que el medio esté completamente libre de contaminantes.

Es importante seguir prácticas de esterilización y seguridad adecuadas

durante todo el proceso de preparación de medios de cultivo para evitar la
contaminación y obtener resultados confiables. Además, es recomendable
mantener registros precisos de los componentes utilizados y las condiciones
de preparación para garantizar la reproducibilidad de los experimentos y la
trazabilidad de los resultados.

Medios de cultivos para bacterias

Inoculación
EMB y PCA
 Pruebas bioquímicas
SIM (sulfuro de hidrógeno, Indol, Movilidad), Citrato de Simmons, RM(ácido)
y VP(neutro).

Medios de cultivos para Hongos

PDA (papa, dextrosa, agar), Sabouraud, Czapek.

#la dilución madre echa en la botella de Gatorade es 1 en 10

#El medio de cultivo de peptona es indefinido, pero al agregarle ClNa y algun

otro agregado es un medio selectivo.

TP 3 Inoculaciones microbianas

Los medios de cultivos y las herramientas deben estar estériles

Los medios de cultivo deben estar fundidos en baño termostatizado(45°C-
50°C).

Tecnicas de Inoculación

-Inoculación en medio líquido (tubo invertido, RM y VP)

- Inoculación en Pico de flauta por estría (citrato de Simmons).
-Inoculación por picadura (SIM).
- Placa de Petri por estrías (escherichia Coli)
- Placa de Petri con pipeta en superficie (Sabouraud).
-Placa de Petri con pipeta en profundidad (PCA).
-Repique por agotamiento (separar células individuales)(axénicos).

Recuento total de microorganismos

Se contabilizan las unidades formadoras de colonias y se tienen en cuenta las disoluciones
para realizar los cálculos pertinentes.

Aislamiento
se realizó el aislamiento en EMB(microlitros)

Repique por aislamiento

lo hicieron los profes en placa de petri y luego se aísla en pico de flauta.

TP 4 identificación de bacterias
-Observación Macroscópica. (se ven colonias por tamaño, opacidad, coloración,bordes,
elevación)

-Observación microscópica (se ve la morfología, esporulación, movilidad)(se realizan

coloraciones, prueba de Gram)
-Pruebas bioquímicas (se determinan las vías metabólicas, sustratos consumidos y
productos liberados)
-Biología molecular (pruebas de ADN).

Observación MIcroscópica
1. Se coloca el frotis sobre un portaobjetos limpio y seco.
2. Se cubre el frotis con cristal violeta durante 1 minuto.
3. Se lava con agua destilada para retirar el exceso de cristal violeta.
4. Se cubre el frotis con lugol(mordiente) (solución yodada) durante 1 minuto.
5. Se lava con agua destilada para retirar el exceso de lugol.
6. Se decolora con alcohol-acetona (etanol al 95% y acetona al 5%) durante unos segundos
(10 segundos)hasta que no salga más colorante.
7. Se lava con agua destilada para retirar el exceso de alcohol-acetona.
8. Se cubre el frotis con safranina o fucsina durante 1 minuto.
9. Se lava con agua destilada para retirar el exceso de safranina.
10. Finalmente, se deja secar al aire antes de observar al microscopio (100x)

Las bacterias Gram-positivas aparecerán teñidas de violeta oscuro o negro, mientras que
las bacterias Gram-negativas aparecerán teñidas de rosa o rojo claro.

Pruebas bioquímicas
- Prueba de movilidad(SIM) es positiva si se ve turbidez difusa desde la siembra.
- Inoculación Indol(SIM) es producto de la degradación de triptófano(aminoácido)
el Indol se visualiza con el reactivo de Kovacs (color fucsia vivo si es positiva)(si es
negativo no cambia de color)
- Prueba de sulfuro de hidrógeno ( es positiva si se negrese por formación de sulfuro
de hierro)(los iones de hierro están presentes en el medio).
- Prueba de rojo de metilo (indicador de pH) (es positiva si es rojo por detección de
ácido). Si es negativo el color es anaranjado.
- Prueba de VP (es positivo si es un rojo intenso a los 15 minutos) el indicador es la
producción de acetoína. Si se espera para leerlo más de una hora puede dar falso
positivo. Se agrega KOH y alfa naftol como indicador.
- Prueba de citrato (es positivo se desarrolla color azul o hay desarrollo visible de
colonias) Se forman productos alcalinos que permiten el cambio de color. El citrato
es la única fuente de carbono.

TP 5 Hongos y levaduras
Observación macroscópica de las colonias
analisis directo o con lupa de color, textura carateristica de la hifas presencia o ausencia de
septos
Observación microscópica de las colonias
característica de la hifas presencia o ausencia de septos, características de las esporas.
Usar lentes de (10x, 20x, 40x, 50x)
Se colorea para poder distinguir. Se colorea con safranina, azul de metileno, azul de
lactofenol, fucsina básica.

Preparación de microcultivos
Se utiliza para hongos con esporas frágiles.
se inocula directamente sobre el agar en el portaobjetos.